分层硅石纳米膜的制造和其用于核酸的固相提取的用途

摘要

本发明基于硅石沉积法和由热收缩诱导的自起皱提供在薄的聚合物膜上制造硅石纳米结构的新颖的方法。这些微米尺度结构和纳米尺度结构已经极大地扩大硅石的比表面积，因此硅石纳米膜可以用于核酸的固相提取。本发明硅石纳米膜适于核酸纯化和分离并且在DNA回收收率和DNA回收完整性方面展示比商购的颗粒更好的性能。此外，硅石纳米膜由于明显扩大的硅石的比表面积，而具有极其高的核酸容量。还提供包括硅石纳米膜的使用方法和装置。

说明书

相关申请的引用

本申请要求于2013年8月5日提交的美国临时专利申请第61/862,319 号的权益，其为了所有目的犹如充分地陈述的一样通过引用特此并入本 文。

政府利益声明

本发明根据由美国国立卫生研究院(NationalInstituteofHealth)授予的 资助号CA155305和CA151838在政府支持下进行。政府在本发明中拥有 某些权利。

发明背景

在核酸分析中，基本问题是样品制备。被研究的样品通常包括带有可 能干扰随后的分离和分析的干扰、部分不溶性成分(称为碎片)的细胞或组 织。此类不溶性成分特别是在从粪便(stool)/排泄物(feces)、血液、疣、钙 化的结构(骨)、或其他重度坏死组织样品中分离核酸的情况下出现。然而， 碎片以最宽泛的含义还包括可溶性组分，例如从红细胞中释放的血红蛋 白，其以大大过量存在并且在核酸的分离期间将被除去。

从样品，例如细胞、组织、植物、细菌、病毒颗粒、血液、血清、或 血浆中分离核酸是用于下游遗传分析的重要步骤。常规地，液相提取技术， 例如苯酚/氯仿沉淀法被广泛地使用。虽然这些方法产生高质量的核酸，但 它们是费力的、耗时的以及高度操作者依赖性的。固相提取技术是受欢迎 的可选物。当处理大量样品时，它们常常是选择的方法。常用的固相基底 包括提供用于核酸结合的大的表面积的硅石旋转柱和硅石磁性颗粒。然 而，这些多孔基质和微米/纳米颗粒诱导作为流动和颗粒混合的结果的 DNA剪切，导致降低的DNA完整性。

福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品的分子分析代表需要样品制备的进 展的另一个方面。尽管对于分子生物标记物的增长的需要和证明的可能的 优点，然而已经证明难以在患者的诊断和管理中常规地使用它们。此失败 的一个原因是获得、快速处理、储存、以及在临床环境中运输迅速冷冻的 组织样品的后勤方面的挑战。标准医院组织处理包括在甲醛中固定，随后 是在石蜡块中包埋，然后是这些块的随后的切片和染色产生FFPE样品。

如果这些FFPE样品可以被用于分子分析，则存在使当前医学实践发 生革命的可能性。在医院病理部门中获得的FFPE块然后可以使用除了标 准形态学和组织学分析之外的较新的分子方法常规地被测定。此外，因为 FFPE样品通常被医院病理部门储存许多年，所以还可以进行可追溯的分 子评价，允许研究者大规模地用已知的临床结果进行分子流行病学研究。 需要新的技术，使得分子病理测定可以被设想或被调整以对这些FFPE样 品起作用。

然而，因为FFPE保存最初被设计以使形态学和组织学特征稳定，而 不是保存分子信息，所以由于FFPE保存过程、由于氧化、以及由于差的 储存条件(即，在室温下长期存档)，被包含在其中的DNA/RNA常常是成 碎片的。此外，FFPE组织包含污染的福尔马林和石蜡以及可能抑制下游 测定的重度交联的DNA/RNA。

如此，对开发允许从临床样品(包括FFPE样品)中更容易地分离和纯化 核酸的新的分离材料和方法存在未满足的需要。

发明概述

本发明人基于新颖的且便宜地制造的分层硅石纳米膜(已经被命名为 “纳米结合(Nanobind)”)，已经开发了新的DNA/RNA提取方法。纳米结合 是包含微米尺度褶皱和纳米尺度硅石片的分层形貌(hierarchicaltopography) 的聚合物基底。不同于赋予DNA/RNA断裂剪切力的珠和柱，无孔纳米结 合基底可以结合和释放DNA/RNA，而不使其断裂，这以比珠和柱更简单 的过程(例如，没有磁体、高速离心、或管转移)实现了与金标准苯酚氯仿 提取法相当的DNA/RNA完整性(>48kbp)。此外，纳米结合具有大于采用 珠和/或柱的已知方法至少5-30倍的结合能力。已知在测定中使用增加的 起始材料可以补偿受损伤的FFPEDNA/RNA的有害的影响。因此，纳米 结合实现高的DNA完整性与其较高的提取效率组合的能力以及其将明显 更多的组织加载进入单一提取中的能力可以大大地提高分子测定灵敏度 和再现性(即，更多更高质量的DNA/RNA)。

