草莓属植物的炭疽病抵抗性相关标志物及其利用

摘要

对于草莓属植物开发多种DNA标志物，通过使用这些多种DNA标志物来高精度地判定炭疽病抵抗性。草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物，包含草莓属植物的染色体中的由序列号1所示的碱基序列和序列号10所示的碱基序列所夹的连续的核酸区域。

说明书

技术领域

本发明涉及能够筛选对草莓炭疽病显示抵抗性的草莓属植物系统的 炭疽病抵抗性相关标志物及其利用方法。

背景技术

通过开发DNA标志物(也称为遗传标志物、基因标志物)，能够在植 物的品种改良中迅速且有效地辨别有用性状、不良性状的有无。DNA标志 物的开发不仅在拟南芥、稻等模型植物、而且在各种各样的实用植物中进 展，对于品种改良发挥了巨大作用。

非专利文献1中有在栽培草莓中开发综合型高密度连锁图谱的报告。 根据非专利文献1，虽然以前有包含约300个扩增片段长度多态性 (amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP)标志物的连锁图谱的报 告，但由于具有8倍体和复杂的基因组，因而对于栽培草莓要求开发更高 密度的连锁图谱。另外，在非专利文献1中，对于野草莓(F.vessca)和草莓 (F.×ananassa)开发了简单重复序列(simplesequencerepeat)标志物，构建了 综合型高密度连锁图谱。具体地，使用02-19、Sachinoka(幸香)、Kaorino、 Akihime(章姬)和0212921的5个品种·系统制作连锁图谱，将他们综合 起来制成1个综合型高密度连锁图谱。在非专利文献1中，对于02-19开 发了575个标志物、对于Sachinoka(幸香)开发了556个标志物，对于 Kaorino开发了294个标志物，对于Akihime(章姬)开发了318个标志物， 以及对于0212921开发了822个标志物。但是，在非专利文献1所公开的 综合型高密度连锁图谱中，存在无座上的标志物数的连锁群，特别是在标 志物数少的Kaorino、Akihime(章姬)中该倾向显著。进而，考察到非专利 文献1所公开的综合型高密度连锁图谱并未覆盖全部的连锁图谱。

另外，非专利文献2中记载为了有效地开发草莓炭疽病抵抗性品种， 开发了与草莓炭疽耐病性连锁的DNA标志物。非专利文献2中通过随机 扩增多态性DNA法(RandomAmplifiedPolymorphicDNA法，RAPD法)、 AFLP法和SSR法使用标志物制作连锁图谱，分析耐病性连锁标志物。其 结果根据非专利文献2，通过在将草莓中间母本农2号杂交而得的集团中 利用，能够将育种集团减少到1/8，能够开发能以约70％的概率辨别耐病 性系统的标志物。

此外，关于草莓炭疽病，如非专利文献3所记载的那样，已知苹果炭 疽病菌(Glomerellacingulate)和辣椒炭疽病菌(Colletotrichumacutatum)是 其病原菌。

另一方面，例如，专利文献1中公开开发了甜菜黑根病抵抗性品种筛 选标志物，专利文献2中对于玉米公开了利用与目的性状连锁的标志物的 筛选技术。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：DNAResearch20,79-92,(2013)

非专利文献2：枥木县农业试验场研究成果集第29号，第51～52页

非专利文献3：Microbiol.Cult.Coll.,25(1):27-32,2009

专利文献

专利文献1：WO2007/125958

专利文献2：日本特开2010-516236号公报

发明内容

发明所要解决的课题

但是，现状是上述的在甜菜、玉米中开发出的DNA标志物技术在草 莓属植物中几乎没有进行。非专利文献1虽然记载了开发了SSR标志物、 构建了综合型高密度连锁图谱，但是对于在多倍体且复杂的基因组结构的 草莓属植物中筛选与目的性状连锁的DNA标志物来说不能说是充分的。 另外，非专利文献2中虽然记载开发了与草莓炭疽病耐病性连锁的DNA 标志物，但作为QTL分析的结果不能说LOD(优势对数，logarithymofodds) 值、贡献率高，不能评价为优异的标志物。

于是，本发明鉴于上述事实，目的在于对于多倍体且复杂的基因组结 构的草莓属植物开发多种DNA标志物，提供通过使用这些多种DNA标志 物而能够高精度地判定炭疽病抵抗性的炭疽病抵抗性相关标志物及其利用 方法。

用于解决课题的技术方案

本发明者们为了解决上述课题而反复进行了深入研究，结果通过准备 草莓属植物中的多种标志物，通过杂交后代系统中的量的性状与标志物的 连锁分析，发现了与炭疽病抵抗性这样的量的性状连锁的标志物，从而完 成了本发明。

本发明包含以下(1)～(7)。

(1)草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物，包含草莓属植物的染色体 中的由序列号1所示的碱基序列和序列号10所示的碱基序列所夹的连续的 核酸区域。

(2)根据(1)所述的草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物，其特征在于， 所述核酸区域包含选自由序列号1～10组成的群组中的任一碱基序列或该 碱基序列的一部分。

(3)根据(1)所述的草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物，其特征在于， 所述核酸区域位于草莓属植物的染色体中的由序列号4所示的碱基序列和 序列号8所示的碱基序列所夹入的区域。

(4)炭疽病抵抗性提高了的草莓属植物系统的制造方法，包括以下工 序，

提取工序：提取至少一方亲本是草莓属植物的后代植物的染色体和/ 或该亲本草莓属植物的染色体，和

测定工序：测定上述(1)～(3)的任一项所述的草莓属植物炭疽病抵抗性 相关标志物在上述所得的染色体中存在还是不存在。

(5)根据(4)所述的草莓属植物系统的制造方法，其特征在于，在所述 测定工序中，使用特异性地扩增所述草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物 的引物，通过核酸扩增反应，来测定该草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志 物存在还是不存在。

(6)根据(4)所述的草莓属植物系统的制造方法，其特征在于，在所述 测定工序中，使用具备与所述草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物对应的 探针的DNA芯片。

(7)根据(4)所述的草莓属植物系统的制造方法，其特征在于，所述后 代植物是种子或幼苗，由该种子或幼苗提取染色体。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2013-186688 号、2014-165405号的说明书和/或附图所记载的内容。

