一种正天丸制剂中挥发性成分的特征图谱的构建方法及正天丸制剂中挥发性成分的检测方法

摘要

本发明涉及一种正天丸制剂中挥发性成分的特征图谱的构建方法及正天丸制剂中挥发性成分的检测方法，该构建方法及检测方法利用水蒸气蒸馏法提取正天丸制剂中的挥发性成分，用气相色谱法对其进行特征图谱分析，以相对保留时间比作为评价指标，建立正天丸挥发性成分特征图谱，并对正天丸制剂进行检测。该构建方法及检测方法重现性好，特征峰分离度高，为正天丸制剂整体质量控制提供了方法参考。

说明书

技术领域

本发明涉及中药制剂检测领域，具体涉及一种正天丸制剂中挥发性成分的特征图 谱的构建方法及正天丸制剂中挥发性成分的检测方法。

背景技术

正天丸收载于中国药典2015年版一部，是由原第一军医大学南方医院中医科陈宝 田名老中医的临床经验方开发而成，由原料药钩藤、白芍、川芎、当归、地黄、白芷、防风、羌 活、桃仁、红花、细辛、独活、麻黄、黑顺片、鸡血藤等15味药组成，具有疏风活血、养血平肝、 通络止痛的功效。

关于正天丸制剂的检测，现有红花、鸡血藤、桃仁、防风的显微鉴别，钩藤、白芍、麻 黄、独活的薄层鉴别与白芍的含量测定，但制剂中挥发性伞形科植物当归、川芎、羌活、独 活、防风、白芷以及细辛等7味药材中只对独活、防风2味药进行鉴别，尚无对所含7种挥发性 伞形科植物成分的整体检测方法。而目前研究表明，伞形科植物芳香挥发性成分具有较好 的通络、避秽、改善血液流变学异常等疗效，细辛挥发油具有祛风散寒、通窍止痛等功效，均 是正天丸制剂发挥药理作用的主要组成部分。

因此，针对现有技术中尚无较全面的质量控制方法反映正天丸制剂中挥发性药物 成分的质量状况，构建一种对正天丸中的多种挥发性药成分进行检测的方法，以整体、有效 控制正天丸制剂质量，是具有重要意义的。

发明内容

为此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中没有正天丸制剂中挥发性成 分的特征图谱以及对正天丸制剂中挥发性成分的检测方法，从而提供一种正天丸制剂中挥 发性成分的特征图谱的构建方法及正天丸制剂中挥发性成分的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供一种正天丸制剂中挥发性成分的特征图谱的构建方法，所述构建方法 包括如下步骤：

(1)供试品溶液制备：取正天丸制剂粉末15重量份，精密称定，置烧瓶中，加入蒸馏 水240体积份及玻璃珠，利用水蒸气蒸馏法提取挥发油，冷却后收集乙酸乙酯层并加乙酸乙 酯定容至2体积份，加无水硫酸钠，静置，取上层液，滤过；

(2)对照品溶液制备：取藁本内酯对照品精密称定，加甲醇制成为每1体积份含 0.0002重量份藁本内酯的对照品溶液；

(3)色谱条件：进样口温度：270℃，检测器温度：300℃，分流比1：50，载气：氮气，氢 气压力：55KPa，空气压力：45KPa，尾吹扫：30mL·min-1，柱流量：1mL·min-1；

程序升温：起始温度：70℃，保持1min；以2℃·min-1的速率升至90℃，保持1min； 以5℃·min-1的速率升至220℃，保持1min；以12℃·min-1的速率升至270℃，保持5min；

(4)分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液1uL,注入气相色谱仪，测定；

(5)建立正天丸制剂中挥发性成分的特征图谱：根据至少16批次(批号：1503023H、 1503024H、1503025H、1503026H、1503027H、1503028H、1503029H、1503030H、1503031H、 1503032H、1503033H1503034H，1407025H，1408001H，1408003H，1408027H)正天丸制剂的色 谱图中各色谱峰的保留时间，确定共有峰，并选取其中20个共有峰作为特征峰建立对照特 征图谱；其中以19号峰为参照峰S，计算各色谱峰保留时间与同一图谱中S峰的保留时间比 值，得到的相对保留时间比值为：

