一种针对胶质瘤细胞及其依赖血管的药物递送系统

摘要

本发明属于药物制剂领域，涉及一种针对脑胶质原位瘤的靶向药物递送系统及其制备方法。本发明构建了一种可靶向脑胶质瘤递药的载药系统。本递药系统以生物可降解，体内相容性好的聚乳酸为原料制成纳米制剂(NP)，通过在其表面修饰聚乙二醇延长在体内的循环时间，同时采用共价连接的方式，在其表面修饰靶向功能分子达到靶向递药的目的，经体内外实验表明，本递药系统能特异性的在肿瘤部位聚集，药效结果显示其具有显著的抗肿瘤效果，显示了其在临床应用上的广大前景。

说明书

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及靶向递送药物系统，具体涉及一种将化学药 物包载于递药系统内部，通过表面修饰功能性的靶向分子达到特异性递药的靶向 递药系统。

背景技术

现有技术公开了脑部肿瘤是中枢神经系统常见的恶性疾病，而其中脑胶质瘤 是发病最广，恶性程度最高，治疗难度最大以及术后易复发的脑部肿瘤。据统计， 脑胶质瘤(脑胶质细胞瘤)约占颅内肿瘤的46％。世界卫生组织1998年公布按 死亡率顺序排位，恶性胶质瘤是34岁以下肿瘤患者的第2位死亡原因，是35～ 54岁患者的第3位死亡原因。胶质细胞瘤偏良性者生长缓慢，病程较长，自出 现症状至就诊时间平均两年；恶性者瘤体生长快，病程短，自出现症状到就诊时 多数在3个月之内，70％～80％多在半年之内。目前临床上针对脑胶质瘤的主要治 疗方法仍以手术切除、化学疗法以及放射疗法为主。虽然这些方法能一定程度的 缓解患者症状，但手术切除常有肿瘤残余，并在短时间内引起肿瘤的强势复发， 而化学疗法以及放射疗法在对肿瘤部位杀伤的同时，也对正常部位有着很大的损 害。因此，探寻一种安全有效的治疗方式，在获得良好治疗效果的同时减少因治 疗而引起的副作用，成为胶质瘤治疗的热点。

建立在生物可降解材料基础上的纳米载体，具有诸多优点：生物相容性好， 粒径小使其可充分利用肿瘤血管的高渗透性和滞留效应从而选择性的在肿瘤部 位聚集，载药量高以及能够在体内长时间循环等。此外，通过在纳米粒表面连接 具有靶向性的分子，能够达到靶向递药的目的，在增大疗效的同时，也大大降低 了毒副反应。人音猬因子是一种广泛表达于多种肿瘤细胞(脑胶质瘤等)和少量 表达在新生血管细胞的受体，而在正常组织细胞中几乎不表达。多肽CVNHPAFAC (C肽)是采用噬菌体技术获得的特异性多肽，其能高效靶向肿瘤细胞上高表达 的人音猬因子。血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)，是一种熟知且广泛表达于 新生血管内皮细胞的受体，随之发现的HTMYYHHYQHHL(K237肽)已被多种研究 证明具有很好的肿瘤新生血管靶向性。近年来有研究表明，在较低级数脑胶质瘤 中，除新生血管外，同时有较多拟态血管(VasculogenicMimicry，VM)的存在， 与新生血管不同，VM不由内皮细胞构成，而是由肿瘤细胞直接分化形成。因此， 一般抗新生血管的药物虽然能够破坏和抑制肿瘤中新生血管及形成，但VM的存 在能够继续供给肿瘤所需营养，从而降低抗肿瘤的效果，甚至引起肿瘤的复发。 已有研究表明，VEGFR-2在拟态血管的形成和生长过程中起到关键作用，因而， K237肽能够起到VM靶向作用。有研究利用氨基酸序列GYG将CVNHPAFAC与K237 肽连接成为一种新的功能靶向分子CK肽，该多肽不仅能够同时靶向肿瘤细胞和 肿瘤新生血管内皮细胞，同时能够特异性的针对肿瘤中的拟态血管递送化疗药 物，这为现有多种靶向递药系统所不具备。