根据一个实施方案，本发明提供硅石纳米膜，所述硅石纳米膜包括热 收缩聚合物核并且涂覆有二氧化硅层，其中二氧化硅层包括多个微米尺度 褶皱和纳米尺度硅石片。

根据另一个实施方案，本发明提供用于制备硅石纳米膜的方法，所述 方法包括：a)将二氧化硅的层沉积至具有原始大小的聚合物膜或聚合物核 上；以及b)在足以允许聚合物膜或聚合物核收缩的温度和时间下，加热a) 的组合物，并且其中聚合物膜或聚合物核的收缩在硅石纳米膜上的硅石层 的表面上产生硅石微米结构和/或纳米结构。

根据另外的实施方案，本发明提供用于从样品中提取核酸的方法，所 述方法包括：a)获得包含核酸的样品；b)使样品与充分量的硅石纳米膜接 触；c)允许在样品中的核酸吸附至硅石纳米膜上；d)洗涤硅石纳米膜以除 去任何非核酸组分；以及e)使核酸从硅石纳米膜中脱附以获得来自样品 的分离的和纯化的核酸。

根据一个实施方案，本发明提供用于从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE) 样品中提取核酸的方法，所述方法包括：

a)获得包含核酸的FFPE样品；b)将样品脱石蜡；c)使所述样品与充 分量的硅石纳米膜接触；d)允许在样品中的核酸吸附至硅石纳米膜上；e) 洗涤硅石纳米膜以除去任何非核酸组分；以及f)使所述核酸从硅石纳米膜 脱附以获得来自所述样品的分离的和纯化的核酸。

根据一个实施方案，本发明提供用于从样品中提取核酸的装置，所述 装置包括具有至少一个开口的设备，并且还包括在该设备中的一个或更多 个硅石纳米膜，该设备能够保持液体样品或组织样品。

根据一个实施方案，本发明提供试剂盒，其包括一个或更多个硅石纳 米膜以及硅石纳米膜用于从样品分离或纯化DNA或RNA的使用说明。

附图简述

图1是描绘本发明的硅石纳米膜的一个实施方案的制备的示意图。简 单的且便宜的热塑方法被用于产生高收率、高纯度、以及高完整性DNA 提取的具有纳米尺度形貌的无孔、刚性硅石膜。

图2描绘多个硅石纳米膜表面的SEM图像，其示出取决于沉积的氧 化物的厚度以纳米尺度片为顶部的微米尺度褶皱的分层表面形貌。在2nm 硅石层的情况下，膜仅从表面呈现轻微的微米褶皱上升(图2A1)。它们是 平滑的，无覆盖的纳米结构(图2A2)。在20nm处，微米褶皱生长更高并 且开始更密集地堆积(图2B1)。近处观察揭示，纳米褶皱开始在微米褶皱 上出现，形成二级分层结构(图2B2)。而在50nm处，纳米片与覆盖在微 米褶皱上的纳米褶皱一起被观察到(图2C1和2C2)。当硅石层厚度被提高 至100nm时，从几十纳米至微米范围内的大量硅石片出现(图2D1和2D2)。 随着硅石层的厚度增大，这些片开始代替那些纳米褶皱，并且当硅石厚度 超过150nm时，它们完全代替微米褶皱(对于150nm，图2E1和2E2，对 于200nm，图2F1和2F2)。

图3示出了本发明的一个实施方案的示意图。硅石纳米膜基底(红色， 帽中)可以直接地被整合进入PCR(1.5ml)管中，用于流线型的DNA提取和 下游分析。通过使管翻转和旋转进行结合，而通过竖立和低速旋转减慢进 行洗脱。

图4比较使用来自两个不同供应商的磁珠、具有200nm的氧化物的 硅石纳米膜和具有5nm的氧化物的硅石纳米膜进行的DNA提取。由于高 的表面积，具有200nm的氧化物的纳米膜示出最高的DNA回收收率。4μg 的商购纯化的人类基因组DNA被用作起始材料。

图5示出使用Qiagen柱、Qiagen珠、以及本发明的硅石纳米膜进行 的提取的比较，指示硅石纳米膜能够具有较高的DNA结合能力。约3-4x 10⁶个细胞用作起始材料。此细胞数包含约20-25μg的DNA。

图6示出本发明的硅石纳米膜的DNA结合的线性度。在一个实施方 案中，一块6mm的纳米结合被用于从在1个至2千5百万个之间的结肠 直肠癌细胞的起始输入中分离DNA。提取的DNA的量随在此范围内的的 输入细胞而线性地变化，这指示甚至在2千5百万个细胞下，膜仍需要DNA 来饱和。这大于标准柱可以容纳的5-30倍。