1号峰：0.1016±0.0051；2号峰：0.1105±0.0055；

3号峰：0.2192±0.0110；4号峰：0.2587±0.0129；

5号峰：0.4965±0.0248；6号峰：0.5983±0.0299；

7号峰：0.6228±0.0311；8号峰：0.6488±0.0324；

9号峰：0.7318±0.0366；10号峰：0.7385±0.0369；

11号峰：0.8072±0.0404；12号峰：0.8135±0.0407；

13号峰：0.8822±0.0441；14号峰：0.9380±0.0469；

15号峰：0.9532±0.0477；16号峰：0.9674±0.0484；

17号峰：0.9884±0.0494；18号峰：0.9925±0.0496；

19号峰：1；20号峰：1.1811±0.0591；

(6)共有峰的指认：使用GC-MS技术对正天丸制剂中挥发性成分的对照特征图谱共 有峰进行指认，结合对照品比对，8号峰为甲基丁香酚，9号峰为阿魏酸，19号峰为藁本内酯；

(7)确定制剂与药材的相关性：将正天丸制剂中挥发性成分的特征图谱与细辛、当 归、川芎、独活、羌活、防风、白芷7味单味药的GC特征图谱进行比较，对比各色谱峰的相对保 留时间，确定共有峰主要来源。

所述重量份与体积份的关系为g/mL的关系。

优选的，所述供试品溶液制备的步骤为：取正天丸制剂粉末(过三号筛)15重量份， 精密称定，置烧瓶中，加入蒸馏水240体积份及玻璃珠，连接挥发油提取器，自挥发油提取器 上端加水至叉口有水溢入烧瓶为止，并由挥发油提取器上端定量加入2体积份乙酸乙酯，保 持微沸状态2h；冷却后，收集乙酸乙酯层并加乙酸乙酯定容至2体积份，加无水硫酸钠，静 置，取上层液，滤过。

优选的，所述正天丸制剂中挥发性成分的特征图谱的构建方法中采用弱极性毛细 管柱。

本发明还提供一种正天丸制剂中挥发性成分的检测方法，其特征在于，所述方法 包括以下步骤：

(1)供试品溶液制备：取正天丸制剂粉末15重量份，精密称定，置烧瓶中，加入蒸馏 水240体积份及玻璃珠，利用水蒸气蒸馏法提取挥发油，冷却后收集乙酸乙酯层并加乙酸乙 酯定容至2体积份，加无水硫酸钠，静置，取上层液，滤过；

(2)对照品溶液制备：取藁本内酯对照品精密称定，加甲醇制成为每1体积份含 0.0002重量份藁本内酯的对照品溶液；

(3)色谱条件：进样口温度：270℃，检测器温度：300℃，分流比1：50，载气：氮气，氢 气压力：55KPa，空气压力：45KPa，尾吹扫：30mL·min-1，柱流量：1mL·min-1；

程序升温：起始温度：70℃，保持1min；以2℃·min-1的速率升至90℃，保持1min； 以5℃·min-1的速率升至220℃，保持1min；以12℃·min-1的速率升至270℃，保持5min；

(4)分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液1uL,注入气相色谱仪，测定；

(5)将供试品溶液图谱与正天丸制剂中挥发性成分的特征图谱比较，相对保留时 间在±5％以内的为合格。

所述重量份与体积份的关系为g/mL的关系。

优选的，所述供试品溶液制备的步骤为：取正天丸制剂粉末(过三号筛)15重量份， 精密称定，置烧瓶中，加入蒸馏水240体积份及玻璃珠，连接挥发油提取器，自挥发油提取器 上端加水至叉口有水溢入烧瓶为止，并由挥发油提取器上端定量加入2体积份乙酸乙酯，保 持微沸状态2h；冷却后，收集乙酸乙酯层并加乙酸乙酯定容至2体积份，加无水硫酸钠，静 置，取上层液，滤过。

