一种基于微接触剥离技术利用点面电极电场制备相分离的巨型磷脂囊泡阵列的方法

摘要

一种基于微接触剥离技术利用点面电极电场制备相分离的巨型磷脂囊泡阵列的方法，它涉及一种制备相分离的巨型磷脂囊泡阵列的方法。本发明的目的是要解决现有不能制备相分离的巨型磷脂囊泡阵列的问题。方法：一、清洗电极；二、带有图案的聚二甲基硅氧烷印章的清洗；三、制备混合磷脂干膜；四、制备三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极；五、密闭制备装置的组装；六、相分离的巨型磷脂囊泡阵列的形成过程，得到相分离的巨型磷脂囊泡阵列。本发明制备的巨型磷脂囊泡阵列中磷脂囊泡的直径为30μm～50μm。本发明可获得一种基于微接触剥离技术利用点面电极电场制备相分离的巨型磷脂囊泡阵列的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备相分离的巨型磷脂囊泡阵列的方法。

背景技术

脂筏是膜脂双层内含有特殊脂质和蛋白质的微区，以液态有序相分散于细胞膜中，对生物体内的信号传导，蛋白质转运，细胞膜结构以及病原体入侵等生理过程中都起着非常重要的作用。但细胞膜中的脂筏不能用显微镜直接观察，目前主要是采用间接的方法对脂筏进行研究。由于巨型磷脂囊泡与细胞膜结构相似、与细胞尺寸相近，且便于用显微镜进行观察，三元组分巨型磷脂囊泡的相分离被广泛应用于脂筏的模拟中。目前相分离巨型磷脂囊泡阵列的制备还罕见报道。

发明内容

本发明的目的是要解决现有不能制备相分离的巨型磷脂囊泡阵列的问题，而提供一种基于微接触剥离技术利用点面电极电场制备相分离的巨型磷脂囊泡阵列的方法。

一种基于微接触剥离技术利用点面电极电场制备相分离的巨型磷脂囊泡阵列的方法是按以下步骤完成的：

一、清洗电极：首先使用无水乙醇对ITO电极进行超声清洗，再使用蒸馏水对ITO电极进行超声清洗，再使用氮气吹干，再使用等离子体清洗机对ITO电极进行清洗；得到清洗后的ITO电极；将钨针电极浸泡在物质的量浓度为2mol/L的盐酸中3h～6h，再用蒸馏水进行冲洗3次～6次，再使用氮气吹干，得到清洗后的钨针电极；

二、带有图案的聚二甲基硅氧烷印章的清洗：首先使用蒸馏水对带有图案的聚二甲基硅氧烷印章进行超声清洗，再使用无水乙醇对带有图案的聚二甲基硅氧烷印章进行超声清洗，再使用氮气吹干，得到清洗后的带有图案的聚二甲基硅氧烷印章；

三、制备混合磷脂干膜：将混合磷脂溶解到氯仿中，得到混合磷脂/氯仿溶液；再将混合磷脂/氯仿溶液均匀涂覆在清洗后的ITO电极的导电面上，室温下自热干燥2h～4h，得到干燥的涂有混合磷脂的ITO电极；

步骤三中所述的混合磷脂为1,2-二油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱和胆固醇的混合物；所述的混合磷脂中1,2-二油酰基磷脂酰胆碱与二硬脂酰磷脂酰胆碱质量比为1:(0.6～3)；所述的1,2-二油酰基磷脂酰胆碱与胆固醇的质量比为1:(0.4～2)；

步骤三中所述的混合磷脂/氯仿溶液中混合磷脂的质量与氯仿的体积比为(3mg～15mg):1mL；

步骤三中所述的混合磷脂/氯仿溶液的体积与清洗后的ITO电极的导电面的面积比为(3μL～10μL):1.44cm²；

四、制备三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极：将清洗后的带有图案的聚二甲基硅氧烷印章的带有图案微结构的一面压印在干燥的涂有混合磷脂的ITO电极的混合磷脂干膜上10min～50min，得到三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极；

步骤四中所述的压印时每1cm²清洗后的带有图案的聚二甲基硅氧烷印章上受力为0.05N～0.1N；

五、密闭制备装置的组装：将三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极与聚四氟乙烯矩形框和PDMS盖片组成密闭制备装置，清洗后的钨针电极垂直通过PDMS盖片，且清洗后的钨针电极进入到密闭制备装置内部中；再在密闭制备装置中注入蒸馏水；

