老鹳草水提物在制备抗血管生成类药物中的应用

摘要

本发明提供了老鹳草水提物在制备抗血管生成类药物中的应用。本发明首次发现老鹳草水提取物有抗血管生成作用。利用斑马鱼血管生成模型进行体内药效学实验证实，老鹳草水提物能够显著抑制斑马鱼的血管生成，说明老鹳草水提物具有抗血管生成活性，可作为血管生成抑制剂使用，并应用于肿瘤、关节炎、皮肤及眼科疾病、动脉粥样硬化、血管性痴呆、子宫内膜异位症等新生血管依赖性和新生血管相关性疾病的治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及中草药提取物的应用，具体地，涉及一种老鹳草水提物在制备抗血管生成药物中的应用。

背景技术

血管生成(angiogenesis)是指在已存在的血管床上出芽(sprouting)形成新的毛细血管为主的血管系统的过程。在血管生成的初始，首先是血管内皮细胞去分化，在各种条件具备的情况下，血管基底膜变薄或消失，内皮细胞激活、增殖、迁移，新基底膜形成，覆盖内皮细胞和血管平滑肌细胞，最后形成新的血管。

血管生成与人类多种重大疾病高度相关，如恶性肿瘤、动脉粥样硬化、关节炎、皮肤及眼科疾病(老年视黄斑变性、糖尿病视网膜变性)、血管性痴呆、子宫内膜异位症等。

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病之一。肿瘤血管生成是指肿瘤细胞诱发的为实体瘤的后续生长及转移提供物质基础的毛细血管新生以及肿瘤中微循环网的形成。1971年，哈佛大学JudahFolkman教授首次提出具有里程碑意义的抗肿瘤血管疗法^[1]。他认为实体肿瘤的生长和扩散依赖于肿瘤内新血管的形成，并通过新生血管获取养分；新血管的形成和生长，促进了肿瘤细胞的转移。目前基于这一疗法，已有超过10只专利新药获得美国FDA批准上市，多个药物为年销售额超10亿美元的重磅炸弹新药，如罗氏的Bevacizumab(商品名Avastin，临床一线治疗结直肠癌、非小细胞肺癌、转移性肾癌和复发胶质母细胞瘤等实体瘤，2013年销售额70.37亿美元)，拜耳的Sorafenib(商品名Nexavar，全球肝癌的金标准治疗药物，2013年销售额10.24亿美元)，辉瑞的Sunitinib(商品名Sutent，2013年销售额12.04亿美元)，诺华的Everolimus(商品名Afinitor，临床一线治疗胰腺癌、肾血管平滑肌脂肪瘤和神经胶质瘤，二线治疗HER-2阴性的乳腺癌和晚期肾癌等实体肿瘤，2013年销售额13.09亿美元)。但这些药物价格十分昂贵。

目前国内只有一个真正意义的抗肿瘤血管生成药物通过CFDA批准上市(恩度，先声药业，2005年上市)，但由于恩度(重组人血管内皮抑制素注射液)为大分子蛋白质类药物，生产这类高纯度安全制剂需要很高的技术门槛，而且此类型的药物在体内的半衰期短，药物作用靶点单一，容易产生耐药性，价格昂贵，从而限制了这些活性蛋白类药物在临床上的应用。

因此，急需开发一种使用安全、价格易于接受、不易产生耐药性的抗血管生成类药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种老鹳草水提物在制备抗血管生成类药物中的新用途。