优选的，所述正天丸制剂中挥发性成分的检测方法中采用弱极性毛细管柱。

本发明还提供一种上述方法用于正天丸制剂检测领域中的用途。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的正天丸制剂中挥发性成分的特征图谱的构建方法及正天丸制剂 中挥发性成分的检测方法，通过挥发油测定器提取挥发性成分制备供试品溶液，获得的图 谱整体性好，峰数目多且分离度好，有利于进行正天丸制剂的质量控制。

2.本发明提供的正天丸制剂中挥发性成分的特征图谱的构建方法及正天丸制剂 中挥发性成分的检测方法，经方法学验证其精密度、重复性及稳定性好，为正天丸制剂整体 质量控制提供了方法参考。

3.本发明提供的正天丸制剂中挥发性成分的特征图谱的构建方法及正天丸制剂 中挥发性成分的检测方法，选用弱极性毛细管柱分析，峰数明显多于极性柱且分离度好。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合 附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：

图1供试品溶液提取方法比较；

图2使用不同色谱柱获得的图谱，图2-1为使用RTX-WAX色谱柱获得的图谱，图2-2 为使用RTX-5色谱柱获得的图谱；

图3是本发明实验例2建立的正天丸制剂中挥发性成分的特征图谱；

图4是本发明实验例3中16批正天丸制剂中挥发性成分的检测图谱；

图5是正天丸制剂中单味药的GC特征图谱。

具体实施方式

实施例1

本实施例所述正天丸制剂中挥发性成分的特征图谱的构建方法，包括如下步骤：

(1)供试品溶液制备：取正天丸制剂粉末(过三号筛)15g，精密称定，置烧瓶中，加 入蒸馏水240mL及玻璃珠，连接挥发油提取器，自挥发油提取器上端加水至叉口有水溢入烧 瓶为止，并由挥发油提取器上端定量加入2mL乙酸乙酯，保持微沸状态2h；冷却后，收集乙酸 乙酯层并加乙酸乙酯定容至2mL，加无水硫酸钠，静置，取上层液，滤过；

(2)对照品溶液制备：取藁本内酯对照品精密称定，加甲醇制成为每1mL含200μg藁 本内酯的对照品溶液；

(3)色谱条件：

采用RTX-5毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm，Restek)；

进样口温度：270℃，检测器温度：300℃，分流比1：50，载气：氮气，氢气压力： 55KPa，空气压力：45KPa，尾吹扫：30mL·min-1，柱流量：1mL·min-1；

程序升温：起始温度：70℃，保持1min；以2℃·min-1的速率升至90℃，保持1min； 以5℃·min-1的速率升至220℃，保持1min；以12℃·min-1的速率升至270℃，保持5min；

(4)分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液1uL,注入气相色谱仪，测定；

(5)建立正天丸制剂中挥发性成分的特征图谱：取16批正天丸制剂样品(批号： 1503023H、1503024H、1503025H、1503026H、1503027H、1503028H、1503029H、1503030H、 1503031H、1503032H、1503033H1503034H，1407025H，1408001H，1408003H，1408027H)，按 “(1)”项下方法制备供试品溶液，精密吸取1uL，分别注入气相色谱仪，在“(3)”项下色谱条 件下进样分析，根据所得色谱图中各色谱峰的相对保留时间，确定共有峰，并选取其中20个 共有峰作为特征峰建立对照特征图谱；其中以19号峰为参照峰S，计算各色谱峰保留时间与 同一图谱中S峰的保留时间比值，得到的相对保留时间比值为：

1号峰：0.1016±0.0051；2号峰：0.1105±0.0055；

3号峰：0.2192±0.0110；4号峰：0.2587±0.0129；

5号峰：0.4965±0.0248；6号峰：0.5983±0.0299；

7号峰：0.6228±0.0311；8号峰：0.6488±0.0324；

9号峰：0.7318±0.0366；10号峰：0.7385±0.0369；

11号峰：0.8072±0.0404；12号峰：0.8135±0.0407；

13号峰：0.8822±0.0441；14号峰：0.9380±0.0469；

15号峰：0.9532±0.0477；16号峰：0.9674±0.0484；

17号峰：0.9884±0.0494；18号峰：0.9925±0.0496；

19号峰：1；20号峰：1.1811±0.0591；

(6)共有峰的指认：使用GC-MS技术对正天丸制剂中挥发性成分的对照特征图谱共 有峰进行指认，结合对照品比对，8号峰为甲基丁香酚，9号峰为阿魏酸，19号峰为藁本内酯；