步骤五中所述的图案化磷脂薄膜阵列的ITO电极与清洗后的钨针电极针尖之间的距离为200μm～800μm；

步骤五中所述的清洗后的钨针电极针尖与密闭制备装置上部PDMS盖片的距离为1200μm～1800μm；

六、相分离的巨型磷脂囊泡阵列的形成过程：将密闭制备装置放在温度为65℃～120℃的加热台上，再将三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极和清洗后的钨针电极分别与信号发生器相连接，再在波形为正弦波、交流电压为0.5V～10V、频率为10Hz～1000Hz、温度为65℃～120℃和时间为30min～300min的条件下，得到相分离的巨型磷脂囊泡阵列；

步骤六中所述的巨型磷脂囊泡阵列中磷脂囊泡的直径为30μm～50μm。

本发明的优点：

一、本发明利用点面电极和带有图案的聚二甲基硅氧烷印章，基于微接触剥离技术和电形成方法，实现在一定三元混合磷脂比例，一定交流电压范围及一定时间范围内，相分离的巨型磷脂囊泡阵列的制备，囊泡尺寸均匀、相分离清晰可见；

二、本发明丰富了相分离巨型磷脂囊泡阵列的制备方法，具有低能耗、绿色经济、操作简单、反应条件温的优点；

三、本发明制备的巨型磷脂囊泡阵列中磷脂囊泡的直径为30μm～50μm；

四、本发明制备的巨型磷脂囊泡阵列中磷脂囊泡在研究细胞内和细胞间信号转导、蛋白质分选、细胞内吞途径等方面具有重要意义。

本发明可获得一种基于微接触剥离技术利用点面电极电场制备相分离的巨型磷脂囊泡阵列的方法。

附图说明

图1为实施例一步骤四中制备三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极过程的示意图；图1中1为将清洗后的带有图案的聚二甲基硅氧烷印章，2为干燥的涂有混合磷脂的ITO电极，3为三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极；

图2为实施例一步骤五中所述的密闭制备装置的结构示意图，图2中1为干燥的涂有混合磷脂的ITO电极，2为清洗后的钨针电极，3为聚四氟乙烯矩形框，4为PDMS盖片，5为信号发生器，A为清洗后的钨针电极针尖与密闭制备装置上部PDMS盖片的距离，B为干燥的涂有混合磷脂的ITO电极与清洗后的钨针电极针尖之间的距离；

图3为实施例一制备的相分离的巨型磷脂囊泡阵列的荧光显微镜图片。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式是一种基于微接触剥离技术利用点面电极电场制备相分离的巨型磷脂囊泡阵列的方法是按以下步骤完成的：

一、清洗电极：首先使用无水乙醇对ITO电极进行超声清洗，再使用蒸馏水对ITO电极进行超声清洗，再使用氮气吹干，再使用等离子体清洗机对ITO电极进行清洗；得到清洗后的ITO电极；将钨针电极浸泡在物质的量浓度为2mol/L的盐酸中3h～6h，再用蒸馏水进行冲洗3次～6次，再使用氮气吹干，得到清洗后的钨针电极；

二、带有图案的聚二甲基硅氧烷印章的清洗：首先使用蒸馏水对带有图案的聚二甲基硅氧烷印章进行超声清洗，再使用无水乙醇对带有图案的聚二甲基硅氧烷印章进行超声清洗，再使用氮气吹干，得到清洗后的带有图案的聚二甲基硅氧烷印章；

三、制备混合磷脂干膜：将混合磷脂溶解到氯仿中，得到混合磷脂/氯仿溶液；再将混合磷脂/氯仿溶液均匀涂覆在清洗后的ITO电极的导电面上，室温下自热干燥2h～4h，得到干燥的涂有混合磷脂的ITO电极；

步骤三中所述的混合磷脂为1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和胆固醇的混合物；所述的混合磷脂中1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)与二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)质量比为1:(0.6～3)；所述的1,2-二油酰基磷脂酰胆碱与胆固醇的质量比为1:(0.4～2)；

步骤三中所述的混合磷脂/氯仿溶液中混合磷脂的质量与氯仿的体积比为(3mg～15mg):1mL；

步骤三中所述的混合磷脂/氯仿溶液的体积与清洗后的ITO电极的导电面的面积比为(3μL～10μL):1.44cm²；

四、制备三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极：将清洗后的带有图案的聚二甲基硅氧烷印章的带有图案微结构的一面压印在干燥的涂有混合磷脂的ITO电极的混合磷脂干膜上10min～50min，得到三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极；

