一种基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的建立方法

摘要

本发明涉及植物组织培养及基因工程技术领域，具体而言，一种基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的建立方法，包括，将热应激处理后的中华猕猴桃伏牛95－2的组培苗的叶片作为外植体，将所述外植体处理成为愈伤组织并进行不定芽的诱导培养及生根培养。该方法操作简单易行，不仅大幅度缩短原转化受体系统再生时间，同时愈伤组织不定芽分化率有了进一步的提高，而同时不定芽的根系发育能力也有了大幅提升。

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养及基因工程技术领域，具体而言，一 种基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的建立方法。

背景技术

猕猴桃属猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属植物，由于它们 具有维生素C含量高、风味独特、营养丰富等优点而备受关注。中 华猕猴桃(Actinidiachinensis)是猕猴桃的主要栽培种之一，其中 伏牛95－2品系的果肉为红色，是特异的中华猕猴桃种质资源，但 因其具有果实小、外观差等不足，因此有待于改良并提高其果实品 质以适应市场需求。利用常规育种手段进行猕猴桃的品种改良所需 的周期长、工作量大且效率低，难以满足生产发展的需要，而基因 工程技术则为猕猴桃的种质改良开辟了一条新途径。

自1985年Horsch等发明叶盘法以来，基因工程的转化工作相 对简化。成功的基因转化系统首先依赖良好的植物受体系统的建立， 即要求用于转化的外植体能够高效、稳定地再生无性系，并能接受 外源DNA的整合，同时用于筛选的转化细胞或植株应该对抗生素 具有一定的敏感性。本发明申请人之前对于中华猕猴桃的遗传转化 体系已有研究，但该体系依然存在再生时间长，不定芽所生根系不 发达的问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于热应激的猕猴桃遗传转化受体 系统的建立方法，所述的猕猴桃遗传转化受体系统，可解决现有转 化体系再生时间长，不定芽所生根系不发达的问题。

一种基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的建立方法，包括：

将热应激处理后的中华猕猴桃伏牛95－2的组培苗的叶片作为 外植体，将所述外植体处理成为愈伤组织并进行不定芽的诱导培养 及生根培养。

植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发 育成完整植株的遗传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发 育成一个新个体。植物细胞全能性是植物组织培养的理论基础，其 全能性的强弱与转化体系中愈伤组织的分化速度息息相关。

本申请所采用的热应激方法，是发明人在实验中偶然发现的。 由于培养室内的温度调节装置出现故障而出现了短暂升温，在随后 的培养中，发现这一批次的愈伤组织分化速度显著高于之前的批次， 且根系更为发达。经过发明人对调整遗传转化受体系统进行调整之 后最后确定下来整体参数。

关于热应激(heatstress)对植物细胞全能性的影响目前还没有 明确的机制，但近年来研究发现，在动物中会有应激处理之后细胞 的全能性得到部分恢复的现象【Nature510,393–396(19June2014)】， 研究人员通过对小鼠的肌肉干细胞(星状细胞)进行研究时发现的， 这类细胞通常情况下是处于一种静止状态，不像其他细胞在不断进 行DNA复制以及分化。但一旦肌体在受伤或者需要再生时，这些 细胞即可被激活。而植物细胞的全能性本身就远超于动物细胞，其 全能性可能也会受到应激影响，进而使愈伤组织分化能力更强，这 可能具有与动物细胞不同的分子机制。

经过热应激处理后，本申请取得了再生时间显著缩短，且不定 芽所生根系更为发达的效果。

优选的，如上所述的基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的 建立方法，所述组培苗的叶片的叶龄为28～32d。

优选的，如上所述的基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的 建立方法，所述热应激的具体步骤为：

取健壮的中华猕猴桃伏牛95－2的组培苗，在其叶龄为18～22d 时，于早上6:00～8:00时，将所述组培苗于35～38℃热处理30～50min， 次日6:00～8:00时相同条件再处理一次；

除热应激处理以外，其余的培养温度均为23～27℃。

中华猕猴桃的最适培养温度为23～27℃，当环境温度超过40℃ 时就可能导致植株的死亡。早上6:00～8:00进行热应激效果最好， 且可缩短植株的恢复时间。热应激处理的具体操作方法为，将组培 苗转移到室温为35～38℃的培养环境中静置30～50min。

优选的，如上所述的基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的 建立方法，将外植体处理成为愈伤组织并进行不定芽的诱导培养的 具体操作包括：

去掉叶片的叶尖和叶缘，垂直沿叶片中脉切成(0.4～0.6cm)× (0.4～0.6cm)的叶盘作为试验用外植体，将叶片正面向上接种于愈 伤组织及不定芽诱导培养基中进行培养。

