一种建鲤反转录转座子及转基因载体的构建方法和用途

摘要

本发明公开了一种建鲤反转录转座子及转基因载体的构建方法和用途，所述转座子包含SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列；一种人工设计合成的核苷酸序列，如SEQ？ID？NO.2所示；一种基因载体，所述的基因载体包含所述的建鲤反转录转座子和/？或所述人工设计合成的核苷酸序列SEQ？ID？NO.2。所述的建鲤反转录转座子和基因载体在介导DNA导入细胞中的应用。本发明通过在建鲤肝细胞中进行转座活性验证，证实上述转座子具备转座活性，所述的基因转移系统能在建鲤肝细胞中进行高效转座，因而本发明为进一步验证转座子的转座效率以及采用该转座子在脊椎动物中进行相关研究及应用奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种建鲤ty3-gypsy反转录转座子JRE及其 用途。

背景技术

DNA转座子(transposon)是一类能在真核生物染色体上不断移动位置的功能 性DNA片段,对发现新基因和分析基因功能具有重要的作用,被认为是导致真核生物遗传 变异的主要原因之一。转座子作为插入突变原或分子标签已被广泛用于基因的分离和克 隆,一些甚至可作为转化载体用于转基因动植物的制备。piggyBac转座子在果蝇 (Bactroceratryoni,)^[4]、家蚕(Bombyxmori)等昆虫中,能作为一个高效、稳健的载体 进行转基因研究,并促进生殖种系转化。家禽上也有报道利用mariner转座元件可实现转 基因鸡的制备。而在秀丽线虫(Caenorhabditiselegans)中发现的Tc3转座元件则已经成 功转化斑马鱼(Daniorerio)。根据转座方式的不同,转座子可分为DNA转座子和反转录转 座子(retrotransposon)。其中,反转录转座子是指以RNA为中介,反转录成DNA后进行转 座的可动元件,亦被称为返座元(retroposon)。近几年的研究表明返座元是真核生物中最 重要的一类转座元元件,也是目前所知高等植物中数量最大的一类可活动遗传成分。按照 序列结构中是否含有长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR)又可分为LTR反转录 转座子和无LTR反转录转座子。

LTR反转录转座子主要由2个开放阅读框(openreadingframes,ORFs)构成,即 核心蛋白基因(gag)和酶基因区域(pol)。gag蛋白编码类似于RNA病毒颗粒反转录相关的蛋 白,pol基因编码逆转录过程中的主要蛋白,包括蛋白酶(PR)、反转录酶(RT)、RNaseH和 整合酶(INT)。RT和RNaseH是反转子复制、转座的关键酶,INT主要作用是使反转录转座子 插入到染色体中的新位点。由于pol基因同源性及INT蛋白的排列位置,LTR反转录转座子 又分为ty3-gypsy和ty1-copia两大类。LTR逆转录转座子采用的是“拷贝–复制”的机制,在 宿主基因中不断扩增;由于返座元带有增强子、启动子等调控元件,最终会参与到宿主基 因的表达及新基因的产生等过程。目前在多种水生生物基因组中已经鉴定出一些LTR反转 录转座子,如斑马鱼、金鱼（Carassiusauratus）、团头鲂（Megalobramaamblycephala） 等,但在建鲤中并没有LTR转座子的报道。反转录转座子的这种插入导致产生变导的功能 在鱼类重要性状相关基因的筛选、重要基因的功能研究以及转基因动物等方面有着重要的 研究和运用前景。例如,Tol2转座系统已经用于多种动物的转基因研究,成功获得突变 体,如果蝇(Drosophilamelanogaster)、斑马鱼、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、鸡(Gallus gallus)、小鼠(Musmusculus)等模式生物。

