苎麻遗传转化受体系统建立及根癌农杆菌介导法遗传转化研究

摘要

苎麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)是我国重要的韧皮纤维作物之一,栽培和加工历史悠久。我国加入WTO后,随着市场需求和麻纺工业的发展,对原麻的品质要求越来越高,生产上对优良品种的需求也越柬越迫切。然而苎麻遗传背景复杂,现有的育种手段比较单一,育种周期较长。基因工程则能在较短时间里,将某些高产、抗逆或其他优良性状基因导入现有品种中,与传统育种手段相结合,将大大缩短育种进程。但是目前苎麻基因工程研究尚处在起步阶段,缺少能够应用的高效遗传转化体系。
　　 本研究从建立稳定高效的再生体系着手,建立了根癌农杆菌介导的苎麻子叶高效遗传转化体系,导入了GFP、PSAG12-ipt、Bt等报告或目的基因,并对苎麻直接体细胞胚胎发生和苎麻体细胞无性系变异进行了初步研究。主要研究结果如下:
　　 1.研究了供体苗龄、基本培养基类型、TDZ浓度、光照条件以及基因型等因素对不同外植体再生的影响,建立了苎麻不同外植体的稳定高效再生体系。研究表明。以上因素都能显著影响苎麻不同外植体再生。对于种子实生苗外植体而言,子叶和叶片都能直接再生出不定芽,苗龄4d的子叶为最佳外植体类型:品系“5041-3”的子叶最高再生频率达到了86.2％,再生芽个数为4.4个；最合适的基本培养基为MS无机盐+B5有机成分(MSB),TDZ浓度以0.5mg/L为最佳,与之搭配使用的适宜生长素为0.01mg/L IAA或者NAA,培养时16h光照/8h黑暗的光周期有利于不定芽的分化。对于试管苗外植体而言,应用以上再生体系也能获得高频率的再生,但以苗龄为60d的小植株上部的外植体为宜。从以上实验所得到的再生芽在附加1.0mg/L BA的MS培养基上进行伸长生长,然后在附加0.025mg/L NAA的1/2MS培养基中生根,炼苗15d后即可移栽到大田。
　　 2.研究了高浓度TDZ在苎麻子叶直接体细胞胚胎发生中的作用,初步建立了苎麻子叶直接体细胞胍胎发生的有效方法。结果表明,1.0-2.0mg/L TDZ和低浓度的IAA配合使用都能诱导苎麻子叶直接体细胞胚胎发生,最适合的培养基为附加2.0mg/L TDZ和0.005mg/L IAA的MS培养基,部分胚在附加0.5mg/L TDZ和0.01mg/L IAA的MS培养基上能发育成植株。
　　 3.利用流式细胞仪、RAPD技术对试管苗各外植体再生植株的遗传稳定性进行了研究。流式细胞仪检测结果表明,再生植株的DNA倍性没有发生改变:利用从100条引物中筛选出的43条RAPD引物对再生植株进行检测,直接从叶片产生的再生植株和从叶柄或茎段上经过了愈伤组织阶段产生的再生植株中都没有检测到RAPD扩增多态性,说明本研究建立的再生体系具有较好的遗传稳定性,不容易发生体细胞无件系变异。
　　 4.研究了外植体类型、农杆菌菌液浓度、子叶预培养、乙酰丁香酮(AS)、共培养的光照条件、共培养温度、共培养时间、共培养培养基的pH值对转化效率的影响,建立了高效的农杆菌介导苎麻遗传转化体系。实验结果表明:不进行预培养的子叶是最有效的受体类型,利用0.25-0.8OD的农杆菌菌液,在共培养培养基中加入50-100mg/L AS,在温度20℃、培养基pH5.8-5.9的黑暗条件下共培养48-72h能够获得较高的转化效率。经过验证,用以上参数建立的转化体系对于其他基因型依然有效,最高的抗性芽再生频率达到了25％左右。对抗性植株分别进行GUS、卡那霉素涂抹、PCR和Southern杂交检测,证实外源基因已经整合到苎麻基因组中,并能有效表达。
　　 5.利用建立的遗传转化体系转化不同基因型苎麻,分别得到了转GFP、PSAG12-ipt、Bt基因植株。对转GFP基因植株的荧光检测表明,GFP能在再生植株中高效表达:转PSAG12-ipt基因植株叶片表现出了明显的延缓衰老特性,且有2株转基因植株发生了形态学上的变异。