(7)确定制剂与药材的相关性：将正天丸制剂中挥发性成分的特征图谱与细辛、当 归、川芎、独活、羌活、防风、白芷7味单味药的GC特征图谱进行比较(参见图5)，对比各色谱 峰的相对保留时间，确定共有峰主要来源。

其中单味药的药材样品称样量分别为：细辛、当归、川芎、防风、白芷、羌活均为 33.6g，独活20.4g，制备方法与步骤(1)供试品溶液制备所述方法相同；色谱条件中的分流 比：细辛、当归、独活、羌活、防风、白芷为200:1，川芎110:1,其他条件与步骤(3)所述的色谱 条件一致。

实施例2

本实施例所述正天丸制剂中挥发性成分的检测方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液制备：将16批正天丸制剂(批号：1503023H、1503024H、1503025H、 1503026H、1503027H、1503028H、1503029H、1503030H、1503031H、1503032H、1503033H 1503034H，1407025H，1408001H，1408003H，1408027H，华润三九医药股份有限公司提供)，每 批分别取取正天丸制剂粉末15g(过三号筛)，精密称定，置烧瓶中，加入蒸馏水240mL及玻璃 珠，连接挥发油提取器，自挥发油提取器上端加水至叉口有水溢入烧瓶为止，并由挥发油提 取器上端定量加入2mL乙酸乙酯，保持微沸状态2h；冷却后，收集乙酸乙酯层并加乙酸乙酯 定容至2mL，加无水硫酸钠，静置，取上层液，滤过；

(2)对照品溶液制备：取藁本内酯对照品精密称定，加甲醇制成为每1mL含200μg藁 本内酯的对照品溶液；

(3)色谱条件：

采用RTX-5毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm，Restek)；

进样口温度：270℃，检测器温度：300℃，分流比1：50，载气：氮气，氢气压力： 55KPa，空气压力：45KPa，尾吹扫：30mL·min-1，柱流量：1mL·min-1；

程序升温：起始温度：70℃，保持1min；以2℃·min-1的速率升至90℃，保持1min； 以5℃·min-1的速率升至220℃，保持1min；以12℃·min-1的速率升至270℃，保持5min；

(4)分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液1uL,注入气相色谱仪，测定；

(5)将供试品溶液图谱与实施例1所得特征图谱的相对保留时间进行比较。

实验例1条件优化

1.仪器与试药

1.1仪器

岛津GC-2014气相色谱仪(日本岛津公司)；

DFID检测器(日本岛津公司)；

RTX-5毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm，Restek)，

1.2试药

乙酸乙酯(分析纯)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司产；藁本内酯对照品(批 号：111737-201305；ID号：LTVC-SY2T)，购于中国食品药品检定研究院；

甲基丁香酚对照品(批号：111642-200301)，购于中国食品药品检定研究院；阿魏 酸对照品(批号：110773-201313；ID号：6WOF-B3AT)，购于中国食品药品检定研究院；

16批正天丸制剂样品(批号：1503023H、1503024H、1503025H、1503026H、1503027H、 1503028H、1503029H、1503030H、1503031H、1503032H、1503033H1503034H，1407025H， 1408001H，1408003H，1408027H)，华润三九医药股份有限公司提供；

川芎、羌活、独活、防风、当归、白芷、细辛药材，华润三九医药股份有限公司提供。

2.单因素变量分析

2.1供试品溶液制备方法

在同一色谱条件下，选用不同的供试品溶液制备方法。

结果表明，石油醚回流提取样的供试品溶液过于黏稠，无法减压回收至干，乙酸乙 酯超声提取的供试品溶液图谱峰整体性差，色谱峰峰型不佳，而水蒸气蒸馏法提取的供试 品溶液挥发性成分图谱整体性好，峰数目多且分离度好，故选取水蒸气蒸馏法制备供试品 溶液，见图1(图1中1为乙酸乙酯超声提取法，2为水蒸气蒸馏法；石油醚回流提取样的供试 品溶液过于黏稠，所以无法开展相关实验)。