图7描绘用硅石纳米膜比用DNA分离的其他商业方法有更少的DNA 剪切。相比于通过苯酚氯仿法获得的对照DNA，使用磁性颗粒(P1和P2) 分离的DNA被剪切成更小的片段。最大的DNA剪切发生在使用P2(直径 约100nm)颗粒分离的DNA中。相比之下，使用硅石纳米膜分离的DNA 保持与对照DNA相当的完整性。

图8比较使用本发明的硅石纳米膜相比于苯酚氯仿提取法分离的 DNA的完整性。凝胶电泳证明，硅石纳米膜提取法产生与通过苯酚氯仿法 提取的那些相当的高分子量DNA(超过23kb)。

图9是使用磁性微颗粒法对本发明的硅石纳米膜，DNA可以如何变成 被剪切的示意性例证。

图10描绘从在1个至2千5百万个之间的输入细胞的核酸的分离以 及使用PicoGreen(x轴)和吸光度(y轴)定量。测量结果之间的差异指示， RNA和DNA两者被共提取。约60％的提取的核酸由RNA组成。

图11是凝胶，示出使用本发明的硅石纳米膜提取的DNA适于在PCR 中使用。PCR对商购基因组DNA和对使用纳米结合和苯酚氯仿提取的 DNA进行。所有3个样品成功地扩增预期的148bpGAPDH靶，指示成功 的提取和PCR相容性。

发明详述

根据一个实施方案，本发明提供硅石纳米膜，其包括聚合物核并且涂 覆有二氧化硅层，其中聚合物核是热收缩的并且二氧化硅层包括多个硅石 微米结构和纳米结构。

如本文所使用的，术语“硅石纳米结构”意指在聚合物核上的硅石的三 维构象，所述聚合物核可以包括诸如微米褶皱、纳米褶皱以及硅片的结构， 大小范围在从几十纳米至微米内，聚合物核的实例可见于图2中。

如本文所使用的，术语“硅石”意指二氧化硅和二氧化硅衍生物，特别 是SiO₂晶体和SiO₂的其他形式，例如包含SiO₂的硅藻、沸石、无定形二 氧化硅、玻璃粉、硅酸、水玻璃、以及硅酸铝和活化的硅酸盐。

在本发明的硅石纳米膜上的分层模式是基于沉积有硅石的热可收缩 聚合物膜的热诱导的表面起皱。通过使用金属的薄膜涂覆的预拉伸的软聚 合物基底收缩或溶胀引起的表面褶皱的使用是制造纳米材料的一种简单 且低成本的方法。由于聚合物基底和硬膜之间的不同的收缩系数或膨胀系 数，应力将在膜内累积并且最后导致自发的表面起皱(图1)。

如本文所使用的，术语“聚合物”意指能够热收缩的任何聚合物基底。 在一些实施方案中，聚合物是热塑性聚合物。如本文所使用的，术语“热塑 性”意指高于特定的温度变成柔软的或可塑造的并且在冷却之后返回至固 态的聚合物。热塑性塑料可以包括，例如诸如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、 聚碳酸酯、聚苯乙烯(PS)以及环状聚烯烃(PO)聚合物的聚合物。

硅石纳米膜可以使用最常用的聚合物基底被制造，包括例如预拉伸的 热塑性塑料，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯、聚苯乙烯(PS) 以及环状聚烯烃(PO)聚合物。硅石被沉积在可收缩的PO膜上。在升高的 温度下温育之后，由于前述提及的机制，聚合物膜收缩并且硅石形成纳米 结构(图2)。

在一些实施方案中，硅石纳米膜的聚合物核选自由环状聚烯烃、聚苯 乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚乙烯、氟化乙烯丙烯、 聚四氟乙烯、以及聚偏二氟乙烯组成的组。

在一些实施方案中，硅石纳米膜的二氧化硅层具有在约2nm至约500 nm之间的厚度。

在一些实施方案中，硅石纳米膜的聚合物核具有在约5μm和5mm之 间的收缩厚度。

在一些实施方案中，硅石纳米膜的聚合物核具有在约5μm和500μm 之间的预收缩厚度(pre-shrunkenthickness)。

在一些实施方案中，构成硅石纳米膜的硅石用本领域已知的其他化合 物或组分被衍生化。在一些实施方案中，硅石可被用氨丙基、氯丙基、十 八烷基、辛基、季铵基、二乙基氨乙基、磺酸基、苯基、生物素、链霉亲 和素、抗体、或酶衍生化。