本申请的发明人拟提供一种新型多肽修饰载紫杉醇的纳米递药系统，以达到 靶向脑胶质瘤细胞及其新生血管和拟态血管的目的。

发明内容

本发明的目的是构建一种新型多肽修饰载紫杉醇的纳米递药系统，通过靶向 杀灭脑胶质瘤细胞及诱导脑胶质瘤生长所依赖血管凋亡而最终达到抗脑胶质瘤 的目的。

本发明以可降解以及生物相容性好的聚乳酸为材料，广谱性抗肿瘤药紫杉醇 为模型药制备成大小均一的纳米载药系统，同时在其表面通过共价连接的方式修 饰CK肽，以达到靶向脑胶质瘤细胞及其新生血管和拟态血管的目的。

本发明所采用的模型药物为广谱性抗癌药物紫杉醇(PTX)，可通过市场渠道 获得；所述的紫杉醇通过促进微管蛋白聚合抑制解聚,保持微管蛋白稳定，抑制 细胞有丝分裂。

本发明所采用的多肽为两种不同多肽的结合体，其中一种以人音猬因子为受 体，其序列为CVNHPAFAC(C肽)；另一种多肽的受体为血管内皮生长因子受体 -2(VEGFR-2)，其序列为HTMYYHHYQHHL-NH2(K237肽)。

本发明所涉及的音猬因子在多种肿瘤的发生过程中起到重要的作用，其在肿 瘤细胞中大量的存在并少量分布于肿瘤新生血管内皮细胞；VEGFR-2在肿瘤新生 血管内皮细胞具有大量的表达，同时也存在于拟态血管中；通过GYG的连接，将 K237肽与C肽结合后修饰在纳米递药系统的表面，不仅能够发挥C肽对胶质瘤 细胞的靶向功能以及增强对脑胶质瘤中新生血管靶向性，而且能够特异性的靶向 肿瘤中的拟态血管。

本发明经体内体外实验结果表明，制备的递药系统具有很强的靶向特性以及 显著的抗肿瘤效果。

本发明中，以人源母胶质瘤细胞U87为肿瘤细胞模型，人脐静脉内皮细胞 HUVEC为新生血管内皮细胞模型，此两种细胞均为本领域所公认且熟知。

更具体的，本发明提供的针对肿瘤细胞和肿瘤依赖血管的药物递送系统，其 特征在于，以羧基聚乙二醇聚乳酸(COOH-PEG-PLA)为材料制备成大小一致的载药 系统，其表面的聚乙二醇增加递药系统在体内的循环时间，将靶向功能分子通过 共价连接的方式与载药系统表面的羧基相连，达到靶向递药的目的。

本发明中，靶向功能分子是一种对胶质瘤具有强亲和性的多肽(文中以CK 肽命名)，其氨基酸序列如下所示：

CVNHPAFACGYGHTMYYHHYQHHL-NH2

所述的靶向功能分子的受体广泛分布于脑胶质瘤细胞和肿瘤新生血管细胞 及拟态血管。

本发明中，所述羧基聚乙二醇(COOH-PEG)的分子量为2000-8000Da；所 述羧基聚乙二醇聚乳酸(COOH-PEG-PLA)的分子量为20000-50000Da；本发明 的一个实施例中，采用单甲氧基聚乙二醇聚乳酸(MPEG-PLA)，其分子量为20000 -50000Da。

本发明提供了该递药系统的制备方案，其包括，采用乳化溶媒蒸发法的制备 本递药系统大小一致的纳米制剂，其中，所用水相介质包括，以质量体积比为 1:100的胆酸钠溶液作为乳化剂中的水相，以及质量体积比为0.5:100的胆酸钠 水溶液作为分散介质的水相；超声条件为：超声时间2.4min，间隔2s，功率 240W，在冰水浴条件下进行，制得的本递药系统的粒径在100-200nm之间，其 具有良好的粒径分布。