反转录转座子作为一种新型高效的转基因工具，正在被广泛地研究与应用于转基 因育种、生物反应器、害虫防治、基因功能研究等方面，具有广阔的前景。例如，通过转座子 在体外构建编码人们期望的有疾病抗性或改变生物体生长速度基因的载体质粒，将其导入 受精卵，使之在染色体上正确整合，在组织细胞中适当表达，培养出具有期望性状表型的转 基因新品系，从而在较短时期内培育出常规方法不能或需要长期培育才能育成的品种；借 助一个高效的转座载体，将外源基因导入生物内，使其稳定表达并遗传，有助于人们对目的 生物进行更加深入的研究，为体细胞遗传学的研究和基因表达提供了一个高效、便捷的新 系统，进而能改良经济生物的生产性能。而现今面临着转基因的稳定性、安全性等问题，只 有通过今后进一步深入研究转座子系统及转座机制和宿主因子对其转化效率的影响，才能 更好地推广转基因技术的发展。转座子技术作为基因功能分子的重要工具，特别是对于功 能基因组学研究来说，不仅要确定序列的编码区和非编码区，还要鉴定其相关的生物功能。 总之，发现更多的转座子及探明其结构机理，对于基因功能研究、育种等具有十分重要的意 义。

发明内容

本发明的目的是提供一种建鲤反转录转座子及转基因载体的构建方法和用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种建鲤反转录转座子，其核苷酸序列含有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。

一种分离的核苷酸序列，所述的核苷酸序列含有SEQIDNO.2的核苷酸序列。

一种基因载体，所述的基因载体包含：SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的核苷 酸序列。

作为本发明的一种实施方式，所述的基因载体是以建鲤反转录转座子为基本载 体，作为本发明的另一种实施方式，所述的基因载体是以建鲤反转录转座子JRE为基本载 体，在JRE1237位点处插入SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。

一种基因转移系统，包含：

a）所述的核苷酸序列SEQNo1，

b）所述的核苷酸序列SEQNo2。

所述的建鲤反转录转座子JRE在介导DNA导入细胞中的应用。

所述的基因载体以及基因转移系统在介导DNA导入细胞中的应用。

在研究中发现建锂基因组中存在一个ty3-gypsy反转录转座子类型的转座子，将 其命名为JRE转座子，所述建鲤反转录转座子JRE具有LTR反转录转座子的经典结构(图1), 包含gag蛋白和pol蛋白结构域的编码序列。其中pol结构域的基因顺序为PR-RT-RH-IN,因 而该转座子属于ty3-gypsy类型。JRE一共由5126bp核苷酸构成,包括470bp5?端LTR, 4203bpORF和453bp3?端LTR。整个ORF编码1401个氨基酸,5?端LTR和3?端LTR具有两 个倒转重复的边界序列TG...CA。JRE转座子两边是以ATCTT为边界的正向重复。LTR具有 以TGT开始、以ACA结束的典型反向重复序列区,在LTR中也发现了多嘌呤位点,如位于203 bp处的AAAGGAGGTAA[25],在5?端LRT中具有与ser-tRNA3’端互补的PBS序列。

有益效果：本发明优点在于：

1、分离得到具有完整左右长末端重复序列的转座子JRE，以及以此转座子构建的转座 系统，并且在建鲤肝细胞中进行了转座活性验证。

2、本发明中所涉及到的转座子来源于建鲤本身，因此在建鲤转基因研究中具有更 好的同源性，具有较高的转座效率。

附图说明

图1、JRE转座子结构图开放阅读框以长方形表示;2个三角形表示反向重复序列 (TG...CA);gag,核心蛋白;pol,酶基因相关蛋白;PR,蛋白酶;RT,反转录酶;RH, RNA酶;IN,整合酶;PBS,PPT分别表示引物结合位置和多聚嘌呤位置.

图2JRE转座子分子系统树构建；

图3JRE转座子转基因载体图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员 将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明 具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克 等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进 行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1、建鲤ty3-gypsy反转录转座子JRE的获取和分析

1.1实验鱼

建鲤为本实验室保存,采集血液进行基因组DNA提取。

1.2基因组DNA提取

采用大连宝生物工程有限公司WholeBloodGenomicDNAExtractionKit提取建鲤 基因组DNA,主要步骤如下:取建鲤5尾,尾静脉无菌采血,采集的血液10μL使用含蛋白 酶K和RNaseA裂解液56℃消化15min,然后加入200μL100%乙醇,进行过柱纯化,最后 使用elutionbuffer洗脱与膜结合的DNA,采用琼脂糖凝胶电泳进行检验。用蒸馏水将DNA 样品稀释备用,其他样品保存到–70℃备用。