步骤四中所述的压印时每1cm²清洗后的带有图案的聚二甲基硅氧烷印章上受力为0.05N～0.1N；

五、密闭制备装置的组装：将三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极与聚四氟乙烯矩形框和PDMS盖片组成密闭制备装置，清洗后的钨针电极垂直通过PDMS盖片，且清洗后的钨针电极进入到密闭制备装置内部中；再在密闭制备装置中注入蒸馏水；

步骤五中所述的图案化磷脂薄膜阵列的ITO电极与清洗后的钨针电极针尖之间的距离为200μm～800μm；

步骤五中所述的清洗后的钨针电极针尖与密闭制备装置上部PDMS盖片的距离为1200μm～1800μm；

六、相分离的巨型磷脂囊泡阵列的形成过程：将密闭制备装置放在温度为65℃～120℃的加热台上，再将三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极和清洗后的钨针电极分别与信号发生器相连接，再在波形为正弦波、交流电压为0.5V～10V、频率为10Hz～1000Hz、温度为65℃～120℃和时间为30min～300min的条件下，得到相分离的巨型磷脂囊泡阵列；

步骤六中所述的巨型磷脂囊泡阵列中磷脂囊泡的直径为30μm～50μm。

本实施方式的优点：

一、本实施方式利用点面电极和带有图案的聚二甲基硅氧烷印章，基于微接触剥离技术和电形成方法，实现在一定三元混合磷脂比例，一定交流电压范围及一定时间范围内，相分离的巨型磷脂囊泡阵列的制备，囊泡尺寸均匀、相分离清晰可见；

二、本实施方式丰富了相分离巨型磷脂囊泡阵列的制备方法，具有低能耗、绿色经济、操作简单、反应条件温的优点；

三、本实施方式制备的巨型磷脂囊泡阵列中磷脂囊泡的直径为30μm～50μm；

四、本实施方式制备的巨型磷脂囊泡阵列中磷脂囊泡在研究细胞内和细胞间信号转导、蛋白质分选、细胞内吞途径等方面具有重要意义。

本实施方式可获得一种基于微接触剥离技术利用点面电极电场制备相分离的巨型磷脂囊泡阵列的方法。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同点是：步骤一中所述的使用无水乙醇对ITO电极进行超声清洗的次数为2次～3次，每次超声清洗的时间为5min～15min，超声功率为40W～80W。其他步骤与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二之一不同点是：步骤一中所述的使用蒸馏水对ITO电极进行超声清洗的次数为2次～3次，每次超声清洗的时间为5min～15min，超声功率为40W～80W。其他步骤与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同点是：步骤一中所述的使用等离子体清洗机对ITO电极进行清洗时间为20s～60s，功率为40W～80W。其他步骤与具体实施方式一至三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同点是：步骤二中使用蒸馏水对带有图案的聚二甲基硅氧烷印章进行超声清洗的时间为5min～20min，超声清洗的功率为40W～80W。其他步骤与具体实施方式一至四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同点是：步骤二中使用无水乙醇对带有图案的聚二甲基硅氧烷印章进行超声清洗的时间为5min～20min，超声清洗的功率为40W～80W。其他步骤与具体实施方式一至五相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同点是：步骤五中所述的密闭制备装置的尺寸为12.5mm×10mm×2mm；所述的密闭制备装置中注入蒸馏水的量为250μL。其他步骤与具体实施方式一至六相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同点是：步骤二中所述的带有图案的聚二甲基硅氧烷印章的图案微结构为阵列的直径为30μm～50μm的圆形或阵列的边长为30μm～50μm的正方形。其他步骤与具体实施方式一至七相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同点是：步骤六中将密闭制备装置放在温度为80℃的加热台上，再将三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极和清洗后的钨针电极分别与信号发生器相连接，再在波形为正弦波、交流电压为3V、频率为10Hz、温度为80℃和时间为60min的条件下，得到相分离的巨型磷脂囊泡阵列。其他步骤与具体实施方式一至八相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同点是：步骤六中将密闭制备装置放在温度为80℃的加热台上，再将三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极和清洗后的钨针电极分别与信号发生器相连接，再在波形为正弦波、交流电压为3.5V、频率为10Hz、温度为80℃和时间为210min的条件下，得到相分离的巨型磷脂囊泡阵列。其他步骤与具体实施方式一至九相同。