本发明的第一方面提供了一种老鹳草或其提取物在制备抗血管生成类药物中的用途。

在另一优选例中，所述的提取物包括水提取物、水性溶剂提取物和/或醇提取物。

在另一优选例中，所述老鹳草提取物为老鹳草水提取物。

在另一优选例中，所述的老鹳草水提取物包括老鹳草的水回流提取物。

在另一优选例中，所述的抗血管生成类药物用于治疗选自下组的一种或多种病症：

抑制肿瘤血管新生；

抑制银屑病病变组织血管新生；

抑制Paget’s疾病的血管新生；

抑制良性血管增生疾病的血管新生；

抑制关节炎病变组织的血管新生；

抑制新生血管性眼病的血管生成；

抑制动脉粥样硬化病变处血管新生；

抑制子宫内膜异位症病变组织血管新生。

在另一优选例中，所述的抗血管生成类药物还用于抑制血管性痴呆、和/或抗肿瘤。

在另一优选例中，所述的抗血管生成类药物的剂型选自下组：胶囊剂、片剂、颗粒剂、混悬剂、微囊制剂、注射剂、栓剂、粉剂、喷雾剂、贴片或软膏剂。

本发明的第二方面提供了老鹳草水提取物的提取方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供老鹳草药材粉末；

b)对所述老鹳草药材粉末进行水提取，从而获得所述老鹳草水提取物。

在另一优选例中，药材加水进行热回流提取后，过滤，滤渣加入水再进行第二次或多次热回流提取。

在另一优选例中，热回流提取时间为0.5-8小时，优选地为0.75-4小时。

在另一优选例中，每一次加热回流完成均进行过滤，并合并所有滤液备用。

在另一优选例中，所述方法还包括：将合并后的滤液加热浓缩，从而获得浓缩物。

在另一优选例中，所述方法还包括对浓缩物进行干燥，在-20℃冷冻保存备用。

在另一优选例中，药材粉末与水的质量体积比(w/v)为0.5-2:5-15。

在另一优选例中，药材粉末与水的质量体积比(w/v)为0.5-1.5:8。

在另一优选例中，药材粉末与水的质量体积比(w/v)为0.5-1.5:6。

本发明的第三方面提供了一种药物，所述的药物含有如本发明第二方面所述的老鹳草水提取物与药学上可接受的载体或辅料。

在另一优选例中，所述的药物由所述老鹳草水提取物与药学上可接受的载体或辅料构成。

本发明的第四方面提供了一种用于制备抗血管生成类药物的组合物，所述组合物包含如本发明第二方面所述的老鹳草水提取物与药学上可接受的载体或辅料，其中，所述的水提取物为老鹳草的水回流提取物。

在另一优选例中，所述的组合物由所述老鹳草水提取物与药学上可接受的载体或辅料构成。

在另一优选例中，所述的水回流提取物是用包括以下步骤的方法制备：

a)提供老鹳草药材粉末；

b)对所述老鹳草药材粉末进行水提取，从而获得所述老鹳草水提取物。

在另一优选例中，药材加水进行热回流提取后，过滤，滤渣加入水再进行第二次或多次热回流提取。

在另一优选例中，热回流提取时间为0.5-8小时，优选地为0.75-4小时。

在另一优选例中，每一次加热回流完成均进行过滤，并合并所有滤液备用。

在另一优选例中，所述方法还包括：将合并后的滤液加热浓缩，从而获得浓缩物。

在另一优选例中，所述方法还包括对浓缩物进行干燥，在-20℃冷冻保存备用。

在另一优选例中，药材粉末与水的质量体积比(w/v)为0.5-2:5-15。

在另一优选例中，药材粉末与水的质量体积比(w/v)为0.5-1.5:8。

在另一优选例中，药材粉末与水的质量体积比(w/v)为0.5-1.5:6。

本发明的第五方面提供了一种体外非治疗性的内部的抑制血管生成的方法，其特征在于，给需要对象施用如本发明第二方面所述的老鹳草的水提取物。

在另一优选例中，所述的对象包括斑马鱼、小鼠角膜袋(CornealMicropocketAssay)、鸡胚尿囊模(ChickChorioallantoicMembraneAssay)、小鼠动脉环(MouseAorticRingAssay)和人脐静脉内皮细胞管腔形成(HUVECstubeformationassay)。