在制备硅石纳米膜的过程中形成的精确的纳米结构取决于被沉积的 涂层的厚度或被沉积的二氧化硅层的厚度。随着硅石层变厚，硅石纳米膜 的比表面积大大地被提高，并且伴随地DNA结合能力提高。因此，与商 购硅石柱和磁性颗粒比较，本发明的硅石纳米膜具有较高的DNA回收收 率。本发明的硅石纳米膜能够以高的收率和与金标准苯酚氯仿法相当的质 量从培养的人类细胞中提取DNA。

本发明的硅石纳米膜可以被制造成适于特定目的的任何形状。硅石纳 米膜可以是平面的，或呈珠构型。硅石纳米膜可以是圆形的、方形的或任 何特定的形状。在一个实施方案中，硅石纳米膜是圆形的并且可以纳入(fit into)测试管。在可选的实施方案中，硅石纳米膜可以被调整以纳入用于流 通分析(flow-throughanalysis)的柱或移液管吸头，或能够保持样品的任何其 他设备。

在一个实施方案中，本发明提供用于制备硅石纳米膜的方法，所述方 法包括：a)将二氧化硅的层沉积至具有原始大小的聚合物膜或聚合物核上； 以及b)在足以允许聚合物膜或聚合物核收缩的温度和时间下，加热a)的组 合物，并且其中聚合物膜或聚合物核的收缩在硅石纳米膜上的硅石的层的 表面上产生硅石微米结构和/或纳米结构。

使用简单的、便宜的、且创造性的热塑性方法制造硅石纳米膜。在一 些实施方案中，通过任何已知的沉积手段，将约2nm至约500nm的范围 的二氧化硅沉积在5μm至约500μm厚的聚烯烃膜上。沉积法的实例包括 但不限于化学气相沉积法、电泳沉积法、浸渍涂覆法、物理气相沉积法、 电子束气相沉积法、溅射法、旋转涂覆法、或液相沉积法。

然后，将硅石涂覆的聚烯烃膜在烘箱中在足以使聚合物收缩的温度热 收缩。温度可以因使用的聚合物的类型和聚合物的起始厚度而不同。任何 加热手段可以被使用，例如红外加热器、热风枪、或电阻加热元件。

在一些实施方案中，聚合物在100℉和500℉之间的温度范围被加热。 在一个实施方案中，聚合物在250℉被加热。

用于收缩过程的加热时间还可以因使用的聚合物的类型和聚合物的 起始厚度而不同。

在一些实施方案中，聚合物被加热持续在10秒和10分钟之间。在一 个实施方案中，聚合物被加热持续3分钟。

聚合物的热收缩引起膜面积大小收缩超过95％，同时厚度增加，并且 产生以纳米尺度片为顶部的微米尺度折叠的分层结构。然后，硅石纳米膜 可以按照各种应用需要被制造成各种形状或大小。

在一个实施方案中，硅石纳米膜可以被冲压成不同直径的圆。在一个 实施方案中，6mm直径块可以被使用，其能够纳入常用1.5ml管，并且 其每个能够结合＞150μg的DNA。初步结果已经示出，硅石纳米膜保持稳 定超过至少1个月(数据未示出)。

本领域技术人员将理解，本发明的硅石纳米膜可以被模塑或被制造成 用于不同用途的各种形状。在一个实施方案中，硅石纳米膜可以使用冲压 机被制作成任何直径的平面圆形形状。在一些实施方案中，直径大小可以 被制成适应各种测试管或细胞培养管或细胞培养板或细胞培养盘。如在图 3中所示出的，在一个实施方案中，6mm圆形硅石纳米膜可以纳入1.5ml 管的帽并且被用于核酸分离。这些管可以被预制并且可用作试剂盒，所述 试剂盒可以包括，例如与用于样品制备和清理的试剂一起的使用说明书。

技术人员可以设想硅石纳米膜的其他用途，例如呈柱形式。例如，在 另一个实施方案中，不同直径的玻璃或塑料的毛细管可以具有用硅石纳米 膜涂覆的其内表面，用于核酸提取的连续流动法。

根据另一个实施方案，珠可以被制造为硅石纳米膜涂覆外表面。然后， 这些珠可以被放在如具有圆形的管中，或放在用于连续流动法的柱中。

根据又另一个实施方案，硅石纳米膜可以在微流体装置中使用。微流 体装置是在某些实施方案中包括具有包埋在其中的硅石膜的微流体通道 的设备。硅石纳米膜可以被附接在装置上空间界定的位置。

根据又另一个实施方案，硅石纳米膜可以以芯片形式被使用。芯片是 在某些实施方案中包括包含多个离散的硅石纳米膜区的固体基底的设备。 硅石纳米膜可以被附接在基底上空间界定的位置。