发明的效果

根据本发明，能够提供在草莓属植物中的量的性状中与炭疽病抵抗性 连锁的新的草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物。通过利用本发明所涉及 的草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物，能够检验草莓属植物的杂交系统 中的炭疽病抵抗性。由此，能够以非常低的成本识别具有炭疽病抵抗性提 高了的特性的草莓属植物系统。

附图说明

图1是显示获得草莓属植物染色体的标志物时使用的DNA微阵列的 制造流程的模式图。

图2是显示使用了DNA微阵列的信号检测的工序的模式图。

图3是显示对于实施例中使用的草莓属植物品种·系统群在2012年 10月19日调查的炭疽病抵抗性数据的特性图。

图4是显示关于炭疽病抵抗性的QTL分析的结果(草莓中间母本农2 号中的第23连锁群)的特性图。

图5是显示各系统中的IA204069的信号值的特性图。

图6是显示各系统中的IA204291的信号值的特性图。

图7是显示各系统中的IA202531的信号值的特性图。

图8是显示各系统中的IA200064的信号值的特性图。

图9是显示各系统中的IA205184的信号值的特性图。

图10是显示各系统中的IA202854的信号值的特性图。

图11是显示各系统中的IA200826的信号值的特性图。

图12是显示各系统中的IA202631的信号值的特性图。

图13是显示各系统中的IA202517R的信号值的特性图。

图14是显示各系统中的IA201502的信号值的特性图。

图15是显示将标志物IA200826进行PCR扩增而得的结果的电泳照 片。

图16是显示将标志物IA202631进行PCR扩增而得的结果的电泳照 片。

图17是将图3所示的炭疽病抵抗性数据与标志物IA200826的基因型 数据进行比较显示的特性图。

图18是显示在草莓品种さちのか(幸香)、草莓中间母本农2号和杂交 后代2系统(A和B)中将标志物IA202631和标志物IA200826进行PCR扩 增而得的结果的电泳照片。

图19是显示在草莓品种さちのか(幸香)、草莓中间母本农2号和杂交 后代2系统(A和B)中将包含标志物IA202631和标志物IA200826的区域 进行PCR扩增而得的结果的电泳照片。

图20是显示将标志物IA202531进行PCR扩增而得的结果的电泳照 片。

图21是显示将标志物IA200064进行PCR扩增、再进行限制性酶处 理而得的结果的电泳照片。

具体实施方式

以下，对于本发明所涉及的草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物及其 利用方法、特别是使用了草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物的草莓属植 物系统的制造方法进行说明。

＜草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物＞

本发明所涉及的草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物是存在于草莓属 植物的染色体上的特定区域，具有能够辨别草莓属植物炭疽病抵抗性这种 性状的功能。即，通过在使用已知的草莓属植物而得的后代系统中，确认 草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物存在还是不存在，能够判断是否是具 有炭疽病抵抗性提高这种性状的系统。此外，在本发明中，草莓炭疽病如 Microbiol.Cult.Coll.,25(1):27-32,2009所记载的那样，是指由于感染苹果 炭疽病菌(Glomerellacingulate)和/或辣椒炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)而形成病斑的疾病。特别是在本发明中草莓炭疽病可以是由感染 苹果炭疽病菌(Glomerellacingulate)而引起的疾病。

另外，草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物是包含与炭疽病抵抗性提 高的性状连锁的标志物、和与炭疽病抵抗性降低的性状连锁的标志物两者 的含义。例如，在特定的草莓属植物中，如果前者的标志物存在，就能够 判断为炭疽病抵抗性提高了的品种。进而，在特定的草莓属植物中，如果 前者的标志物存在、且后者的标志物不存在，就能够更高精度地判断为炭 疽病抵抗性提高了的品种。此外，在特定的草莓属植物中，仅凭后者的标 志物不存在，也可以判断为炭疽病抵抗性提高了的品种。

特别是，认为前者的草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物是与草莓属 植物的炭疽病抵抗性这种性状的原因基因(群)连锁的区域。

其中，草莓属植物是包含属于蔷薇科草莓属(FragariaL.)的全部植物的 含义。即，作为草莓属植物，可列举作为一般的栽培草莓的荷兰草莓 (Fragaria×ananassa)等杂交种。另外，作为草莓属植物，可以列举作为栽 培草莓的祖先种的北美草莓(F.virginiana)以及智利草莓(F.chiloensis)、野 草莓(F.vesca，白花蛇莓)、能乡草莓(F.iinumae)、日本草莓(F.nipponica)、 西藏草莓(F.nubicola)、布查草莓(F.bucharica)、裂萼草莓(F.daltoniana)、 东方草莓(F.orientalis)、F.corimbosa、麝香草莓(F.moschata)和择捉草莓 (F.iturupensis)等野生种。进而，作为草莓属植物，是也包含栽培草莓(F.× ananassa)中的已知的品种·系统的含义。作为栽培草莓中的已知的品种· 系统，不特别限定，是包含能在日本国内使用的所有品种·系统、在日本 国外使用的品种·系统等的含义。例如，作为栽培草莓的日本国内育成品 种，不特别限定，可以列举とよのか(丰香)、サンチーゴ、純ベリー、女 峰、ピーストロ、リンダモール、とちおとめ(枥乙女)、アイストロ、栃 の峰(枥峰)、章姬、紅ほっぺ(红颜)、とちひめ(枥姬)、さちのか(幸香)、 けいきわせ、さがほのか(佐贺清香)、アイベリー、カレンベリー、レッ ドパール、さつまおとめ(萨摩乙女)、福冈S6(あまおう)、浓姬、ひのみ ね(日峰)和宝交早生等。另外，作为栽培草莓的品种，可以列举草莓中间 母本农1号和草莓中间母本农2号，它们是作为为了获得规定的特性而在 品种改良中利用的育种材料的中间母本。草莓中间母本农2号是由作为炭 疽病抵抗性的育成系统的83118-41与抵抗性品种Dover的杂交而育成的育 种材料。此外，草莓中间母本农2号的炭疽病抵抗性与抵抗性品种宝交早 生、Dover为同程度以上，另外在与患病性品种的杂交实生集团中高度抵 抗性个体的出现率高，被用于具有草莓炭疽病抵抗性的新品种育成。

作为确认草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物存在还是不存在的对象 植物，可以是上述的草莓属植物、利用了上述的草莓属植物的后代系统。 后代系统只要母本和父本任一方是上述的草莓属植物即可，既可以是由所 谓同种杂交产生的系统，也可以是种间杂交系统。另外，后代系统也可以 通过所谓回交来获得。