本发明提供了该系统体内外定性定量表达的结果以药效学的评价。

本发明通过细胞特异性摄取，体内药效学试验表明，该递药系统能够特异性 的在胶质瘤细胞和新生血管内皮细胞中聚集，并对靶向细胞有特异性的杀伤作 用；活体成像技术以及药效学评价也显示，该递药系统具有良好的体内肿瘤靶向 性以及明显的抗肿瘤效果。

本发明所制得的靶向递药系统其给药方式为静脉注射。

本发明根据肿瘤血管的渗透和滞留效应以及在已有研究基础上，构建了一种 可靶向脑胶质瘤递药的载药系统。本递药系统以生物可降解，体内相容性好的聚 乳酸为原料制成的纳米制剂(NP)，通过在其表面修饰聚乙二醇延长在体内的循环 时间，同时采用共价连接的方式，在其表面修饰靶向功能分子达到靶向递药的目 的；经体内外实验表明，本递药系统能特异性的在肿瘤部位聚集，具有显著的抗 肿瘤效果，显示了其在临床应用上的广大前景。

附图说明

图1是递药系统的粒径分布图，

图A、B分别为NP及CK-NP的粒径分布图。

图2是HUVEC细胞对载香豆素纳米粒摄取的定性和定量结果，

图A是HUVEC细胞对NP及CK-NP二种载香豆素纳米粒的定性摄取图片，图 B为定量结果。

图3是U87细胞对载香豆素纳米粒摄取的定性和定量结果，

图A是U87细胞对NP及CK-NP二种载香豆素纳米粒的定性摄取图片，图B 为定量结果。

图4是载紫杉醇纳米粒体外抗肿瘤拟态血管的定性和定量结果，

图A为明场拍摄的定性照片，图B是通过计算所得的定量抑制结果。

图5是采用活体成像技术所拍摄的载DIR纳米粒的组织分布图，

图A、B分别为NP及CK-NP在荷瘤小鼠体内的分布图。

图6是载紫杉醇靶向递药系统对荷瘤动物的药效学评价结果。

具体实施方式

实施例1载紫杉醇靶向递药系统的制备和表征

纳米粒采用乳化溶媒法制备：将22.5mg的MPEG-PLA和2.5mg的 COOH-PEG-PLA用1mL二氯甲烷溶解，并加入PTX使其浓度为0.5mg/mL，随后 加入2mL1％的胆酸钠溶液；冰水浴冲超声2.4min(间隔时间2s，功率为240 W)，10mL0.5％胆酸钠溶液分散5min。旋转蒸发除去二氯甲烷后，在4℃条 件下，14500rpm离心1h，即得普通载药纳米粒(NP-PTX)；

制备具有靶向功能递药系统：在普通纳米粒的基础上，通过多肽中的NH2- 和纳米粒表面的-COOH共价连接制成具有靶向功能递药系统，其包括：先用N,N’ -二环己基碳二亚胺(EDC)和N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)避光活化纳米粒表面 的-COOH0.5h；14500rpm离心45min后，蒸馏水重悬，然后按摩尔比1:1加 入功能性多肽溶液，避光反应4h得所需递药系统(CK-NP-PTX)；

纳米粒的表征：采用透射电子显微镜观察其形态，采用马尔文粒径测定仪测 定纳米粒的粒径，结果显示：NP以及CK-NP的粒径分别为104.6nm以及119.9nm， 表明功能性多肽的引入对纳米粒的粒径未产生显著性影响，定性图显示，二种纳 米载体均大小均一，形态圆整。

实施例2HUVEC细胞对载香豆素纳米粒的摄取

将HUVEC细胞以每孔5000个的密度接种于96孔板上，24h后，分别与50-400 μg/mL不同浓度梯度的载香豆素NPs和CK-NPs37℃共同孵育1h，然后用PBS (磷酸缓冲盐溶液，PH7.4)清洗3次，4％多聚甲醛固定15min后，荧光显微 镜下观察细胞摄取的定性结果；定量实验时，在上述4％多聚甲醛固定15min后， 用2μg/mLHochest33258染核10min，最后加入200μLPBS，其定量结果通 过高内涵读取获得，结果表明CK-NP相比于NP具有更强的摄取效果，显著增强 了HUVEC细胞的摄取效果。