硅石纳米膜可以以如本领域技术人员理解的各种各样的方式被附接 至芯片。硅石纳米膜可以首先被合成，随后附接至芯片，或可以在芯片上 直接被合成。

用于芯片的固体基底可以是可以被改性以包含适于硅石纳米膜的附 接或缔合的离散的单独的位点的材料并且顺从于至少一种检测方法。基底 的代表性实例包括玻璃和改性的或功能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸树脂 (acrylics)、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、 聚丁烯、聚氨酯、Teflon等)、多糖、尼龙或硝酸纤维素、树脂、硅石或基 于硅石的材料，包括硅和改性的硅、碳、金属、无机玻璃以及塑料。基底 可以允许光学检测而没有明显的发荧光。

基底可以是平面的，尽管基底的其他构造也可以被使用。同样地，基 底可以是弹性的，例如弹性泡沫，包括由特定的塑料制成的闭孔泡沫(closed cellfoam)。

如上文所描述的，芯片和硅石纳米膜可以被用用于两者的随后的附接 的化学功能基团衍生化。例如，芯片可以用化学功能基团，包括但不限于 氨基、羧基、桥氧基或巯基来衍生化。使用这些功能基团，硅石纳米膜可 以使用功能基团直接或间接使用连接基被附接在硅石纳米膜上。

在一些实施方案中，当经受热收缩时，聚合物膜或聚合物核收缩至其 原始大小的约0.1％至约75％。

根据一个实施方案，本发明提供用于从样品中提取核酸的方法，所述 方法包括：a)获得包含核酸的样品；b)使样品与充分量的硅石纳米膜接触； c)允许在样品中的核酸吸附至硅石纳米膜上；d)洗涤硅石纳米膜以除去任 何非核酸组分；以及e)使核酸从硅石纳米膜将脱附以获得来自样品的分离 的和纯化的核酸。

如本文所使用的，术语“样品、或生物样品”指的是包括细胞或细胞材 料的任何样品，特别是细胞、冷冻的细胞小球、固定细胞、粪便/排泄物、 血沉棕黄层(buffycoat)(即，血液的白细胞级分)、腹水、拭子、特别是面颊 拭子或咽喉拭子、子宫颈拭子、痰、器官斑点(punctate)、精液、组织样品、 固定组织样品、固定的或非固定的组织样品的组织切片、特别是冷冻切片 和石蜡切片、特别是福尔马林固定石蜡切片、肿瘤材料、活组织检查样品、 血液样品、特别是全血或血液级分、细胞悬浮液、以及最广泛意思的包括 细胞成分的所有样品，其中完整的细胞和细胞成分两者将被包括。此外， 该术语还包括其他含核酸的生物材料，例如比如血清或血浆，特别是含病 毒的血清或血浆、HIV和HCV感染的血清样品、分泌物、CSF、胆汁、淋 巴液、尿。同样地，它可以是源自生物化学过程或生物技术过程并且将随 后被纯化的含核酸材料。

在一些实施方案中，使用本发明的硅石纳米膜用于提取核酸的方法包 括在步骤a)之前使样品与裂解溶液和/或消化溶液接触，随后是一个或更多 个洗涤步骤以除去细胞碎片和裂解组分和/或消化组分。

在一些实施方案中，使用本发明的硅石纳米膜用于提取核酸的方法包 括在步骤a)使核酸与离液剂接触。这帮助核酸吸附或结合至纳米膜上的硅 石微米结构和纳米结构。

在一些实施方案中，使用本发明的硅石纳米膜用于提取核酸的方法还 包括在步骤b)使样品与充分量的硅石纳米膜在水醇溶液的存在下接触。 熟知的是，水醇溶液帮助将核酸从样品中沉淀离开其他细胞组分或组织组 分。

在一些实施方案中，使用本发明的硅石纳米膜的提取核酸的方法包括 两个、三个或更多个洗涤步骤，例如比如在步骤d)。这些洗涤可以包括缓 冲液、醇、或已知适于在核酸的分离和纯化中使用的其他试剂。

为了DNA的纯化，优选将生物有效量的RNA酶添加至样品，借此 RNA可以被消化并且完整的DNA可以从样品中被分离。RNA酶消化可以 在提取期间、最早在裂解之后、以及最晚在纯化结束时洗脱之后以不同的 时间进行。然而，优选在共纯化的RNA的存在下检测DNA，即通过省略 RNA酶步骤或通过使用能够选择性分离DNA和排除RNA的缓冲条件。

为了分离RNA，优选将生物有效量的DNA酶添加至样品。这导致 DNA被“消化”并且进入溶液，同时未消化的RNA可以从溶液中分离。DNA 酶消化可以在提取期间、最早在裂解之后、以及最晚在纯化结束时洗脱之 后以不同的时间进行。