在另一优选例中，所述的水提取物的施用浓度为10-200μg/ml。

附图说明

图1是受精后2天(2dpf)血管转基因荧光斑马鱼体节间血管(ISV)模型。

图2是老鹳草水提物对斑马鱼体节间血管(ISV)生成模型的抑制效果。

图a-e，受精后24hpf的斑马鱼经过药物处理24h，拍照时相为52hpf。图a为溶剂对照(0.1％DMSO)，图b-d为不同浓度的老鹳草水提物处理组，图e为阳性对照(PTK787)。红色框圈定的区域为各实验组斑马鱼体节间血管(ISV)放大观察的部位，见图f-j。与溶剂对照(0.1％DMSO)相比，老鹳草水提物能够显著抑制斑马鱼体节间血管(ISV)的生成，表现为背长轴血管(DLAV)出现缺失断裂，仅在背主动脉(DA)部位看到少许零星血管内皮细胞出芽(Sprouts)，见白色星号指示。随着浓度的增加，老鹳草水提物对斑马鱼体节间血管生成的抑制效果逐渐增强，呈现剂量依耐性，见图k。当老鹳草水提物的浓度在100μg/ml时，斑马鱼体节间血管的生成几乎被完全抑制。

***：与对照组(加入溶剂0.1％DMSO组)相比具有极显著性差异(p<0.0001)。

图3是老鹳草水提物对斑马鱼体节间血管(ISV)生成的抑制率。

老鹳草水提物对斑马鱼体节间血管(ISV)生成的抑制率随着浓度的上升而呈现梯度增加，不同浓度的老鹳草水提物对斑马鱼体节间血管(ISV)生成的抑制率分别为：25μg/ml(25.82％)，50μg/ml(50.55％)，100μg/ml(100％)。

具体实施方式

本发明人经过长期广泛而深入的试验，对上百种传统中草药进行了筛选，首次发现老鹳草水提取物能应用于制备抗血管生成类药物。利用本发明的研究成果制成的抗血管生成药物具有价格优势、安全有效，不易产生耐药性，具有较广阔的开发应用前景。在此基础上完成了本发明。

老鹳草

老鹳草，始载于明代兰茂的《滇南本草》。2000版中国药典收载，老鹳草为牻牛儿苗科植物牻牛儿苗(ErodiumstephanianumWilld)、老鹳草(GeraniumwilfordiiMaxim)或野老鹳草(GeraniumcarolinianumL)的干燥地上部分，前者习称“长嘴老鹳草”，后者习称“短嘴老鹳草”。

老鹳草具有祛风湿、通经络，治疗筋骨酸痛、泄泻痢疾等功效。现代药理研究还发现老鹳草具有抗炎、镇痛、抗菌、抗病毒、抗氧化、镇咳、护肝、降糖等作用。

本发明中所述的用于制备抗血管生成类药物的提取物是老鹳草的水提取物。

所述老鹳草水提取物的提取方法包括以下步骤：

a)提供老鹳草药材粉末；

b)对所述老鹳草药材粉末进行水提取，从而获得所述老鹳草水提取物。

在另一优选例中，药材加水进行热回流提取后，过滤，滤渣加入水再进行第二次或多次热回流提取。

在另一优选例中，热回流提取时间为0.5-8小时，优选地为0.75-4小时。

在另一优选例中，每一次加热回流完成均进行过滤，并合并所有滤液备用。

在另一优选例中，所述方法还包括：将合并后的滤液加热浓缩，从而获得浓缩物。

在另一优选例中，所述方法还包括对浓缩物进行干燥，在-20℃冷冻保存备用。

在另一优选例中，药材粉末与水的质量体积比(w/v)为0.5-2:5-15。

在另一优选例中，药材粉末与水的质量体积比(w/v)为0.5-1.5:8。

在另一优选例中，药材粉末与水的质量体积比(w/v)为0.5-1.5:6。

在本发明中，发明人同样进行了醇提取物的制备，所述制备方法如实施例2所示。并将老鹳草醇提取物与水提取物一并使用斑马鱼体节间血管(ISV)生成模型评价其抗血管生成效果，所得结果如实施例3所示。