优选的，所述愈伤组织及不定芽诱导培养基为MS+(1.5～2.2) mg/LZT+(0.5～0.7)mg/LNAA。

进一步优选的，所述愈伤组织及不定芽诱导培养基为MS+ (1.5～2.2)mg/LZT+(0.5～0.7)mg/LNAA。

配制方法为，在MS培养基中按既定量添加ZT及NAA。

优选的，如上所述的基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的 建立方法，所述生根培养的具体操作包括：将长至2～3cm的健壮不 定芽接种于生根培养基中进行培养。

优选的，所述生根培养基为1/2MS+(2.3～2.6)mg/LNAA。

配制方法为，在MS培养基中按既定量添加NAA。

进一步优选的，所述生根培养的培养条件为：

培养温度23～27℃，光照时间13～15h/d，培养时间为20～30d。

优选的，如上所述的基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的 建立方法，所述愈伤组织及不定芽诱导培养基中的MS和所述生根 培养基中的1/2MS均为对基础MS培养基中的部分无机盐改良得到 的，改良成分为：KNO₃调整为700～750mg/L，NH₄NO₃调整为 600～650mg/L。

表1改良MS培养基母液配制示例(单位：mg)

其中，MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞 培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平 衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，但是，高 盐离子浓度反而不利于中华猕猴桃伏牛95－2的分化。因此，本申 请对其中大量元素中的KNO₃及NH₄NO₃含量进行改良，其具体含 量如表1所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)热应激操作简单，技术难度低。

(2)愈伤组织及不定芽的诱导时间大幅减少，增加培养效率； 愈伤组织及不定芽的的分化率可达96％。

(3)不定芽的生根培养培养时间大幅减少，增加了培养效率； 根系生物量、分支数、根茎入土深度都较其他方法进步明显，说明 培养得到的根系发育更为发达。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本 领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视 为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件 或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均 为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一种基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的建立方法

取健壮的中华猕猴桃伏牛95－2的组培苗，在其叶龄为18d时， 于早上6:00～8:00时，将所述组培苗于35～38℃热处理30～50min， 次日6:00～8:00时相同条件再处理一次；

除热应激处理以外，其余的培养温度均为23～27℃。

将热应激处理后的中华猕猴桃伏牛95－2的组培苗的叶片作为 外植体，将所述外植体处理成为愈伤组织并进行不定芽的诱导培养 及生根培养。

实施例2

一种基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的建立方法

取健壮的中华猕猴桃伏牛95－2的组培苗，在其叶龄为22d时， 于早上6:00～8:00时，将所述组培苗于35～38℃热处理30～50min， 次日6:00～8:00时相同条件再处理一次；

除热应激处理以外，其余的培养温度均为23～27℃。

将热应激处理10d后的中华猕猴桃伏牛95－2的组培苗的叶片 作为外植体，去掉叶片的叶尖和叶缘，垂直沿叶片中脉切成 0.4cm×0.4cm的叶盘作为试验用外植体，将叶片正面向上接种于愈 伤组织及不定芽诱导培养基中进行培养。

愈伤组织及不定芽诱导培养基为MS+1.5mg/LZT+0.5mg/L NAA；

培养条件为：培养温度23～27℃，光照时间13～15h/d，培养时 间为25d。

将长至2～3cm的健壮不定芽接种于生根培养基中进行培养。

生根培养基为1/2MS+2.6mg/LNAA；

培养条件为：培养温度23～27℃，光照时间13～15h/d，培养时 间为25d。

上述愈伤组织及不定芽诱导培养基中的MS和所述生根培养基 中的1/2MS均为对基础MS培养基中的部分无机盐改良得到的，改 良成分为：KNO₃调整为700mg/L，NH₄NO₃调整为600mg/L。

实施例3

一种基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的建立方法

取健壮的中华猕猴桃伏牛95－2的组培苗，在其叶龄为18d时， 于早上6:00～8:00时，将所述组培苗于35～38℃热处理30～50min， 次日6:00～8:00时相同条件再处理一次；

除热应激处理以外，其余的培养温度均为23～27℃。

将热应激处理10d后的中华猕猴桃伏牛95－2的组培苗的叶片 作为外植体，去掉叶片的叶尖和叶缘，垂直沿叶片中脉切成 0.6cm×0.6cm的叶盘作为试验用外植体，将叶片正面向上接种于愈 伤组织及不定芽诱导培养基中进行培养。