1.3PCR扩增与检测

根据前期研究中建鲤基因组部分测序结果及Ty3-gypsy转座子的保守区的相关文献设 计引物序列5’GATACATCGCCCATCCCTACG3’，5’GATACATCGCCCATCCCTACG3’，以上述所获建鲤 DNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增混合物中含10mmol/LTris-HCl（pH8.4）、20mmol/L KCl、10mmol/L(NH4)₂SO4、1.5mmol/LMgCl2、0.1mmol/L每种dNTPs、引物浓度为0.2μmol/ L，约200ng。基因组DNA、2UTaq酶，反应总体积为50μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min 后；98℃10s，68℃15min，共30个循环；最后再72℃延伸10min。取3μLPCR产物经琼脂糖 凝胶电泳，EB染色后，在Bio-Rad凝胶成像系统中照相记录。获得的基因片段的PCR产物 经电泳分离、割胶回收、PCR产物纯化等步骤后TA克隆进pMD19-T载体（购于TaKaRa公 司），挑选定向的双阳性克隆进行测序，引物合成及测序工作均由上海生物工程有限公司提 供。

1.4分子系统学分析

采用NIH网站BLAST软件分析获得的JRE反转录转座子全长序列,同时在GenBank中进 行比对,下载氨基酸序列相似性较高的其他物种ty3-gypsy氨基酸序列,使用ClustalW 软件进行分析,采用neighbor-joining构建系统进化树进行分析。进化树分析中所采用的 序列为:Amphimedonqueenslandica(XP-003390581.1),Xiphophorusmaculates (AF193865.),Saccoglossuskowalevskii(XP002732475.1),Azumapectenfarreri (ABM90392),Mizuhopectenyessoensis(ABM90393),Oreochromisniloticus(XP_ 003460117),Xenopustropicalis(XP_002935079.2),Daniorerio(AF503912), Candidatusentotheonella(ETW98900),Clonorchissinensis(GAA49140)。

1.5实验结果

1.5.1PCR扩增到全长

经过至少4个克隆的重复测序,获得了转座子的全长,通过BLASTX搜索GenBank分析和 StadenPackage1.6软件中的重复序列分析工具证实了该反转录转座子具有LTR反转录转 座子的经典结构(图1),包含gag蛋白和pol蛋白结构域的编码序列。其中pol结构域的基因 顺序为PR-RT-RH-IN,因而该转座子属于ty3-gypsy类型。JRE一共由5126bp核苷酸构成, 包括470bp5?端LTR,4203bpORF和453bp3?端LTR。整个ORF编码1401个氨基酸,5? 端LTR和3?端LTR具有两个倒转重复的边界序列TG...CA。JRE转座子两边是以ATCTT为边 界的正向重复。LTR具有以TGT开始、以ACA结束的典型反向重复序列区,在LTR中也发现了 多嘌呤位点,如位于203bp处的AAAGGAGGTAA[25],在5?端LRT中具有与ser-tRNA3’端互 补的PBS序列。

根据JRE中间区域的RT、RH和IN基因推测的氨基酸序列进行了系统分析,采用 ClustalW软件进行序列比对,JRE转座子与虾夷扇贝(Mizuhopectenyessoensis)具有 40.7%的相似性。从系统发育树可以看出,建鲤JRE转座子和虾夷扇贝、栉孔扇贝、大堡礁海 绵和斑剑尾鱼等聚为一枝。

实施例2反转录转座子转座载体的构建

1实验方法

引物设计、合成与基因测序:根据In-Fusion技术原理,克隆引物设计时,在针对 Survivin基因序列的上下游引物的外侧分别引入经线性化的p-GCFU两端各15个碱基, 使克隆引物外侧的15个碱基与线性化载体两端的15个碱基序列同源,其中下游引物去 除终止密码的三个碱基。合成一对引物5’ACCGGACATATGCCCGGG GATACATCGCCCATCCCTACG3’，5’CCTGCAGGAATTCCCGGGGATACATCGCCCATCCCTACG3’。PCR鉴 定引物根据Survivin和载体设计,其中上游引物位于Survivin,下游引物位于载体, 且下游引物也用于后续阳性克隆的测序鉴定。引物合成和基因测序均由上海博尚生物技术 有限公司完成。

