细菌超氧化物歧化酶及其制备方法

摘要

本发明涉及一种细菌超氧化物歧化酶及其制备方法，所述细菌超氧化物歧化酶由保藏编号为CCTCC？M？2015633的格氏乳球菌(Lactococcus？garviea)发酵培养制备得到，包括格氏乳球菌(Lactococcus？garviea)的活化、种子液的制备、发酵培养以及超氧化物歧化酶的制备的步骤。该方法制备得到的超氧化物歧化酶产量高、活性好、稳定性好，制备过程简单、成本低。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是涉及一种细菌超氧化物歧化酶及其制备 方法。

背景技术

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)是生物体防御氧化损伤的一种十分 重要的金属酶，它可以催化超氧阴离子的歧化反应产生分子氧和过氧化氢。超氧阴离子与 人类及动植物的许多疾病的发生和形成有关。因此，SOD作为一种专一性的氧自由基清除 剂，可以防御超氧阴离子的毒性，维持细胞正常的生理代谢，对机体具有保护作用。超氧化 物歧化酶在医药、食品、化妆品、农业方面有着广阔的应用前景，因此受到国内外普遍重视。

SOD广泛存在于动物、植物、所有好氧微生物及少数厌氧微生物体内。目前SOD主要 从动物组织中提取，比如牛肝和红细胞等，产量受到很大限制，且容易受到原料来源、安全 性及质量不稳定等因素的影响；微生物来源广，繁殖快，时间短，易培养，用来制备SOD具有 很大潜力。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提供一种细菌超氧化物歧化酶的制备方法。

实现上述目的的具体技术方案如下。

一种细菌超氧化物歧化酶的制备方法，该细菌超氧化物歧化酶包括酶液和酶粉两 种形式，由保藏编号为CCTCCM2015633的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)发酵培养制 备得到，包括以下步骤：

(1)格氏乳球菌的活化：将格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)在琼脂-M17培养基 上活化；

(2)格氏乳球菌种子液的制备：将活化后的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)接 种于液体培养基中培养得到格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)种子液；

(3)格氏乳球菌的发酵培养：将格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)种子液接种于 发酵培养基中发酵培养后，离心收集发酵湿菌体直接用于下一步超氧化物歧化酶的制备， 或者将离心收集的发酵湿菌体冻干得到冻干菌粉；

(4)超氧化物歧化酶的制备：将步骤(3)收集的发酵湿菌体或者冻干菌粉，悬浮于 pH为7.2-8.5的磷酸缓冲液中，加入溶菌酶裂解2～24h，离心，将上清液调节pH为4.0～5.6， 冰冷放置1-3h，离心除沉淀，即得细菌超氧化物歧化酶酶液；或将酶液冻干即得细菌超氧化 物歧化酶酶粉。

在其中一些实施例中，步骤(3)所述的发酵培养基的成分为：0.1～10wt％的碳源， 0.1～10wt％的氮源，0～5wt％氮源以外的无机盐，余量为蒸馏水。

在其中一些实施例中，所述碳源选自单糖、双糖、多糖、酵母浸膏、蛋白胨、牛肉膏； 所述氮源选自酵母浸膏、蛋白胨、无机铵盐、无机硝酸盐、尿素、玉米浆、豆饼粉；所述氮源以 外的无机盐选自磷酸盐、钠盐、镁盐、锰盐、钙盐。

在其中一些实施例中，步骤(1)所述琼脂-M17培养基中的琼脂含量为1～2wt％，活 化的时间为12h～60h，活化的温度为20℃～45℃。

在其中一些实施例中，步骤(2)所述液体培养基为M17肉汤培养基，培养的时间为 12h～196h，培养的温度为20℃～45℃，培养的转速为0rpm～280rpm。

在其中一些实施例中，步骤(3)将格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)种子液按体 积比为0.1％～10％的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为20℃ ～45℃，发酵培养的时间为12h～196h，发酵培养的转速为0rpm～280rpm。