特别优选以栽培草莓(F.×ananassa)作为对象，确认草莓属植物炭疽病 抵抗性相关标志物存在还是不存在。进而，优选在使用了栽培草莓中的上 述的各种品种·系统的品种改良中，确认草莓属植物炭疽病抵抗性相关标 志物存在还是不存在。即，此时，能够对于制作的新品种辨别草莓炭疽病 抵抗性。于是，作为新品种，优选是以具有草莓炭疽病抵抗性的品种作为 至少一方的亲本而得到的品种。更详细地说，能够对于以例如草莓中间母 本农2号作为一方的亲本而制作的新品种，确认草莓属植物炭疽病抵抗性 相关标志物存在还是不存在，评价草莓炭疽病抵抗性。

本发明所涉及的草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物，是通过使用了 包含由栽培草莓：さちのか(幸香)获得的1,502个标志物和由草莓中间母本 农2号获得的2,162个标志物的基因连锁图谱、和草莓炭疽病抵抗性数据 的QTL(数量性状位点，QuantitativeTraitLoci)分析而新鉴定的。此外， 草莓炭疽病抵抗性被认为与多种基因相关，是采取连续分布的量的性状。 即，草莓炭疽病抵抗性基于采取连续分布的对草莓炭疽病的罹患率来评价。 QTL分析中使用遗传分析软件QTLCartographer(WangS.,C.J.Basten, andZ.-B.Zeng(2010).WindowsQTLCartographer2.5.Departmentof Statistics,NorthCarolinaStateUniversity,Raleigh,NC)，应用复合区间作 图(Compositeintervalmapping,CIM)法。

具体地，通过上述的QTL分析，在上述基因连锁图谱中发现了LOD 得分(LODscore)为规定的阈值(例如2.5)以上的区域。该区域为约 29.0cM(厘摩尔根)，是包含在草莓中间母本农2号的第23连锁群中的区域。 其中，“摩尔根(M)”是显示染色体上的基因间的相对距离的单位，是以 交换值为百分数的值。在草莓属植物的染色体中，1cM相当于约400kb。 此外，该区域中存在LOD得分为约18.3的峰，提示在该峰位置或其附近 存在提高草莓属植物炭疽病抵抗性的性状的原因基因(群)。

该29.0cM的区域中依次包含表1所示的10种标志物。此外，在表1 中标志物名是对本发明中独自获得的标志物所赋予的名称。

表1

即，本发明所涉及的草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物是由草莓属 植物的染色体中的序列号1所示的碱基序列和序列号10所示的碱基序列所 夹的连续的核酸区域。其中，所述29.0cM的区域所含的峰，存在于由序 列号4所示的碱基序列组成的标志物(IA200064)和由序列号8所示的碱基 序列组成的标志物(IA202631)所夹入的区域。

另外，该29.0cM的区域中包含与炭疽病抵抗性提高的性状连锁的标 志物、和与炭疽病抵抗性降低的性状连锁的标志物两者。在表1所示的10 种标志物中，由序列号9所示的碱基序列组成的标志物(IA202517R)是与炭 疽病抵抗性降低的性状连锁的标志物(相反标志物)，其他全部是与炭疽病 抵抗性提高的性状连锁的标志物。

可以使用表1所示的29.0cM的区域所含的连续的核酸区域作为草莓 属植物炭疽病抵抗性相关作为标志物。其中，核酸区域是指包含与存在于 草莓属植物的染色体的其他区域的同一性为95％以下，优选90％以下，更 优选80％以下，最优选70％以下的碱基序列的区域。只要成为草莓属植物 炭疽病抵抗性相关标志物的核酸区域与其他区域的同一性为上述范围，就 能够按照通用的方法特异性地检测该核酸区域。其中，同一性的值例如可 以使用BLAST利用默认参数计算出。

另外，成为草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物的核酸区域的碱基长 可以为至少8碱基长以上、优选15碱基长以上、更优选20碱基长以上、 最优选30碱基长。只要成为草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物的核酸区 域的碱基长为上述范围，就能够按照通用的方法特异性地检测该核酸区域。

特别作为草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物，优选从所述29.0cM的 区域所含的10种标志物中的由序列号4所示的碱基序列和序列号8所示的 碱基序列所夹入的区域中选择。这是因为上述峰存在于由序列号4所示的 碱基序列和序列号8所示的碱基序列所夹入的区域。

另外，作为草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物，还可以是包含从上 述表1所示的10种标志物中选择的1种标志物的核酸区域。例如，作为草 莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物，优选使用包含离峰的位置最近的由序 列号8所示的碱基序列组成的标志物(IA202631)的核酸区域。此时，包含 标志物的核酸区域的碱基序列，能够通过使用了基于该标志物的碱基序列 设计的引物的反向PCR等的邻近序列获得法来确定。

进而，可以从草莓属植物的染色体中的由序列号1所示的碱基序列和 序列号10所示的碱基序列所夹的核酸区域中，以多个区域作为草莓属植物 炭疽病抵抗性相关标志物。

进而另外，作为草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物，可以使用上述 10种标志物本身。即，可以以选自由序列号1～10的碱基序列组成的10 个区域中的1个或多个区域作为草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物。例 如，作为草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物，优选使用离峰的位置最近 的由序列号8所示的碱基序列组成的标志物(IA202631)。或者，也可以使 用例如由序列号7的碱基序列组成的标志物(IA200826)和由序列号8的碱 基序列组成的标志物(IA202631)所夹入的区域作为草莓属植物炭疽病抵抗 性相关标志物。

＜草莓属植物中的标志物的鉴定＞

在本发明中，如上所述，从由さちのか(幸香)获得的1,502个标志物和 由草莓中间母本农2号获得的2,162个标志物中确定了草莓属植物炭疽病 抵抗性相关标志物。这里对于这些1,502个和2,162个标志物进行说明。在 鉴定该标志物时，可以使用应用了日本特开2011-120558号公报、国际公 开公报2011/074510所公开的方法的DNA微阵列。