血管生成

血管生成(angiogenesis)是指在已存在的血管床上出芽(sprouting)形成新的毛细血管为主的血管系统的过程。在血管生成的初始，首先是血管内皮细胞去分化，在各种条件具备的情况下，血管基底膜变薄或消失，内皮细胞激活、增殖、迁移，新基底膜形成，覆盖内皮细胞和血管平滑肌细胞，最后形成新的血管。

血管生成与人类多种重大疾病高度相关，如恶性肿瘤、动脉粥样硬化、关节炎、皮肤及眼科疾病(老年视黄斑变性、糖尿病视网膜变性)、血管性痴呆、子宫内膜异位症等。

本发明的主要优点包括：

1.本发明提供了老鹳草水提物的新用途。利用斑马鱼血管生成模型进行体内药效学实验证实，老鹳草水提物能够显著抑制斑马鱼的血管生成，说明老鹳草水提物具有抗血管生成活性，提示可作为血管生成抑制剂使用，应用于肿瘤、关节炎、皮肤及眼科疾病、动脉粥样硬化、血管性痴呆、子宫内膜异位症等新生血管依赖性和新生血管相关性疾病的治疗。

2.本发明中的老鹳草水提物制备简单、价格低廉、原料来源广泛，辅以药学上可接受的辅料，采用常规制剂技术即可制成各种口服、注射、外用制剂，具有良好的开发前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1老鹳草水提物的制备

(1)取老鹳草药材粉末50g，加入400ml去离子水，回流提取1h，过滤得滤液。

(2)将第一步过滤之后的滤渣，加入300ml去离子水，回流提取1h，过滤得滤液。

(3)合并两次滤液，70℃回收至干，得到老鹳草水提物，-20℃冷冻保存备用。

实施例2老鹳草醇提物的制备

(1)取老鹳草药材粉末100g，加入800ml无水乙醇，回流提取1h，过滤得滤液。

(2)将第一步过滤之后的滤渣，加入600ml无水乙醇，回流提取1h，过滤得滤液。

(3)合并两次滤液，60℃回收至干，得到老鹳草醇提物，-20℃冷冻保存备用。

实施例3评价老鹳草水提物和醇提物对斑马鱼体节间血管(ISV)生成模型的抑制效果

本发明的目的是利用斑马鱼体节间血管(ISV)生成模型评价老鹳草水提物的抗血管生成药效。该体内模型可用于抗血管生成类药物的药效学评价。斑马鱼体节间血管生成是一个完整的动态过程，其体节间血管内皮细胞出芽(sprouts)从20hpf开始，30～31hpf左右形成主要的体节间血管网络，如背长轴血管(DLAV)和体节间血管(ISV)，48hpf基本上形成完整的体轴血管网络，此时清晰可见完整的体节间血管(ISV)。

完整的体节间血管主要指连接背主动脉(DA)和背长轴血管之间(DLAV)之间的血管，见附图1(受精后2dpf血管转基因斑马鱼体节间血管生成模型)。受精后2天(2dpf)的斑马鱼一共有28对完整的体节间血管(ISVs)。在完整的体节间血管未形成之前，如果加入抑制剂，就可以抑制其体节间血管网络的形成。因此，利用斑马鱼体节间血管生成模型，可以方便直观的评价药物对体节间血管生成抑制的影响。

斑马鱼实验相关缩略词：

受精后小时数：hpf--hourspostfertilization

受精后天数：dpf--dayspostfertilization

背长轴血管：DLAV--dorsallongitudinalanastomoticvessel

体节间血管：ISV--intersegmentalvessel

背主动脉：DA--dorsalaorta

后主静脉：PCV--posteriorcardinalvein

斑马鱼：

本实施例中使用的斑马鱼为血管转基因斑马鱼(一种由内皮细胞特异表达的基因作为驱动子驱动绿色荧光蛋白在斑马鱼血管内皮细胞特异表达)，饲养和使用严格参照国际实验动物评估和认可委员会(AAALAC)的要求进行。