目录

文摘

英文文摘

缩写词表

第一章 文献综述

1.1 植物转基因概述

1.2 根癌农杆菌介导的植物遗传转化研究进展

1.2.1 根癌农杆菌的生物学特性

1.2.2 根癌农杆菌Ti质粒的结构和功能

1.2.3 根癌农杆菌Ti质粒的转化机理

1.2.4 根癌农杆菌介导的遗传转化体系的建立

1.2.5 影响转化效率的主要因素

1.2.6 转基因植物的证据

1.3 苎麻组织培养及遗传转化研究进展

1.3.1 苎麻组织培养研究进展

1.3.2 苎麻遗传转化研究进展

1.4 苎麻分子标记、功能基因等研究进展

1.4.1 苎麻分子标记研究进展

1.4.2 苎麻功能基因研究进展

1.5 苎麻组织培养、遗传转化研究等存在的问题

1.5.1 苎麻组织培养研究存在的问题

1.5.2 苎麻遗传转化研究存在的问题

1.5.3 苎麻分子标记、功能基因研究存在的问题

1.6 本研究的目的和意义

1.6.1 苎麻遗传转化高效受体系统的建立

1.6.2 苎麻体细胞无性系变异的研究

1.6.3 根癌农杆菌介导苎麻遗传转化体系的建立

1.6.4 转绿色荧光蛋白基因(GFP)、异戊烯基转移酶基因(ipt)、苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因(Bt)苎麻再生植株的获得

第二章 苎麻遗传转化受体系统的建立

前言

2.1 种子实生苗各外植体再生体系的建立

2.1.1 材料和方法

2.1.2 结果与分析

2.2 试管苗各外植体再生体系的建立

2.2.1 材料和方法

2.2.2 结果与分析

2.3 苎麻体细胞无性系变异的研究

2.3.1 材料和方法

2.3.2 结果与分析

2.4 讨论

2.4.1 高效遗传转化受体系统的建立

2.4.2 关于苎麻外植体的再生方式

2.4.3 关于影响再生的因素

2.4.4 TDZ在苎麻组织培养研究上的应用前景

2.4.5 RAPD技术在苎麻体细胞无性系变异研究中的可行性

2.4.6 本研究有待改进之处

第三章 苎麻直接体细胞胚胎发生初探

前言

3.1 材料和方法

3.1.1 材料

3.1.2 无菌苗的培育和外植体的准备

3.1.3 子叶培养方法

3.1.4 胚状体的成熟

3.1.5 培养基配制、培养条件、数据分析

3.2 结果与分析

3.2.1 直接体细胞胚胎发生的过程和特点

3.2.2 TDZ和IAA浓度对直接体细胞胚胎发生的影响

3.2.3 培养条件对直接体细胞胚胎发生的影响

3.2.4 培养基组分对体细胞胚成熟的影响

3.3 讨论

第四章 农杆菌介导苎麻遗传转化体系的建立

前言

4.1 材料和方法

4.1.1 植物材料

4.1.2 菌株和质粒

4.1.3 无菌苗的培育和外植体的准备

4.1.4 卡那霉素(Km)、羧苄青霉素(Carb)和头孢霉素(Cef)对苎麻子叶再生以及Km对种子发芽和生长的影响

4.1.5 根癌农杆菌介导苎麻遗传转化体系

4.1.6 培养基的配制

4.1.7 培养条件

4.1.8 数据分析

4.1.9 遗传转化的检测

4.2 结果与分析

4.2.1 Km、Carb以及Cef对子叶再生以及Km对种子发芽和生长的影响

4.2.2 根癌农杆菌介导苎麻遗传转化体系的建立

4.2.3 遗传转化的检测

4.3 讨论

4.3.1 三种常用抗生素在苎麻遗传转化中的作用

4.3.2 影响苎麻遗传转化的主要因子

4.3.3 优化遗传转化参数所使用的方法

4.3.4 苎麻转基因植株的检测方法

4.3.5 本研究建立的遗传转化体系的应用前景

第五章 转GFP、PSAG12-ipt、Bt基因苎麻的获得

前言

5.1 材料和方法

5.1.1 植物材料

5.1.2 菌株和质粒

5.1.3 遗传转化

5.1.4 GFP表达荧光检测

5.1.5 数据统计与分析

5.2 结果与分析

5.2.1 转GFP基因植株的获得

5.2.2 转PSAG12-ipt基因植株的获得

5.2.3 转Bt基因植株的获得

5.3 讨论

5.3.1 GFP在苎麻遗传转化研究中利用的可行性

5.3.2 PSAG-ipt基因在苎麻中的潜在利用价值

5.3.3 关于几个不同菌株对苎麻子叶的侵染能力

第六章 结论与展望

6.1 建立了苎麻高效稳定的再生体系

6.2 对苎麻体细胞无性系变异进行了初步研究

6.3 建立了根癌农杆菌介导苎麻子叶高效遗传转化体系

6.4 获得了转GFP、PSAG12-ipt、Bt等基因的植株

参考文献

附录

致谢