具体地，在该DNA微阵列中使用的探针的设计方法如图1所示，首 先，从さちのか(幸香)或者草莓中间母本农2号中提取基因组DNA(工序 1a)。接下来，将提取的基因组DNA用1种或多种限制性酶消化(工序1b)。 此外，在图1所示的例子中，依次使用限制性酶A和限制性酶B的2种限 制性酶消化基因组DNA。其中，作为限制性酶，不特别限定，例如，可以 使用PstI、EcoRI、HindIII、BstNI、HpaII、HaeIII等。特别是作为限制 性酶，可以考虑识别序列的出现频率等进行适宜选择，使得在完全消化基 因组DNA时形成20～10000碱基长的基因组DNA片段。另外，在使用多 种限制性酶的情况下，优选使用全部限制性酶后的基因组DNA片段为 200～6000碱基长。进而，在使用多种限制性酶的情况下，对供处理的限 制性酶的顺序不特别限定，另外，在处理条件(溶液组成、温度等)相同的 情况下，也可以将多种限制性酶在同一反应体系中使用。即，在图1所示 的例子中，依次使用限制性酶A和限制性酶B消化基因组DNA，但可以 将限制性酶A和限制性酶B在相同反应体系中同时使用来消化基因组 DNA，也可以依次使用限制性酶B和限制性酶A来消化基因组DNA。进 而，使用的限制性酶的数量可以为3种以上。

接下来，对限制性酶处理后的基因组DNA片段结合连接物(工序1c)。 其中，连接物只要是能够结合在通过上述的限制性酶处理而得的基因组 DNA片段的两端就不特别限定。作为连接物，例如，可以使用具有与通过 限制性酶处理而在基因组DNA的两末端形成的突出末端(粘末端)互补的 单链、并具有后述其详的扩增处理时使用的引物能够杂交的引物结合序列 的连接物。另外，作为连接物，也可以使用具有与上述突出末端(粘末端) 互补的单链、且具有用于在克隆时插入载体的限制性酶识别部位的连接物。

另外，在使用多种限制性酶消化基因组DNA的情况下，可以准备与 各限制性酶对应的多种连接物而使用。即，可以使用具有与用多种限制性 酶消化基因组DNA时生成的多种突出末端分别互补的单链的多种连接物。 此时，与多种限制性酶对应的多种连接物既可以具有使得相同的引物能够 杂交的相同的引物结合序列，也可以具有使得各自不同的引物能够杂交的 不同的引物结合序列。

进而，在使用多种限制性酶消化基因组DNA的情况下，作为连接物， 可以准备与从使用的多种限制性酶中选择的1种限制性酶、或使用的限制 性酶中的一部分限制性酶对应的连接物而使用。

接下来，扩增两末端附加了连接物的基因组DNA片段(工序1d)。在 使用了具有引物结合序列的连接物的情况下，通过使用能与该引物结合序 列杂交的引物来扩增上述基因组DNA片段。或者，可以将附加了连接物 的基因组DNA片段利用连接物序列克隆到载体中，使用能与该载体中的 规定的区域杂交的引物扩增基因组DNA片段。此外，作为使用了引物的 基因组DNA片段的扩增反应的一例，可以使用PCR。

另外，在使用多种限制性酶消化基因组DNA的同时，使与各限制性 酶对应的多种连接物与基因组DNA片段连接的情况下，通过使用了多种 限制性酶的处理而得的基因组DNA片段全部都连接了连接物。此时，通 过使用连接物所含的引物结合序列进行核酸扩增反应，能够扩增所得的全 部基因组DNA片段。

或者，在使用多种限制性酶消化基因组DNA的同时，使与选自所使 用的多种限制性酶中的1种限制性酶、或使用的限制性酶中的一部分限制 性酶对应的连接物与基因组DNA片段连接的情况下，能够仅扩增所得的 基因组DNA片段中两末端具有所选的限制性酶的识别序列的基因组DNA 片段。

接下来，确定所扩增的基因组DNA片段的碱基序列(工序1e)，确定 具有比该基因组DNA片段短的碱基长、覆盖基因组DNA片段内的至少一 部分的1个或多个区域，将所确定的1个或多个区域设计为栽培草莓中的 探针(工序1f)。对确定基因组DNA片段的碱基序列的方法不特别限定， 可以使用利用了应用桑格尔法等的DNA测序仪的现有公知的方法。其中， 作为设计的区域，如上所述，例如20～100碱基长、优选30～90碱基长、 更优选50～75碱基长。

如上，通过使用从栽培草莓提取的基因组DNA设计多种探针，基于 设计的探针的碱基序列在担载体上合成具有目的碱基序列的寡核苷酸，能 够制作DNA微阵列。通过使用这样制作的DNA微阵列，能够鉴定包含上 述的序列号1～10所示的10种草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物的 1,502个和2,162个标志物。

更具体地，本发明者们对于已知的栽培草莓品种さちのか(幸香)、草 莓中间母本农2号和它们的杂交后代系统(133个系统)使用上述的DNA微 阵列获得了信号数据。然后，从所得的信号数据获得基因型数据，以该基 因型数据为基础，使用遗传图谱制成软件AntMap(IwataH,NinomiyaS (2006)AntMap:constructinggeneticlinkagemapsusinganantcolony optimizationalgorithm.BreedSci56:371-378)，通过遗传距离计算式 Kosambi计算出染色体中的标志物的位置信息。进而，以获得的标志物的 位置信息为基础，通过Mapmaker/EXPver.3.0(AWhiteheadInstitutefor BiomedicalResearchTechnicalReport,ThirdEdition,January,1993)制成 遗传图谱数据片。其结果鉴定了包含上述的序列号1～10所示的10种草莓 属植物炭疽病抵抗性相关标志物的1,502个和2,162个标志物。

＜草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物的利用＞

通过利用草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物，能够对于炭疽病抵抗 性未知的草莓属植物(例如，后代系统)判断是否是显示炭疽病抵抗性的系 统。其中，所谓利用草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物，是包括利用特 异性地扩增包含该标志物的核酸片段的方法的方式、利用具有与该标志物 对应的探针的DNA微阵列的方式的含义。

所谓特异性地扩增包含草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物的核酸片 段的方法，是指利用所谓核酸扩增法。作为核酸扩增法，可列举使用设计 成特异性地扩增目的核酸片段的引物的方法、不使用引物而特异性地扩增 目的核酸片段的方法。