以实施例1中获得的PCR产物为模版,采用BamHI内切酶进行酶切，37℃1h。酶切 产物经过1%琼脂糖凝胶电泳后回收,方法同前,并溶于50μL灭菌双蒸水中。获得的酶切 片段与由上海博尚生物公司合成的SEQNo2采用T4DNA连接酶进行4℃连接过夜，并采用 DNA纯化试剂盒纯化连接产物。

SeqNo2的核苷酸序列为：

MCSAflIIBlnIBsePIEco52IEcoO65IHaeIIHpaI

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NheINotIPvuI

GCTAGCGCGGCCGCCGATCGG。

采用In-FusionPCR克隆试剂盒将连接产物与酶切后质粒DNA溶液进行交换反 应,反应条件为室温30min,制备克隆交换液。取200μL感受态细胞悬液转移到无菌的微 量离心管中,加2μL交换液,轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置30min;将管放到预 加温到42℃热激90秒后快速将管转移到冰浴l-2min,每管加入800μlLB培养基;然后 将管转移到37℃摇床上振荡培养(250rpm)45min使细菌复苏;将100μl随机挑取若干单 菌落置于含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中,37℃振荡培养过夜(16h).采用碱裂解 法提取质粒，筛选阳性质粒进行测序鉴定。

2、结果

通过PCR反应成功获得反转录转座子基因DNA以及利用BamHI酶切并采用T4DNA连接 酶连接后的连接产物。用2μl交换液转化后获得阳性克隆数约为103个,随机挑取7个克 隆进行PCR鉴定,仅一个克隆为假阳性,其余克隆的扩增片段大小与预期大小一致为 4694bp,而阴性对照经1.5%琼脂糖电泳检测未见条带。随机挑取任一PCR初步鉴定的阳 性克隆经克隆测序结果与预期相一致。

实施例3反转录转座子转座载体的应用

1实验方法

选取绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因，设计一对引物,引物两端含AflII和NaeI酶切 位点，采用PCR扩增GFP报告基因，pcr反应程序为：94℃30s、60℃5min、72℃45s, 共30个循环，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段，连接pMT18T载体 (Takara)，测序验证(中美泰和公司)。测序所得PCR产物和表达载体经酶切后经1％琼脂 糖凝胶电泳检测回收。然后采用T4DNA酶连接，与JRE转座子载体相连接，连接产物仍采用 IN-FUSION技术克隆扩增。筛选到的阳性质粒送上海博尚公司进行测序，测序结果表明已经 成功的将GFP基因插入到多克隆位（MCS）点中。

将筛选到的阳性质粒转染建鲤肝细胞：在含10％胎牛血清、100IU/mL青霉素、 100μg/mL链霉素的DMEM培养基中于5％CO₂的细胞培养箱中培养建鲤肝细胞。当细胞覆 盖培养瓶底面70％左右时，将转座子转染肝细胞，具体分2组进行转染：1)JRE转座子500ng 和2)空白对照。细胞的转染用LipofectamineTM2000进行(具体操作见试剂说明书)。

基因捕获克隆筛选：JRE转座子载体转染肝细胞24h后，经0.25％胰蛋白酶消化后 转入10寸盘，用含1000μg/mLG418的培养液培养两周，经过G418的抗性筛选，待形成明显 克隆后，用枪头小心转接入96孔板，后按1∶2传代，将获得阳性细胞通过经酚/氯仿方 法提取高纯度的基因组DNA。进行PCR扩增检测GFP基因的表达量。结果表明GFP基因成功的 转入到建鲤肝细胞基因组DNA中。

<110>中国水产科学研究院淡水渔业研究中心

<120>一种建鲤反转录转座子及转基因载体的构建方法和用途

<130>

<160>6

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>5941

<212>DNA

<213>人工序列

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