采用以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例一：一种基于微接触剥离技术利用点面电极电场制备相分离的巨型磷脂囊泡阵列的方法，是按以下步骤完成的：

一、清洗电极：首先使用无水乙醇对ITO电极进行超声清洗，再使用蒸馏水对ITO电极进行超声清洗，再使用氮气吹干，再使用等离子体清洗机对ITO电极进行清洗；得到清洗后的ITO电极；将钨针电极浸泡在物质的量浓度为1mol/L的盐酸中6h，再用蒸馏水进行冲洗4次，再使用氮气吹干，得到清洗后的钨针电极；

步骤一中所述的使用无水乙醇对ITO电极进行超声清洗的次数为2次，每次超声清洗的时间为10min，超声功率为70W；

步骤一中所述的使用蒸馏水对ITO电极进行超声清洗的次数为2次，每次超声清洗的时间为10min，超声功率为70W；

步骤一中所述的使用等离子体清洗机对ITO电极进行清洗时间为30s，功率为70W；

二、带有图案的聚二甲基硅氧烷印章的清洗：首先使用蒸馏水对带有图案的聚二甲基硅氧烷印章进行超声清洗，再使用无水乙醇对带有图案的聚二甲基硅氧烷印章进行超声清洗，再使用氮气吹干，得到清洗后的带有图案的聚二甲基硅氧烷印章；

步骤二中使用无水乙醇对带有图案的聚二甲基硅氧烷印章进行超声清洗的时间为10min，超声清洗的功率为70W；

步骤二中所述的带有图案的聚二甲基硅氧烷印章的图案微结构为阵列的边长为50μm的正方形，且正方形是向里凹陷的；

三、制备混合磷脂干膜：将混合磷脂溶解到氯仿中，得到混合磷脂/氯仿溶液；再将混合磷脂/氯仿溶液均匀涂覆在清洗后的ITO电极的导电面上，室温下自热干燥2h，得到干燥的涂有混合磷脂的ITO电极；

步骤三中所述的混合磷脂为1,2-二油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱和胆固醇的混合物；所述的混合磷脂中1,2-二油酰基磷脂酰胆碱与二硬脂酰磷脂酰胆碱质量比为1:1；所述的1,2-二油酰基磷脂酰胆碱与胆固醇的质量比为1:1；

步骤三中所述的混合磷脂/氯仿溶液中混合磷脂的质量与氯仿的体积比为5mg:1mL；

步骤三中所述的混合磷脂/氯仿溶液的体积与清洗后的ITO电极的导电面的面积比为10μL:1.44cm²；

四、制备三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极：将清洗后的带有图案的聚二甲基硅氧烷印章的带有图案微结构的一面压印在干燥的涂有混合磷脂的ITO电极的混合磷脂干膜上20min，得到三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极；

步骤四中所述的压印时每1cm²清洗后的带有图案的聚二甲基硅氧烷印章上受力为0.06N；

步骤四中所述的三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极中三元混合磷脂干膜阵列为阵列的边长为50μm方形的磷脂薄膜阵列；

五、密闭制备装置的组装：将三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极与聚四氟乙烯矩形框和PDMS盖片组成密闭制备装置，清洗后的钨针电极垂直通过PDMS盖片，且清洗后的钨针电极进入到密闭制备装置内部中；再在密闭制备装置中注入蒸馏水；

步骤五中所述的图案化磷脂薄膜阵列的ITO电极与清洗后的钨针电极针尖之间的距离为450μm；

步骤五中所述的清洗后的钨针电极针尖与密闭制备装置上部PDMS盖片的距离为1550μm；

六、相分离的巨型磷脂囊泡阵列的形成过程：将密闭制备装置放在温度为65℃～120℃的加热台上，再将三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极和清洗后的钨针电极分别与信号发生器相连接，再在波形为正弦波、交流电压为3V、频率为10Hz、和温度为80℃和时间为60min的条件下，得到相分离的巨型磷脂囊泡阵列；

步骤六中所述的巨型磷脂囊泡阵列中磷脂囊泡的直径为42.8μm。

实施例二：一种基于微接触剥离技术利用点面电极电场制备相分离的巨型磷脂囊泡阵列的方法，是按以下步骤完成的：

一、清洗电极：首先使用无水乙醇对ITO电极进行超声清洗，再使用蒸馏水对ITO电极进行超声清洗，再使用氮气吹干，再使用等离子体清洗机对ITO电极进行清洗；得到清洗后的ITO电极；将钨针电极浸泡在物质的量浓度为1mol/L的盐酸中6h，再用蒸馏水进行冲洗4次，再使用氮气吹干，得到清洗后的钨针电极；