所谓特异性地扩增目的核酸片段的引物，是指能够通过核酸扩增法来 扩增包含如上所述定义的草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物的核酸片段 的寡核苷酸。作为使用引物的核酸扩增法，不特别限定，只要是以PCR(聚 合酶链反应，PolymeraseChainReaction)法为代表的使核酸片段扩增的方 法，就可以是任何方法。例如，除了PCR法以外，可以例示RCA(滚环扩 增，RollingCircleAmplification)法、CPT(循环探针技术，CyclingProbe Technology)法、ICAN(等温和嵌合引物引发的核酸扩增，Isothermaland Chimericprimer-initiatedAmplificationofNucleicAcids)法、LAMP(环介 导等温DNA扩增，Loop-MediatedIsothermalAmplificatonofDNA)法、 SDA(链置换扩增，StrandDisplacementAmplification)法、NASBA(基于核 酸序列的扩增法，NucleicacidSequence-basedAmplificationmethod)法和 TMA(转录介导的扩增法，Transcriptionmediatedamplificationmethod) 法等公知的方法，但不限于这些。

在这些核酸扩增反应中利用例如PCR法的情况下，以夹入草莓属植物 的染色体中的草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物的方式设计一对引物。 另外，在利用LAMP法的情况下，以夹入草莓属植物的染色体中的草莓属 植物炭疽病抵抗性相关标志物的方式设计4种引物。

作为不使用引物的核酸扩增法，不特别限定，可以列举LCR(连接酶 链反应，LigaseChainReaction)法。但是，即使在LCR法中，也要设计 与包含草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物的核酸片段杂交的多种寡核苷 酸。

如上，根据核酸扩增法，在作为检查对象的草莓属植物中存在上述草 莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物的情况下，能够作为扩增产物获得包含 该标志物的核酸片段。换言之，在以从作为检查对象的草莓属植物中提取 的染色体作为模板通过核酸扩增法而扩增了所期望的核酸片段的情况下， 能够判断该作为检查对象的草莓属植物具有炭疽病抵抗性。

对检测扩增的核酸片段，不特别限定，可以列举将扩增反应后的溶液 进行琼脂糖电泳，使溴化乙锭、SYBRGreen等荧光性嵌入剂结合，观察 特异性的荧光的方法；在核酸扩增反应的溶液中添加荧光性嵌入剂，进行 扩增反应后的荧光检测的方法；使用经荧光标记的引物进行核酸扩增反应， 进行扩增反应后的荧光检测的方法等。

此外，在利用核酸扩增法检测草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物的 情况下，包含该标志物的扩增片段的碱基长根据核酸扩增方法的原理等不 同而不同，可以为例如30～10000碱基长，优选为50～5000碱基长，更优 选为70～2000碱基长。

另外，判定草莓属植物的炭疽病抵抗性时，也可以检测多种草莓属植 物炭疽病抵抗性相关标志物。即，可以以从草莓属植物的染色体中的由序 列号1所示的碱基序列和序列号10所示的碱基序列所夹的核酸区域中选出 的多个区域作为草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物，检测这些多种草莓 属植物炭疽病抵抗性相关标志物。例如，可以以从由序列号1～10的碱基 序列组成10个区域中选择的多个区域作为草莓属植物炭疽病抵抗性相关 标志物，检测这些多个区域。

作为一例，可以以由序列号7的碱基序列组成的区域(IA200826)和由 序列号8的碱基序列组成的区域(IA202631)分别作为草莓属植物炭疽病抵 抗性相关标志物，通过核酸扩增法扩增这些各区域，确认草莓属植物炭疽 病抵抗性相关标志物存在与否。或者，作为一例，可以以由序列号7的碱 基序列组成的区域(IA200826)和由序列号8的碱基序列组成的区域 (IA202631)所夹入的区域作为草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物，通过 核酸扩增法扩增该区域，确认草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物存在与 否。

另一方面，在利用具有与草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物对应的 探针的DNA微阵列的方式中，该探针是指能够与如上所述定义的草莓属 植物炭疽病抵抗性相关标志物在严格条件下特异性地杂交的寡核苷酸。这 样的寡核苷酸例如可以作为如上所述定义的草莓属植物炭疽病抵抗性相关 标志物的碱基序列或其互补链的至少连续的10碱基、15碱基、20碱基、 25碱基、30碱基、35碱基、40碱基、45碱基、50碱基或50碱基以上的 碱基长的部分区域或全区域设计。此外，作为具有该探针的DNA微阵列， 可以是以玻璃、有机硅等的平面基板为担载体的微阵列、以微珠为担载体 的珠阵列、或者在中空纤维的内壁固定探针的3维微阵列等任何类型的微 阵列。

通过使用如上制作的DNA微阵列，能够对于以后代系统等为代表的 炭疽病抵抗性的表型未知的草莓属植物判断是否是显示炭疽病抵抗性优异 这样的表型的系统。此外，除了上述的使用DNA微阵列的方法以外，可 以使用现有公知的方法来检测上述的草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物， 对于供试草莓属植物判断是否是具有炭疽病抵抗性优异这样的性状的系统。 作为除了使用DNA微阵列的方法以外的方法，可以应用例如，使用了上 述的探针的所谓FISH(荧光原位杂交，fluorescenceinsituhybridization) 法。

对于使用DNA微阵列的方法进行更详细的说明。如图2所示，首先 从供试草莓属植物提取基因组DNA。该供试草莓属植物是指在制作后代系 统等炭疽病抵抗性的表型未知的草莓属植物和/或后代系统时使用的亲本 的草莓属植物，是成为判定是否具有炭疽病抵抗性优异这样的性状的对象 的草莓属植物。

接下来，将提取的基因组DNA用上述＜草莓属植物中的标志物的鉴 定＞栏中所说明的在制作DNA微阵列时使用的限制性酶消化，制备多种 基因组DNA片段。接下来，将所得的基因组DNA片段与制作DNA微阵 列时使用的连接物连接。接下来，使用在制作DNA微阵列时使用的引物， 扩增两末端附加了连接物的基因组DNA片段。由此，能够扩增与在制作 DNA微阵列时的工序1d中扩增的基因组DNA片段对应的、来源于供试 草莓属植物的基因组DNA片段。

在该工序中，可以选择性地扩增附加了连接物的基因组DNA片段中 的、规定的基因组DNA片段。例如，在使用与多种限制性酶对应的多种 连接物的情况下，可以选择性地扩增附加了特定的连接物的基因组DNA 片段。另外，在用多种限制性酶消化基因组DNA的情况下，通过仅对所 得的基因组DNA片段中的具有与规定的限制性酶对应的突出末端的基因 组DNA片段附加连接物，可以选择性地扩增附加了连接物的基因组DNA 片段。这样，通过选择性地扩增规定的基因组DNA片段，从而进行浓缩。