2.2毛细管柱的选择

在同一色谱条件下，选择RTX-5毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm，)、RTX-WAX(30m ×0.25mm×0.25μm)等多种色谱柱进行比较，获得的色谱图结果见图2-1及图2-2所示。

结果显示，采用极性毛细管柱分析，峰主要集中在图谱前端，峰数目少，而采用弱 极性毛细管柱则峰数明显多于极性柱且分离度好，故选用弱极性毛细管柱。

实验例2正天丸制剂中挥发性成分的特征图谱建立方法验证

1.供试品溶液制备

取正天丸制剂粉末(过三号筛)15g，精密称定，置烧瓶中，加入蒸馏水240mL及玻璃 珠，连接挥发油提取器，自挥发油提取器上端加水至叉口有水溢入烧瓶为止，并由挥发油提 取器上端定量加入2mL乙酸乙酯，保持微沸状态2h；冷却后，收集乙酸乙酯层并加乙酸乙酯 定容至2mL，加无水硫酸钠，静置，取上层液，滤过，即可。

2.对照品溶液制备

取藁本内酯对照品精密称定，加甲醇制成为每1mL含200μg藁本内酯的对照品溶 液。

3.色谱条件

采用RTX-5毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm，Restek)

进样口温度：270℃，检测器温度：300℃，分流比1：50，载气：氮气，氢气压力： 55KPa，空气压力：45KPa，尾吹扫：30mL·min-1，柱流量：1mL·min-1；

程序升温：起始温度：70℃，保持1min；以2℃·min-1的速率升至90℃，保持1min； 以5℃·min-1的速率升至220℃，保持1min；以12℃·min-1的速率升至270℃，保持5min。

4.检测

分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液1uL,注入气相色谱仪，测定。

5.建立正天丸制剂中挥发性成分的特征图谱：

5.1特征图谱的建立：取16批正天丸制剂样品(批号：1503023H、1503024H、 1503025H、1503026H、1503027H、1503028H、1503029H、1503030H、1503031H、1503032H、 1503033H1503034H，1407025H，1408001H，1408003H，1408027H)，按“1”项下方法制备供试 品溶液，精密吸取1uL，分别注入气相色谱仪，在“3”项下色谱条件下进样分析，根据所得色 谱图中各色谱峰的相对保留时间，确定共有峰，并选取其中20个共有峰作为特征峰，建立的 对照特征图谱见图3。

5.2特征图谱的标定：正天丸GC特征图谱中，共有指纹峰20个，以19号峰(藁本内 酯)为参照峰(S峰)，计算各色谱峰保留时间与同一图谱中S峰的保留时间比值，得到的相对 保留时间比值范围见表1，其相对保留时间均在规定值的±5％以内。

表1正天丸制剂GC特征图谱相对保留时间比

5.3共有峰的指认：使用GC-MS技术对正天丸GC特征图谱共有峰进行指认，结合对 照品比对，8号峰为甲基丁香酚，9号峰为阿魏酸，19号峰为藁本内酯。

5.4确定制剂与药材的相关性：取得到的正天丸GC特征图谱与细辛、当归、川芎、独 活、羌活、防风、白芷7味单味药的GC特征图谱(参见图5，其中1：白芷药材2:当归药材3:细辛 药材4:独活药材5:防风药材6:羌活药材7:川芎药材8:制剂)进行比较，对比各色谱峰的相 对保留时间，确定共有峰主要来源，见表2。

表2制剂与药材相关性

实验例3正天丸制剂中挥发性成分的检测方法验证

1.供试品溶液制备：将16批正天丸制剂(批号：1503023H、1503024H、1503025H、 1503026H、1503027H、1503028H、1503029H、1503030H、1503031H、1503032H、1503033H 1503034H，1407025H，1408001H，1408003H，1408027H)，每批分别取正天丸制剂粉末15g(过 三号筛)，精密称定，置烧瓶中，加入蒸馏水240mL及玻璃珠，连接挥发油提取器，自挥发油提 取器上端加水至叉口有水溢入烧瓶为止，并由挥发油提取器上端定量加入2mL乙酸乙酯，保 持微沸状态2h；冷却后，收集乙酸乙酯层并加乙酸乙酯定容至2mL，加无水硫酸钠，静置，取 上层液，滤过；