本发明的方法可以被用于使样品富含特定类型的核酸，例如DNA或 RNA。例如，在步骤d)人们可以添加DNA酶以从样品中的核酸除去DNA 并且使样品富含RNA。同样地，技术人员可以在步骤d)将RNA酶添加至 样品以从样品中的核酸除去RNA并且使样品富含DNA。

本发明的方法可以被用以使样品富含特定类型的核酸，例如DNA或 RNA或长核酸或短核酸。例如，在结合步骤c)和洗涤步骤d)期间，缓冲液 中醇的百分数可以被用于调整溶解度，这将导致特定的物质的优先的结合 和洗脱。盐也可以被用于通过调整相对溶解度优先地提取特定类型的核 酸。

在一些实施方案中，使用本发明的硅石纳米膜提取核酸的方法包括在 步骤d)之后的干燥步骤。

本领域技术人员将理解，被结合或被吸附在本发明的硅石纳米膜上的 核酸可以通过使用本领域已知的任何洗脱溶液从纳米膜中被脱附。典型的 洗脱溶液可以是包含，例如(0.5M)醋酸铵、10mM醋酸镁和1mMEDTA 的混合物的缓冲液。另一种典型的洗脱溶液可以是包含，例如10mMTris 碱和1mMEDTA的混合物的缓冲液。又另一个典型的洗脱溶液可以是水。

根据另一个实施方案，本发明提供用于从福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE)样品中提取核酸的方法，所述方法包括：a)获得包含核酸的FFPE 样品；b)将样品脱石蜡；c)使样品与充分量的硅石纳米膜接触；d)允许在样 品中的核酸吸附至硅石纳米膜上；e)洗涤硅石纳米膜以除去任何非核酸组 分；以及f)使核酸从硅石纳米膜中将核酸脱附以获得来自所述样品的分离 的和纯化的核酸。

用于从FFPE样品中提取核酸的方法将被理解以具有如上文描述的非 FFPE样品提取法中描述的相同的基本原理。基本差异是脱石蜡步骤的添 加。FFPE样品的脱石蜡是本领域已知的。

在一些实施方案中，FFPE样品的脱石蜡包括使样品与有机溶剂接触 以溶解石蜡。有机溶剂的合适的实例包括但不限于二甲苯、十六烷、甲苯、 5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮；萜或异链烷 烃、以及2-丁氧基乙醇。在其他实施方案中，矿物油可以被使用，伴随加 热或不加热样品以溶解石蜡。在可选的实施方案中，FFPE样品的脱石蜡 还可以在单独加热样品而没有任何有机溶剂下进行。人们可以将缓冲液添 加至样品，加热样品持续充分的时间以使石蜡熔化，并且然后离心样品， 同时加热。熔化的石蜡将上升至顶部并且固化。

在一些实施方案中，在脱石蜡步骤之后，该方法包括将有机溶剂除去， 并且洗涤样品。该方法的其余部分将与本文描述的非FFPE样品法一样进 行。

如本文所使用的，“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”以及“核酸分 子”，并且通常意指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链的或双链的、 合成的或从天然来源获得的(例如，分离的和/或纯化的)，其可以包含天然 的、非天然的或改变的核苷酸，并且其可以包含天然的、非天然的或改变 的核苷酸间键，例如氨基磷酸酯键或硫代磷酸酯键、而不是见于未修饰的 寡核苷酸的核苷酸之间的磷酸二酯。通常优选的是，核酸不包括任何插入、 缺失、倒位、和/或取代。然而，在某些情况下，如本文讨论的，对于核酸 可以适于包括一个或更多个插入、缺失、倒位、和/或取代。

在一个实施方案中，本发明的核酸是重组体。如本文所使用的，术语 “重组体”指的是(i)通过将天然的或合成的核酸区段连接至可以在活细胞中 复制的核酸分子，在活细胞外构建的分子，或(ii)由上文(i)中描述的那些的 复制产生的分子。为了本文的目的，复制可以是体外复制或体内复制。

本发明的实施方案中分离的核酸可以基于使用本领域已知的方法的 化学合成和/或酶促连接反应被构建。见，例如Sambrook等人，(编 辑)MolecularCloning,ALaboratoryManual,第3版,ColdSpringHarbor LaboratoryPress,NewYork(2001)以及Ausubel等人,CurrentProtocolsin MolecularBiology,GreenePublishingAssociatesandJohnWiley&Sons,NY (1994)。例如，核酸可以使用天然存在的核苷酸或被设计以增强分子的生 物稳定性或以增强杂交之后形成的双链体(duplex)的物理稳定性的各种修 饰的核苷酸(例如，硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)化学地被合成。 可以被用以产生核酸的修饰的核苷酸的实例包括但不限于5-氟尿嘧啶、5- 溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧 啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲 基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷 (β-D-galactosylqueosine)、肌苷、N⁶-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1- 甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧 啶、5-甲基胞嘧啶、N⁶-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿 嘧啶、5-甲氧氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5'-甲氧基羧基 甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N⁶-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5- 羟乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿 嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、 3-(3-氨基-3-N-2羧基丙基)尿嘧啶、以及2,6二氨基嘌呤。可选地，本发明 的核酸中的一种或更多种可以购自公司，例如MacromolecularResources (FortCollins,CO)和Synthegen(Houston,TX)。