接下来，对扩增的基因组DNA片段附加标记。作为标记，可以使用 现有公知的任何物质。作为标记，可以使用例如荧光分子、色素分子、放 射性分子等。此外，本工序可以通过在扩增基因组DNA片段的工序中使 用具有标记的核苷酸而省略。这是因为通过在上述工序中使用具有标记的 核苷酸来扩增基因组DNA片段，所扩增的DNA片段被标记化。

接下来，使具有标记的基因组DNA片段在规定的条件下与DNA微阵 列接触，使固定于DNA微阵列的探针与具有标记的基因组DNA片段杂交。 此时，杂交时优选为高严格条件。通过采取这样的高严格条件，能够更高 精度地判定供试草莓属植物中是否存在草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志 物。此外，严格条件通过反应温度和盐浓度来调节。即，通过更高温来形 成更高的严格条件，另外通过更低的盐浓度来形成更高的严格条件。例如， 在使用50～75碱基长的探针的情况下，作为杂交条件，可以通过40～44℃、 0.2％SDS、6×SSC的条件来制成更高的严格条件。

另外，探针与具有标记的基因组DNA片段的杂交可以基于标记来检 测。即，在上述的具有标记的基因组DNA片段与探针的杂交反应之后， 洗净未反应的基因组DNA片段等，然后观察与探针特异性地杂交的基因 组DNA片段的标记。例如，在标记是荧光物质的情况下，检测其荧光波 长，在标记是色素分子的情况下，检测其色素波长。更具体地，可以使用 在通常的DNA微阵列分析中使用的荧光检测装置、图像分析仪等装置。

如上，通过利用核酸扩增法的方法或者使用DNA微阵列的方法，能 够判断供试草莓属植物是否具有上述的草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志 物。其中，如上所述，如果存在草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物中的 与炭疽病抵抗性优异这样的性状连锁的草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志 物，则能够判断是炭疽病抵抗性优异的系统·品种。另外，如上所述，如 果不存在草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物中的、与炭疽病抵抗性降低 的性状连锁的草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物，则能够判断是炭疽病 抵抗性优异的系统·品种。

特别是在上述的方法中，不需要使供试草莓属植物成长到能够实施实 际的炭疽病抵抗性试验的程度，可以使用例如后代系统的种子、使该种子 发芽而得的幼苗。因此，通过利用草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物， 能够大幅削减用于使供试草莓属植物生长的农场、其他用于生长的成本。 另外，通过利用草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物，不需要实际感染炭 疽菌的病原微生物(苹果炭疽病菌(Glomerellacingulate)和/或辣椒炭疽病 菌(Colletotrichumacutatum))，能够削减大规模专用温室、专用农场、与 外部的隔离设施等设备等所花费的成本。

特别在制作草莓属植物的新品种时，优选在首先通过杂交制作数万种 杂交种之后，在实生筛选之前或代替实生筛选，进行利用草莓属植物炭疽 病抵抗性相关标志物的判断。由此，能够大幅削减在实际农场中栽培优良 的系统的数量，大幅抑制制作草莓属植物的新品种所花费的时间、成本。

或者，在制作草莓属植物的新品种时，还可以首先判定杂交中使用的 亲本品种中有无草莓属植物炭疽病抵抗性相关标志物存在，筛选炭疽病抵 抗性优异的亲本品种。通过优先使用炭疽病抵抗性优异的亲本品种制作后 代系统，能够期待炭疽病抵抗性优异的后代系统高频率地出现。由此，能 够大幅削减栽培优良的系统的数量，大幅抑制制作草莓属植物的新品种所 花费的时间、成本。

实施例

以下，通过实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术的范围不限 于以下的实施例。

1.DNA微阵列用探针的制成

(1)材料

使用栽培草莓品种：さちのか(幸香)和草莓中间母本农2号。

(2)限制性酶处理

从这些栽培草莓品种通过CTAB法(三甲基十六烷基溴化铵法，Cetyl trimethylammoniumbromide法)分别提取基因组DNA。将提取的基因组 DNA(180ng)用限制性酶PstI(NEB社、6unit)在37℃处理1小时。然后， 对PstI处理后的基因组DNA(150ng)添加限制性酶BstNI(NEB社、5unit)， 在60℃处理1小时。

(3)连接物连接

对(2)中处理后的基因组DNA片段(120ng)加入PstI序列连接物 (5’-CACGATGGATCCAGTGCA-3’(序列号11)、 5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’(序列号12))和T4DNA连接酶(NEB社、 800unit)，在16℃、4小时以上的条件下进行连接反应。由此，对在(2)中 处理的基因组DNA片段中的、两末端具有PstI识别序列的基因组DNA 片段选择性地附加连接物。

(4)PCR扩增

对(3)中获得的具有连接物的基因组DNA片段(15ng)加入PstI序列连 接物识别引物(5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’(序列号13))和Taq聚合酶 (タカラバイオ社PrimeSTAR、1.25unit)，通过PCR(将98℃10秒、55℃15 秒、72℃1分钟作为1个循环进行30个循环后，在72℃处理3分钟，然 后在4℃保存)扩增基因组DNA片段。

(5)基因组序列获得

对于(4)中PCR扩增而得的基因组DNA片段，使用GAII(Illumina社) 确定碱基序列。

(6)探针设计和DNA微阵列的制成

基于(5)的基因组序列信息设计50～75bp的探针。基于设计的探针的 碱基序列信息制作具有这些探针的DNA微阵列。

2.使用了DNA微阵列的信号数据的获得

(1)材料

使用栽培草莓品种：さちのか(幸香)、草莓中间母本农2号和它们的 杂交后代133个系统。

(2)限制性酶处理

从这些栽培草莓品种和杂交后代通过CTAB法分别提取基因组DNA。 将提取的基因组DNA(180ng)用限制性酶PstI(NEB社、6unit)在37℃处理 1小时。然后，对PstI处理后的基因组DNA(150ng)添加限制性酶BstNI (NEB社、5unit)，在60℃处理1小时。