养鱼水(Fishwater)：

配制方法：1L反渗透水加入0.3g海盐，PH值控制在6.9～7.2之间。

二甲基亚砜(DMSO，溶剂对照)：

购买于Sigma(货号#D2650，批号#RNBC5311)。

0.1％DMSO溶液配置：使用时，用养鱼水配制成浓度为0.1％的工作液，现配现用。

PTK787(盐酸瓦他拉尼)(阳性对照)：

原料药购买于SelleckChem公司(货号#S1101，批号#S110102)。使用时，用0.1％DMSO溶液配制成实验所需的浓度，本实验中阳性对照药的使用浓度为5μg/ml。PTK787原研药公司为瑞士诺华(Novartis)制药公司，PTK787是抗血管生成的标准参照药物，目前正处于全球多中心临床试验阶段。

老鹳草提取物配制：

用0.1％DMSO溶液配置成不同浓度的老鹳草水提物和老鹳草醇提物溶液，使用浓度分别为25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml。

方法：

(1)实验分组及胚胎处理：取240只发育良好的斑马鱼胚胎，胚胎发育时相为受精后24hpf，随机分为8组，见下表：

表1老鹳草水提取物及醇提取物筛选及处理条件

每组斑马鱼胚胎数量30只。操作时将胚胎均匀分配至6孔细胞培养平板(Falcon)中，每孔30只胚胎，每个药物浓度处理30只胚胎，每孔胚胎饲养用水4ml。

(2)药物处理：用移液器(量程100～1000μl，Eppendorf)迅速将预先配置好的药液加入6孔细胞培养平板对应的孔中，每孔4ml。加药液之前，使用移液器将6孔板中孵育胚胎的饲养用水尽力移出。然后用锡箔纸将6孔板包裹好，做好实验标记，迅速放置于培养箱中继续培养24h(培养箱温度控制在28.5±0.5℃)。

(3)表型观察及统计：将各药物浓度处理后的胚胎在体式荧光显微镜(NikonSMZ-1500体式荧光显微镜)下进行观察拍照，拍照时相为52hpf，以分析各药物浓度对斑马鱼体节间血管(ISV)生成的影响。从各实验组随机取10只胚胎进行定量统计，统计指标如下：

a)完整的体节间血管(ISVs)数量：连接背主动脉(DA)和背长轴血管之间(DLAV)之间的血管

b)

利用GraphPadPrism软件进行统计作图，采用单因子方差统计分析(one-wayANOVA)的方法进行统计分析，并计算各个浓度的老鹳草提取物物对斑马鱼体节间血管(SV)生成的抑制率，实验结果见附图2～附图3。

实施例4其他中药提取物在斑马鱼血管生成模型筛选中的抗血管生成效果.

在本发明中，发明人对其它4种已报道有抗肿瘤等适应症的中药进行了研究，并得到了水提取物和醇提取物，提取方法分别与实施例1、2相同。发明人利用斑马鱼血管生成模型对所述水和醇提取物分别进行了抗血管生成效果的筛选，结果如表2所示。

表2其他中药提取物在斑马鱼血管生成模型筛选中的抗血管生成效果

注：抗血管生成筛选提取物浓度为：50μg/ml；

醇提物：乙醇提取物。

结果与结论

本发明人对老鹳草及其他传统中草药进行了研究，利用其水提取物和醇提取物进行了斑马鱼血管生成模型的抗血管生成的筛选，结果发现老鹳草水提物显示出显著地抗斑马鱼体节间血管(ISV)生成的效果，而老鹳草醇提物及其他中药的水、醇提取物均不能抑制血管的生成。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献：

[1]FolkmanJ.Tumorangiogenesis:therapeuticimplications.NEnglJMed.1971Nov18；285(21):1182-6.