如本文所使用的，术语“分离的和纯化的”意指实质上不与其他蛋白质 或多肽缔合的核酸，例如作为通过使用本发明的硅石纳米膜已经从细胞和 其他污染物分离的天然存在的蛋白质。

如本文所使用的，在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中“同一 的”或“同一性”可以意指，序列具有在指定的区域内是相同的残基的指定的 百分数。百分数可以通过以下来计算：最适宜地使两个序列对齐，比较在 指定的区域内的两个序列，确定在两个序列中同一性残基出现的位置的数 目以产生匹配的位置的数目，将匹配的位置数除以在指定的区域内的位置 的总数，以及将结果乘以100以产生序列同一性的百分数。在其中两个序 列是不同长度或对齐产生一个或更多个交错的末端以及比较的指定区域 仅包括单一序列的情况下，单一序列的残基被包括在分母中而不是计算的 分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是 相等的。同一性可以手动地或通过使用计算机序列算法，例如BLAST或 BLAST2.0进行。

如本文所使用的，术语“细胞”可以指的是原核细胞和真核细胞两者。

术语“使样品裂解”包括破开样品中的细胞或细胞结构。其包括尤其是 机械裂解法(例如，超声法)、热裂解(例如，冻融循环、加热样品)、以及化 学裂解(例如，用洗涤剂)。然而，表述“使样品裂解”不限于细胞并且还可 以指的是通过描述的方法从非细胞、生物结构或复合物中释放核酸。

术语“离液条件”指的是在离液剂或离液化合物的存在下的溶剂条件。 离液剂或离液化合物是改变或破坏蛋白质、核酸、以及蛋白质核酸复合物 的二级结构、三级结构、以及四级结构，同时一级结构保持完整的化合物。 在溶液中，在离液条件下，生物分子，特别是蛋白质、蛋白质核酸复合物、 以及核酸的分子内相互作用被破坏，因为离液化合物干扰生物分子中的稳 定化分子内相互作用，例如氢键、范德华力、以及疏水作用。离液化合物 通常具有大体积离子，其由于其大小可以干扰分子内相互作用并且降低溶 剂的极性，结果从而破坏分子内的和分子间的氢键。因此，许多蛋白质沉 淀；然而双链核酸区段的螺旋结构被保持。通过将离液化合物添加至细胞 裂解液或细胞悬浮液，蛋白质可以被沉淀，同时核酸保持在溶液中。在离 液条件下，核酸与基于二氧化硅的基质的结合大大地被帮助。离液化合物 包括，例如高分子量尿素溶液(例如，6mol/l至8mol/l尿素)、胍盐溶液(例 如，6mol/l盐酸胍)、高分子量锂盐(例如，4.5mol/l高氯酸锂)。离液阴离 子包括阴离子F^-、PO₄^3-、SO₄^2-、CH₃COO^-、Cl^-、以及特别是Br^-、I^-、 NO₃^-、ClO₄^-、SCN^-、以及Cl₃CCOO^-。离液阳离子包括阳离子Li⁺、Mg²⁺、 Ca²⁺、Ba²⁺、以及特别是胍盐阳离子[CH₆N₃]⁺。用于核酸分离的优选的离液 化合物是异硫氰酸胍([CH₆N₃]⁺SCN^-)以及盐酸胍。

如本文所使用的，术语“分离”意指将尽可能所有不是分离的实际目标， 即实质上不是核酸，的生物的或化学的物质或组分除去。特定地，这些物 质的分离有助于在实际的结合、富集、纯化、以及目标分子的随后监测期 间避免干扰或扰乱(disturbance)。

如本文所使用的，术语“细胞碎片”意指不是核酸分离的首要目标并且 将通过纯化步骤或负选择步骤从实际目标分子分离的所有生物组分。在细 胞样品的裂解之后，这包含特别是在水溶液中是不溶性的且难以裂解的细 胞组分，例如比如坏死组织成分、骨或石灰结构(limestructure)，特别 是微小钙化、而且也包含爆发或形态学上改变的红细胞、类疣结构以及类 乳头瘤组织结构、以及还包含具有复杂的、难以裂解的糖包衣的特定的细 菌(例如，分支杆菌)。此外，这包括蛋白质、膜成分、由于固定特定地交 联的结构等。然而在个体情况下，它还可以是根据上文描述的裂解过程被 释放并且将被分的水溶性组分离。实例是在红细胞的裂解(例如，通过低渗 缓冲条件)之后，以大量和关于核酸的过量的摩尔被释放的并且在身体样品 的进一步处理之前，将被分离的血红蛋白。