在其中一些实施例中，步骤(2)和/或步骤(3)的培养在严格厌氧的条件下进行。

在其中一些实施例中，步骤(4)所述溶菌酶的质量为步骤(3)所得发酵湿菌体质量 的0.1％-1％。

本发明的另一目的在于提供一种细菌超氧化物歧化酶。

具体技术方案如下：

一种细菌超氧化物歧化酶，由上述制备方法制备而得。

本发明利用格氏乳球菌(Lactococcusgarviea，保藏编号为CCTCCM2015633)进 行发酵培养制备细菌超氧化物歧化酶，本发明的制备方法制备得到的细菌超氧化物歧化酶 的酶活力高(20230U/g冻干菌粉以上)，热稳定性与酸碱稳定性均很好，且该方法制备过程 简单、成本低、产量高、应用广泛。且发明人对制备方法进行了优化，厌氧条件下培养更有利 于格氏乳球菌的生长以及细菌超氧化物歧化酶的产生，得到的细菌超氧化物歧化酶具有更 高的酶活力(达到32450U/g冻干菌粉)。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明做进一步说明。

以下实施例中，未注明具体条件的实验方法，按本领域内常规方法和条件进行。格 式乳球菌839(Lactococcusgarviea839)保藏在中国武汉武汉大学，保藏单位中国典型 培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2015年10月22日，保藏编号CCTCCNO:M2015633。

实施例1

本实施例的一种细菌超氧化物歧化酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)格氏乳球菌的活化：将格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)接种于2wt％琼脂- M17培养基中进行活化，活化温度为20℃，时间为48h；

(2)格氏乳球菌种子液的制备：将活化后的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)接 种于M17肉汤培养基中有氧培养12h，培养温度为30℃，转速为100rpm，得到格氏乳球菌 (Lactococcusgarviea)种子液；

(3)格氏乳球菌的发酵培养：将格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)种子液按体积 比为1％的接种量接种于发酵培养基中有氧发酵培养144h，温度为30℃，转速为100rpm；离 心收集发酵湿菌体并把发酵湿菌体冻干得到冻干菌粉；所述发酵培养基的成分为：0.1wt％ 的葡萄糖，1wt％的蛋白胨，0.1wt％硫酸氢二钾，0.1wt％硫酸镁，余量为蒸馏水；

(4)超氧化物歧化酶的制备：将步骤(3)收集的冻干菌粉，悬浮于pH7.8的磷酸缓 冲液中，加入溶菌酶(质量为步骤(3)所得发酵湿菌体质量的1％)裂解24h后10000rpm离心 1min，得到的上清液用10mmol/L的盐酸调pH到4.0，冰冷放置2h，12000rpm下离心1min除沉 淀，上清液即为SOD酶液，并将上清液冻干即得SOD酶粉；测其酶活。

SOD活性测定方法：总超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用邻苯三酚自氧化法，以 每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50％时的酶量定义为一个酶活单位(U)。

自氧化的测定:在25℃，在4.5mL50mmol/L，pH8.2的Tris-HCl缓冲溶液中加入10 μL50mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入比色皿，以Tris-HCl缓冲溶液为空白对照，在 325nm波长下每隔30s测一次吸光度(A值)，共测6次,要求自氧化速率控制在0.070OD/min左 右。

酶活的测定:在25℃，在4.5mL50mmol/L，pH8.2的Tris-HCl缓冲溶液中加入一定 量的待测超氧化物歧化酶酶液，预热20min，加入10μL50mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒 入比色皿，以Tris-HCl缓冲溶液为空白对照，在325nm波长下每隔30s测一次A值,共测6次。

SOD单位活力(U/ml)＝(A_0-A_S)/(A_S×50％)×4.5/V×N

式中:A₀为自氧化速率；A_S为加入待测SOD酶液后的氧化速率；V为加样体积；N为样 品稀释倍数。

在步骤(3)中，1L发酵培养基得15.8g冻干菌粉，经测定步骤(4)SOD酶液冻干后质 量为986mg，SOD活性为25650U/g冻干菌粉。

实施例2

本实施例的一种细菌超氧化物歧化酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)格氏乳球菌的活化：将格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)接种于2wt％琼脂- M17培养基中进行活化，活化温度为20℃，时间为12h；

(2)格氏乳球菌种子液的制备：将活化后的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)接 种于M17肉汤培养基中厌氧培养196h，培养温度为30℃，转速为0rpm，得到格氏乳球菌 (Lactococcusgarviea)种子液；