实施例3U87细胞对载香豆素纳米粒的摄取

将U87细胞以每孔5000个的密度接种于96孔板上，24h后，分别与50-400 μg/mL不同浓度梯度的载香豆素NPs和CK-NPs37℃共同孵育1h，然后用PBS 清洗3次，4％多聚甲醛固定15min后，于荧光显微镜下观察细胞摄取的定性结 果；定量实验时，在上述4％多聚甲醛固定15min后，用2μg/mLHochest33258 染核10min，最后加入200μLPBS，其定量结果通过高内涵读取获得，结果显 示CK肽修饰后的载香豆素纳米粒在U87细胞中具有更好的摄取效果，印证了其 对胶质瘤细胞的靶向性。

实施例4体外拟态血管形成抑制实验

将50μL基质胶加入到预冷好的96孔板中，37℃孵育1h后取出，然后将 对数生长期的U87细胞用胰酶消化并离心，再以含不同PTX制剂(紫杉醇溶液剂 Taxol，NP-PTX,C-NP-PTX以及CK-NP-PTX，并分别稀释成如下浓度：1,5and 10nM)的细胞培养液重悬细胞，以每孔2-3×10⁴个的密度接种于孔板上，细胞 培养箱孵育10h后明场拍摄；

结果显示：Taxol与NP-PTX对拟态血管具有微弱毒性作用，而与CK-NP 共孵育组的拟态血管形成受到了明显的拮抗作用，表明CK肽修饰的递药系统能 够针对拟态血管形成毒性作用。并且随着浓度的提高，抑制效果更为明显。

实施例5纳米递药系统在荷瘤动物体内的分布实验

荷原位胶质瘤动物模型的建立：取对数生长期的U87细胞，胰酶消化后离心， 用适量PBS重悬使浓度为5×10⁸cells/mL；取4～6周、20g左右雄性 BALB/c裸鼠，用5％水合氯醛麻醉，置于立体定位仪上，于前囟右侧1.8mm、深 3mm处注射5μL的细胞悬液，10min后退针并用骨蜡封住针孔；

采用活体成像考察递药系统的脑肿瘤靶向性：细胞接种第10天，裸鼠分别 尾静脉注射2mg/kg载DiR碘化物(1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethyl indotricarbocyanineIodide)的NPs或CK-NPs；裸鼠腹腔注射0.2mL5％水合 氯醛麻醉，置于活体成像仪内，注射后一定时间进行荧光扫描(600～900nm)， 注射后24h，将裸鼠麻醉，按常规处理，对裸鼠心、肝、脾、肺、肾以及荷肿 瘤脑进行荧光扫描(600～900nm)，考察纳米粒在所述各组织的分布；

结果显示：与NP组相比，CK-NP组能够显著增强在脑胶质瘤的聚集，器官 分布显示，CK肽修饰后的递药系统不仅能够集中分布于胶质瘤中，此外，其在 正常组织部位的分布明显少于NP组，显示了良好的靶向特性。

实施例6载药纳米粒的体内药效学评价

按实施例5中建立荷原位脑胶质瘤动物模型，并以每组6只分成5组，在两 周内以每三天分别尾静脉注射Taxol，NP-PTX,CK-NP-PTX(PTX的浓度为5mg/kg) 以及生理盐水，并记录各组的生存死亡情况；实验结果显示：各给药组的中位生 存期分别为Taxol(22天)，NP-PTX(27天)以及CK-NP-PTX(55天)，而给以 生理盐水组的中位生存期则为18.5天；NP组的中位生存期明显高于生理盐水和 Taxol组，表明该纳米递药系统能够通过被动靶向少量进入肿瘤组织，而当注 射CK肽修饰的纳米递药系统后，小鼠中位生存期延长了36.5天，结果表明，CK-NP 能够大量进入肿瘤部位，结果证实CK肽具有较强的肿瘤靶向特性。