愈伤组织及不定芽诱导培养基为MS+2.2mg/LZT+0.7mg/L NAA；

培养条件为：培养温度23～27℃，光照时间13～15h/d，培养时 间为27d。

将长至2～3cm的健壮不定芽接种于生根培养基中进行培养。

生根培养基为1/2MS+2.3mg/LNAA；

培养条件为：培养温度23～27℃，光照时间13～15h/d，培养时 间为30d。

上述愈伤组织及不定芽诱导培养基中的MS和所述生根培养基 中的1/2MS均为对基础MS培养基中的部分无机盐改良得到的，改 良成分为：KNO₃调整为750mg/L，NH₄NO₃调整为650mg/L。

实施例4

一种基于热应激的猕猴桃遗传转化受体系统的建立方法

取健壮的中华猕猴桃伏牛95－2的组培苗，在其叶龄为20d时， 于早上6:00～8:00时，将所述组培苗于35～38℃热处理30～50min， 次日6:00～8:00时相同条件再处理一次；

除热应激处理以外，其余的培养温度均为23～27℃。

将热应激处理10d后的中华猕猴桃伏牛95－2的组培苗的叶片 作为外植体，去掉叶片的叶尖和叶缘，垂直沿叶片中脉切成 0.5cm×0.5cm的叶盘作为试验用外植体，将叶片正面向上接种于愈 伤组织及不定芽诱导培养基中进行培养。

愈伤组织及不定芽诱导培养基为MS+2.0mg/LZT+0.6mg/L NAA；

培养条件为：培养温度23～27℃，光照时间14h/d，培养时间为 26d。

将长至2～3cm的健壮不定芽接种于生根培养基中进行培养。

生根培养基为1/2MS+2.5mg/LNAA；

培养条件为：培养温度23～27℃，光照时间14h/d，培养时间为 27d。

上述愈伤组织及不定芽诱导培养基中的MS和所述生根培养基 中的1/2MS均为对基础MS培养基中的部分无机盐改良得到的，改 良成分为：KNO₃调整为725mg/L，NH₄NO₃调整为625mg/L。

以筛选出的愈伤组织的不定芽诱导培养基或生根培养基为基本 培养基，添加不同质量浓度(0、5、10、15、20、30、40、50mg/L) 的卡那霉素进行敏感性试验，测定结果为20mg/L卡那霉素浓度为 中华猕猴桃伏牛95－2叶片遗传转化的最佳筛选浓度。

为说明本申请各实施例效果，设置实验例1～2以作说明。

其中，对比例1的培养方法参见：江苏农业科学，2013，41(6):46 －48.中华猕猴桃遗传转化受体系统的建立。具体培养方法不再赘 述。

对比例2与本申请实施例4的热应激处理方法一致，但后续培 养方法与对比例1一致。

实验例1

表2热应激对中华猕猴桃叶片愈伤组织及不定芽分化率的影响

注：出愈率＝诱导出愈伤组织的外植体数/接种的外植体数 ×100％；

不定芽分化率＝诱导出芽的外植体数/愈伤组织数×100％；

对比例1和对比例2在培养30d后调查愈伤组织形成率，培养 40d后调查愈伤组织不定芽分化率；

实验例1～4在培养20d后调查愈伤组织形成率，培养25d后调 查愈伤组织不定芽分化率。

如上表可知，虽然实施例1～4的培养时间比对比例1～2短，但 愈伤组织不定芽分化率和每个叶盘形成的不定芽数均有显著性升高 (p<0.05)，且通过实施例2可知，热激后中华猕猴桃叶片愈伤组织 及不定芽对最适植物生长调节剂的需求量也发生了改变。

实验例2

表3热应激对中华猕猴桃不定芽的根系发育能力影响

分组 NAA(mg/L) 根系干重(g) 入土深度(cm) 分支数(个) 实施例1 2.0 14.69 35.1 15.2 实施例2 1.5 12.53 38.5 15.8 实施例3 2.2 13.62 36.6 13.6 实施例4 2.0 15.79 42.7 16.1 对比例1 1.0 6.10 26.2 8.9 对比例2 1.0 7.56 24.2 9.2

如上表所示，经过热应激处理后，实施例1～4的根系干重(根 系生物量)、根系分支数、最大入土深度均显著高于对比例1(p<0.01， versus对比例1)，且比对比例2也高(入土深度和分支数p<0.01， 根系干重p<0.05，versus对比例1)，这说明中华猕猴桃不定芽的根 系发育能力有了大幅度升高，且对NAA的最适浓度也发生了变化。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到， 在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和 修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的 所有这些变化和修改。