(3)格氏乳球菌的发酵培养：将格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)种子液按体积 比为10％的接种量接种于发酵培养基,分别进行有氧和厌氧发酵培养24h，培养温度为28 ℃，转速为0rpm；离心收集发酵湿菌体并把发酵湿菌体冻干得到冻干菌粉；所述发酵培养基 的成分为：10wt％的葡萄糖，1wt％的酵母浸膏，0.5wt％硫酸氢二钾，0.02wt％硫酸镁， 0.1％硫酸铵，余量为蒸馏水；

(4)超氧化物歧化酶的制备：将步骤(3)收集的冻干菌粉，悬浮于pH8.5磷酸缓冲 液中，加入溶菌酶(质量为步骤(3)所得发酵湿菌体质量的0.1％)裂解2h后10000rpm离心 1min，得到的上清液用10mmol/L的盐酸调pH到4.0，冰冷放置2h，8000rpm下离心10min除沉 淀，上清液即为SOD酶液；测其酶活(测定方法同实施例1)；

在步骤(3)中，1L发酵培养基有氧发酵培养得15.8g冻干菌粉，经测定步骤(4)所得 SOD的活性为25550U/g冻干菌粉；1L发酵培养基厌氧发酵培养得20.8g冻干菌粉，经测定步 骤(4)所得SOD的活性为32450U/g冻干菌粉；由此可见，厌氧条件更有利于格氏乳球菌的生 长以及SOD的产生。

实施例3

(1)格氏乳球菌的活化：将格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)接种于2wt％琼脂- M17培养基中进行活化，活化温度为37℃，时间为60h；

(2)格氏乳球菌种子液的制备：将活化后的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)接 种于M17肉汤培养基中厌氧培养196h，培养温度为37℃，转速为0rpm，得到格氏乳球菌 (Lactococcusgarviea)种子液；

(3)格氏乳球菌的发酵培养：将格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)种子液按体积 比为1％的接种量接种于发酵培养基中厌氧发酵培养196h，培养温度为37℃，转速为0rpm； 离心收集发酵湿菌体并把发酵湿菌体冻干得到冻干菌粉；所述发酵培养基的成分为： 0.5wt％的蔗糖，10wt％的酵母浸膏，0.8wt％硫酸氢二钾，0.1wt％硫酸镁，0.1％硫酸铵， 余量为蒸馏水；

(4)超氧化物歧化酶的制备：将步骤(3)收集的冻干菌体，悬浮于pH8.5磷酸缓冲 液中，加入溶菌酶(质量为步骤(3)所得发酵湿菌体质量的0.2％)裂解4h后10000rpm离心 1min，得到的上清液用10mmol/L的盐酸调pH到5.5，冰冷放置2h，10000rpm下离心5min除沉 淀，上清液即为SOD酶液；测其酶活(方法同实施实例1)；

在步骤3中，1L发酵培养基得28.2g冻干菌粉，经测定步骤(4)所得SOD活性为 20230U/g冻干菌粉。

实施例4

取实施例1中的SOD酶液0.5ml，分别置于pH4，5，6，7，8，9的磷酸缓冲液3.5ml中， 在35℃下测定SOD活力分别为24600，25000，24000，24300，25800，23800U/g冻干菌粉(测定 方法同实施例1)，因此该SOD的最适反应pH是8。

实施例5

取实施例1中的SOD酶液0.5ml,与3.5mlpH8的磷酸盐缓冲液混合，在30，35，40， 45，50，55，65℃下分别测得SOD活力为23000，25800，25000，24100，23700U，23100，22000U/g 冻干菌粉(测定方法同实施例1)，因此该SOD的最适反应温度为35℃。

实施例6

取实施例1中的SOD酶液0.5ml，与3.5mlpH8的磷酸盐缓冲液混合，在45，50，55， 65，70，75下保温24h后，在35℃分别测得相对酶活(与未做处理的SOD酶液相比)为100％、 98％、96％、96％、95％、95％(测定方法同实施例1)，表明该SOD有良好的热稳定性。

实施例7

取实施例1中的SOD酶液0.5ml，与3.5mlpH3，4，5，6，7，8，9，10，11的磷酸盐缓冲 液混合放置4h后，在35℃分别测得相对酶活(与未做处理的SOD酶液相比)为90％、95％、 96％、96％、99％、100％，99％，94％，90％(测定方法同实施例1)，表明该SOD有良好的pH稳 定性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实 施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存 在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护 范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。