(3)连接物连接

对(2)中处理的基因组DNA片段(120ng)加入PstI序列连接物 (5’-CACGATGGATCCAGTGCA-3’(序列号11)、 5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’(序列号12))和T4DNA连接酶(NEB社、 800unit)，在16℃、4小时以上的条件下进行连接反应。由此，对(2)中处 理的基因组DNA片段中的、两末端具有PstI识别序列额基因组DNA片 段选择性地附加连接物。

(4)PCR扩增

对(3)中获得的具有连接物的基因组DNA片段(15ng)加入PstI序列连 接物识别引物(5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’(序列号13))和Taq聚合酶 (タカラバイオ社PrimeSTAR、1.25unit)，通过PCR(将98℃10秒、55℃15 秒、72℃1分钟作为1个循环进行30个循环后，在72℃处理3分钟，然 后在4℃保存)扩增基因组DNA片段。

(5)标记化

将上述的(4)中获得的PCR扩增片段用柱(Qiagen社)纯化后，按照 NimbleGenArraysUser’sGuide使用NimbleGenOne-ColorDNA Labeling制备标记化样品。

(6)杂交·信号检测

使用(5)的标记化样品，按照NimbleGenArrayUser’sGuide，使用上 述1.中制作的DNA微阵列进行杂交，检测基于标记的信号。

3.草莓属植物炭疽病抵抗性的QTL鉴定和标志物开发

(1)遗传图谱数据制成

从さちのか(幸香)、草莓中间母本农2号、杂交后代133个系统的信 号数据获得能够成为さちのか(幸香)型的1,502个标志物和草莓中间母本 农2号型的2,162个标志物的基因型数据。以基因型数据为基础，使用遗 传图谱制成软件AntMap(IwataH,NinomiyaS(2006)AntMap: constructinggeneticlinkagemapsusinganantcolonyoptimization algorithm.BreedSci56:371-378)，通过遗传距离计算式Kosambi计算出 染色体中的标志物的位置信息，获得标志物的遗传图谱数据。

(2)草莓炭疽病检验试验数据的获得

以さちのか(幸香)、草莓中间母本农2号、杂交后代103个系统的走 茎繁殖后的克隆株作为检验株。对于各检验株以1区5株×3重复栽培。除 去下位叶使得到接种2天前具备展开叶为3～4片的叶数。

然后，将独立行政法人农业·食品产业技术综合研究机构的野菜茶业 研究所所保持的草莓炭疽病菌株(苹果炭疽病菌(Glomerellacingulate))在 PS液体培养基(1000ml含马铃薯泥20g、蔗糖2％)中振荡培养(120rpm)5 天。将培养液用纱布过滤后，以将分生孢子调整为10⁵个/mL的浓度的液 体作为接种源(分生孢子混悬液)。从2012年9月19日、气温开始降低的 下午3点开始，将调制的接种源(分生孢子混悬液)用电池式肩背动力喷雾 器不添加延展剂等进行喷雾，直至植物体全体润湿的程度。

然后，在用冷纱进行了内衬遮光的玻璃室内使其发病。从接种当日到 第二天的中午将玻璃室紧闭，保持高湿度。然后，使天窗·侧窗为自动开 闭(25℃)，对温度进行动向管理。关于草莓炭疽病患病株的调查，在10月 19日对于各品种·系统作为凋萎或枯死的株的比例进行调查。调查结果示 于图3。

(3)量的性状(Quantitativetraitloci:QTL)的分析

以上述(1)中得到的遗传图谱数据和上述(2)中得到的草莓炭疽病检验 试验数据(凋萎·枯死株率)为基础，使用遗传分析软件QTL Cartographer(WangS.,C.J.Basten,andZ.-B.Zeng(2010).Windows QTLCartographer2.5.DepartmentofStatistics,NorthCarolinaState University,Raleigh,NC)，通过复合区间作图(Compositeintervalmapping, CIM)法进行QTL分析。LOD的阈值使用2.5。其结果如图4所示，在草 莓中间母本农2号的第23连锁群的标志物IA204069到IA201502的区间 内确认了LOD值18.3的提示关于草莓的炭疽病抵抗性的基因的存在的峰。 所得的峰可以如表2所示那样确定，提示在该峰的位置存在具有提高炭疽 病抵抗性的功能的原因基因(群)。

表2

*：炭疽病凋萎·枯死株率(％)

此外，在表2中效果(％)的栏显示炭疽病凋萎·枯死株率。因此，在 效果(％)的数值为负的情况下，意味着该QTL与炭疽病抵抗性提高的性状 连锁。

并且，如图4所示，显示了位于该峰的附近的标志物与具有提高炭疽 病抵抗性的功能的原因基因(群)连锁而遗传，因而能够作为草莓属植物炭 疽病抵抗性相关作为标志物使用。即，弄清楚了图4所示的10种标志物能 够作为草莓属植物炭疽病抗性相关标志物使用。

另外，本实施例中制成的探针的碱基序列和信号值的阈值示于表3。

表3

利用表3所示的探针，对于さちのか(幸香)和草莓中间母本农2号、 以及后代系统检测标志物IA204069至IA201502的信号，将结果分别示于 图5～14(此外，在图5～14中，中母2号＊意味着草莓中间母本农2号)。 另外，将检测结果归纳显示于表4。

表4

如表4和图5～14所示，明确了草莓中间母本农2号的第23连锁群的 标志物IA204069至IA201502的区域与草莓属植物中的炭疽病凋萎·枯死 株率(％)显示高的相关性。

4.基于PCR的标志物的开发

另外，在本实施例中，设计从草莓中间母本农2号的第23连锁群的标 志物IA204069至IA201502的区域中通过PCR扩增标志物IA202631和 IA200826的引物。

(1)引物制作

使用序列组装软件ATGCver.6，从标志物IA202631和IA200826的 序列信息制作识别各个序列的引物。即，对于IA202631，设计 CGGTTAACCCCTCCTAGAAAATC(IA202631F_2A：序列号24)和 TGCAGCTGTGAGGTTGTCTTTAT(IA202631R_111A：序列号25)，对 于IA200826设计CTGCAGAAAAGGGAGAAGAAGTTC(IA200826F_1A： 序列号26)和GCCAGATGAAATAGAAGATTAGCACC (IA200826R_259A：序列号27)。