2.对照品溶液制备：取藁本内酯对照品精密称定，加甲醇制成为每1mL含200μg藁 本内酯的对照品溶液；

3.色谱条件：

采用RTX-5毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm，Restek)

进样口温度：270℃，检测器温度：300℃，分流比1：50，载气：氮气，氢气压力： 55KPa，空气压力：45KPa，尾吹扫：30mL·min-1，柱流量：1mL·min-1；

程序升温：起始温度：70℃，保持1min；以2℃·min-1的速率升至90℃，保持1min； 以5℃·min-1的速率升至220℃，保持1min；以12℃·min-1的速率升至270℃，保持5min；

4.分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液1uL,注入气相色谱仪，测定，结果16批 正天丸GC图谱中均有20个共有峰，结果见图4(S1：制剂1407025HS2：制剂1408001HS3：制 剂1408003HS4：制剂1408027HS5：制剂1503023HS6：制剂1503024HS7：制剂1503025H S8：制剂1503026HS9：制剂1503027HS10：制剂1503028HS11：制剂03029HS12：制剂 1503030HS13：制剂1503031HS14：制剂1503032HS15：制剂1503033HS16：制剂 1503034H)；

5.将供试品溶液图谱(图4)与实验例2所得的特征图谱比较，相对保留时间如下 表：

实验例4正天丸制剂(中间体)中挥发性成分的检测方法验证

正天丸制剂是以全生粉入药，经过包衣泛丸制得。将与制剂同批次的12批正天丸 制剂(批号：1503023H、1503024H、1503025H、1503026H、1503027H、1503028H、1503029H、 1503030H、1503031H、1503032H、1503033H、1503034H)中间体按与实验例3相同的供试品溶 液制备方法、气相色谱条件进行制备、分析，发现20个共有峰均可检测到，相对保留时间比 RSD均＜0.1％。这表明，正天丸生产工艺技术成熟稳定，在保留当归、细辛等药材挥发性成 分的基础上，能有效控制挥发性成分的损耗。

实验例5方法学验证

1.精密度

按与实验例2-3相同的方法制备正天丸制剂供试品溶液，取同一供试品(制剂批号 1503036H)溶液1uL，重复进样6次，各共有峰均出峰，并计算各共有峰的相对保留时间RSD (相对标准偏差)(相对标准偏差＝标准偏差/计算结果的算是平均值×100％)，结果见表4。

表4精密度试验结果

由上表可知，各共有峰的相对保留时间RSD小于0.1％，这表明，本发明所构建的正 天丸制剂检测方法精密度良好。

2.重复性

取同一批次正天丸制剂(批号：1503036H)，按与实验例2-3相同的方法制备供试品 溶液，分别进样，测得所有共有峰皆出峰，并计算各共有峰相对保留时间RSD，结果见表5。

表5重复性试验结果

由上表可知，各共有峰的相对保留时间RSD小于0.1％，这表明，本发明所构建的正 天丸制剂检测方法重复性良好。

3.稳定性

按与实验例2-3相同的方法制备供试品溶液，取同一批供试品溶液(批号： 1503036H)分别在0，1，2，4，12，24，48h进样，测得所有共有峰皆出峰，计算各共有峰相对保 留时间RSD，结果见表6。

表6稳定性试验结果

由上表可知，各共有峰相对保留时间RSD小于0.1％，这表明，供试品溶液在48h内 稳定性良好。

综上所述，本发明一种正天丸制剂中挥发性成分的特征图谱的构建方法及正天丸 制剂中挥发性成分的检测方法，通过单因素考察，得到了对正天丸制剂中挥发性成分的特 征图谱的最佳构建方法以及正天丸中挥发性药物成分进行检测的最佳检测方法；经方法学 验证了此方法的精密度、重复性及稳定性，表明了正天丸制剂中挥发性成分保留性完全，重 现性好，特征峰分离度高。