步骤一中所述的使用无水乙醇对ITO电极进行超声清洗的次数为2次，每次超声清洗的时间为15in，超声功率为70W；

步骤一中所述的使用蒸馏水对ITO电极进行超声清洗的次数为2次，每次超声清洗的时间为15min，超声功率为70W；

步骤一中所述的使用等离子体清洗机对ITO电极进行清洗时间为20s，功率为70W；

二、带有图案的聚二甲基硅氧烷印章的清洗：首先使用蒸馏水对带有图案的聚二甲基硅氧烷印章进行超声清洗，再使用无水乙醇对带有图案的聚二甲基硅氧烷印章进行超声清洗，再使用氮气吹干，得到清洗后的带有图案的聚二甲基硅氧烷印章；

步骤二中使用无水乙醇对带有图案的聚二甲基硅氧烷印章进行超声清洗的时间为10min，超声清洗的功率为70W；

步骤二中所述的带有图案的聚二甲基硅氧烷印章的图案微结构为阵列的边长为50μm的正方形，且正方形是向里凹陷的；

三、制备混合磷脂干膜：将混合磷脂溶解到氯仿中，得到混合磷脂/氯仿溶液；再将混合磷脂/氯仿溶液均匀涂覆在清洗后的ITO电极的导电面上，室温下自热干燥2h，得到干燥的涂有混合磷脂的ITO电极；

步骤三中所述的混合磷脂为1,2-二油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱和胆固醇的混合物；所述的混合磷脂中1,2-二油酰基磷脂酰胆碱与二硬脂酰磷脂酰胆碱质量比为1:1.67；所述的1,2-二油酰基磷脂酰胆碱与胆固醇的质量比为1:0.67；

步骤三中所述的混合磷脂/氯仿溶液中混合磷脂的质量与氯仿的体积比为5mg:1mL；

四、制备三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极：将清洗后的带有图案的聚二甲基硅氧烷印章的带有图案微结构的一面压印在干燥的涂有混合磷脂的ITO电极的混合磷脂干膜上47min，得到三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极；

步骤四中所述的压印时每1cm²清洗后的带有图案的聚二甲基硅氧烷印章上受力为0.06N；

步骤四中所述的三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极中三元混合磷脂干膜阵列为阵列的边长为50μm方形的磷脂薄膜阵列；

五、密闭制备装置的组装：将三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极与聚四氟乙烯矩形框和PDMS盖片组成密闭制备装置，清洗后的钨针电极垂直通过PDMS盖片，且清洗后的钨针电极进入到密闭制备装置内部中；再在密闭制备装置中注入蒸馏水；

步骤五中所述的图案化磷脂薄膜阵列的ITO电极与清洗后的钨针电极针尖之间的距离为355μm；

步骤五中所述的清洗后的钨针电极针尖与密闭制备装置上部PDMS盖片的距离为1645μm；

六、相分离的巨型磷脂囊泡阵列的形成过程：将密闭制备装置放在温度为65℃～120℃的加热台上，再将三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极和清洗后的钨针电极分别与信号发生器相连接，再在波形为正弦波、交流电压为3.5V、频率为10Hz、温度为80℃和时间为210min的条件下，得到相分离的巨型磷脂囊泡阵列；

步骤六中所述的巨型磷脂囊泡阵列中磷脂囊泡的直径为32.25μm。

图1为实施例一步骤四中制备三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极过程的示意图；图1中1为将清洗后的带有图案的聚二甲基硅氧烷印章，2为干燥的涂有混合磷脂的ITO电极，3为三元混合磷脂干膜阵列的ITO电极；

图2为实施例一步骤五中所述的密闭制备装置的结构示意图，图2中1为干燥的涂有混合磷脂的ITO电极，2为清洗后的钨针电极，3为聚四氟乙烯矩形框，4为PDMS盖片，5为信号发生器，A为清洗后的钨针电极针尖与密闭制备装置上部PDMS盖片的距离，B为干燥的涂有混合磷脂的ITO电极与清洗后的钨针电极针尖之间的距离；

图3为实施例一制备的相分离的巨型磷脂囊泡阵列的荧光显微镜图片。

从图3可知1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和胆固醇三相混合制备的巨型磷脂囊泡形态良好，阵列规整，相分离清晰可见。