另外，同样地使用序列组装软件ATGCver.6，从标志物IA202531和 IA200064的序列信息制作识别各个序列的引物。即，对于IA202531，设 计GCTACTCATAGTAGGTCGATTGGAAG：序列号28和 CTGCAGTTTACATGCAGCAGA：序列号29，对于IA200064设计 AAGTTCAACATTATCAAGGAAAATGAA：序列号30和 AATTGATAACTATTAACAGCAGTCAGG：序列号31。

(2)PCR扩增

对草莓品种さちのか(幸香)、草莓中间母本农2号和杂交后代12个系 统的基因组DNA(15ng)，加入所述引物对和Taq聚合酶(タカラバイオ社、 PrimeSTAR、0.5unit)，通过PCR(将98℃10秒、55℃5秒、72℃1分钟 进行30个循环后，在72℃处理3分钟，然后在4℃保存)进行扩增。PCR 扩增而得的DNA片段通过电泳(2.0％琼脂糖凝胶、TAE、100v30分钟) 确认。将PCR扩增标志物IA200826行而得的结果示于图15，将PCR扩 增标志物IA202631而得的结果示于图16。如图15和图16所示，与表4 所示的信号数据一致，显示任一引物对均能够扩增目的条带图案。

另外，将PCR扩增标志物IA202531而得的结果示于图20。如图20 所示，对于标志物IA202531与表4所示的信号数据一致，显示能够通过 如上所述设计的引物对扩增目的条带图案。

此外，对于标志物IA200064，以草莓品种さちのか(幸香)、草莓中间 母本农2号的基因组DNA作为模板进行PCR，然后通过桑格尔法对PCR 扩增而得的DNA片段进行测序。其结果从さちのか(幸香)基因组获得了序 列号32所示的序列信息，从中间母本农2号基因组获得了序列号32所示 的序列信息和序列号4所示的序列信息。判明了序列号32和序列号4中的 第257位是SNP(在序列号32中为A、在序列号4中为T)。在序列号32 中，从第257位的A开始的6碱基(ATGCAT)与限制性酶NsiI的识别序 列(ATGCAT)一致。

然后，将标志物IA200064与上述其他标志物同样地进行PCR扩增， 对PCR扩增而得的DNA片段加入NsiI(NEB社、2unit)，在37℃处理1 小时。限制性酶处理后的DNA片段通过电泳(2.0％琼脂糖凝胶、TAE、 100v30分钟)确认。将对标志物IA200064进行PCR扩增、限制性酶处理 后的结果示于图21。在具有限制性酶识别部位的さちのか(幸香)中，在247 碱基和261碱基附近出现条带，另一方面，在中间母本农2号中，除了247 碱基和261碱基附近的条带之外，在500碱基附近出现条带。如图21所示， 500碱基附近的条带与表4所示的信号数据一致，显示能够通过如上所述 设计的引物对扩增目的条带图案。

5.炭疽病抵抗性系统的筛选

(1)基因型数据和炭疽病凋萎·枯死株率

将草莓品种さちのか(幸香)、草莓中间母本农2号和杂交后代133个 系统的筛选标志物IA200826的基因型数据与炭疽病凋萎·枯死株率进行 比较(图17)。对草莓炭疽病的抵抗性优异的系统大多具有筛选标志物 IA200826(平均10.6％)。另一方面，显示对草莓炭疽病的患病性的系统大 多不具有筛选标志物IA200826(平均49.8％)。T检验的结果为显著性水平 1％，确认两平均值有显著性差异。

(2)未知系统的筛选

I.基因组DNA的提取

重新对于草莓品种さちのか(幸香)、草莓中间母本农2号的杂交后代2 个系统(A和B)，通过CTAB法提取基因组DNA。

II.利用筛选标志物的检验

对草莓品种さちのか(幸香)、草莓中间母本农2号和杂交后代2个系 统(A和B)的基因组DNA(15ng)，加入上述4.中设计的IA202631引物对 (IA202631F_2A和IA202631R_111A)或者IA200826引物对(IA200826F_1A 和IA200826R_259A)和Taq聚合酶(タカラバイオ社、PrimeSTAR、0.5 unit)，通过PCR(将98℃10秒、55℃5秒、72℃1分钟进行30个循环后， 在72℃处理3分钟，然后在4℃保存)进行扩增。PCR扩增而得的DNA片 段通过电泳(2.0％琼脂糖凝胶、TAE、100v30分钟)确认。其结果示于图 18。如图18所示，杂交后代A系统不保持IA202631和IA200826的任一 标志物。另一方面，杂交后代B系统保持IA202631和IA200826两种标志 物。

III.与炭疽病检验试验数据的比较

炭疽病检验试验的结果是，杂交后代A系统和杂交后代B系统的炭疽 病凋萎·枯死株率分别为80.0％和13.3％。T检验的结果显著性水平为1％， 系统A和系统B的炭疽病凋萎·枯死株率有显著性差异。保持IA202631 和IA200826标志物的杂交后代B系统的炭疽病凋萎·枯死株率低，草莓 炭疽病的抵抗性优异。另一方面，不保持IA202631和IA200826的任一标 志物的杂交后代A系统的炭疽病凋萎·枯死株率高，草莓炭疽病的抵抗性 差。由以上的结果弄清楚了，通过利用这些标志物，能够辨别炭疽病抵抗 性优异的系统、炭疽病抵抗性差的系统。

IV.标志物间区域的PCR扩增

对草莓品种さちのか(幸香)、草莓中间母本农2号的基因组DNA(15ng) 加入引物对(IA200826F_1A和IA202631R_111A)和Taq聚合酶(タカラバ イオ社、PrimeSTAR、0.5unit)，通过PCR(将98℃10秒、55℃5秒、 72℃2分钟进行25个循环后，在72℃处理3分钟，然后在4℃保存)进行 扩增。PCR扩增而得的DNA片段通过电泳(2.0％琼脂糖凝胶、TAE、100 v30分钟)确认。其结果示于图19。如图19所示，在草莓中间母本农2 号中确认了1.4kbp的PCR扩增而得的DNA片段。即，能够从草莓中间 母本农2号的第23连锁群的标志物IA204069至IA201502的区域中通过 PCR而扩增包含标志物IA202631和IA200826的区域。

由该结果弄清楚了，从草莓中间母本农2号的第23连锁群的标志物 IA204069至IA201502的区域中以一对引物对扩增多种标志物，能够辨别 草莓属植物炭疽病。

本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请均直接作为参考纳入 本说明书中。