如本文所使用的，术语“磁性颗粒”意指有机的或无机的磁性颗粒两者。

术语“裂解缓冲液”包括包含能够引起或帮助细胞、细胞体系、细胞成 分、或其他生物复合物或结构的破坏的至少一种物质的缓冲液。物质尤其 常常选自洗涤剂(TritonX-100、SDS、或类似物)和酶促试剂(例如特定地蛋 白酶K)的组。还被包括的是选自水溶液、缓冲的溶液或未缓冲的溶液(在 最简单的情况下是水)的组的试剂的使用。在裂解缓冲液中，一种或更多种 组分可以从一个或两个组或彼此组合。

根据另外的实施方案，本发明提供用于从样品中提取核酸的方法，所 述方法包括：a)获得包含核酸的样品；b)使样品与充分量的硅石纳米膜接 触；c)允许在样品中的核酸吸附至硅石纳米膜上；d)洗涤硅石纳米膜以除 去任何非核酸组分；以及e)使核酸从硅石纳米膜中脱附以获得来自所述样 品的分离的和纯化的核酸。

用硅石纳米膜提取DNA

如在图3中所描绘的，在本发明的方法的一些实施方案中，离液缓冲 液，例如AL(Qiagen,盐酸胍溶液)或类似的缓冲液、和蛋白酶、例如蛋白 酶K可以被添加至细胞并且在约50-60℃温育持续约1-2小时之间。胍和 蛋白酶K缓冲液将细胞裂解并且能够使DNA随后结合。然后，将醇溶液， 例如乙醇或异丙醇和硅石纳米膜添加至沉淀并且结合DNA。旋转溶液并且 在室温温育持续10分钟至约一小时之间的时间以允许纳米膜结合发生。 然后，用移液器吸出液体，并且用洗涤缓冲液WB1和WB2(Qiagen,乙醇 严格洗涤)或任何其他类似的洗液洗涤膜两次。接下来，将膜空气干燥以除 去任何残余的乙醇。最后，添加洗脱缓冲液，例如(Qiagen,TE缓冲液)并 且在70℃温育持续30分钟和约1小时之间以从硅石纳米膜洗脱并且脱附 DNA。这允许获得高完整性、高收率、和高纯度的DNA提取物，并且实 质的RNA与DNA共纯化。在可选的实施方案中，可使用热、表面活性剂 (例如，Triton、Tween、以及SDS)、以及离液剂(例如，盐酸胍)裂解细胞。 使用洗涤缓冲液将可溶性污染物，例如盐和蛋白质洗去。它们通常包含70％ 乙醇并且可以包含离液剂(例如，盐酸胍)和/或洗涤剂(例如，Tween)以使蛋 白质变性并且洗去蛋白质。可选地，可以使用异丙醇洗涤溶液。洗脱缓冲 液通常由TE缓冲液或DI水组成。在升高的温度下洗脱持续较长的时间可 以导致较高的提取收率。

本领域普通技术人员将理解，遍及本说明书公开的，使用本发明的硅 石纳米膜用于核酸分离的方法可以包括在除去任何细胞碎片以及裂解组 分和/或消化组分的步骤之间的另外的洗涤。

用硅石纳米膜提取FFPEDNA

在本发明的FFPE提取方法中的第一步骤包括脱石蜡(即，石蜡的溶 解)。在一些实施方案中，将厚度在5-10μm之间的厚的FFPE组织的切片 放在1.5mL管中并且添加1mL的有机溶剂，例如二甲苯(Pathol.Res.Pract., 204,633(2008)；MethodsMolBiol724,161(2011))。然后，将二甲苯除去 并且用分级的乙醇溶液洗涤样品小球以消除二甲苯并且使DNA再水化。 在其他实施方案中，脱石蜡法可以通过改变二甲苯浓度、温育时间、以及 洗涤方案而不同以确保所有石蜡被除去并且携带的二甲苯是最少。

然后，可通过将蛋白酶K(NewEnglandBiolabs)和包含6M盐酸胍的 pH7.5TE缓冲液添加至脱石蜡的小球并且在55℃温育持续约1小时进行 细胞裂解。蛋白酶K将裂解细胞并且释放核酸，同时离液的盐酸胍能够使 DNA结合至硅石纳米膜基底。在此步骤期间加热还将逆转通过福尔马林的 交联。在温育之后，乙醇将被添加至样品以使DNA沉淀并且有助于结合 至膜。然后，样品将用70％乙醇洗涤两次并且空气干燥以消除任何残余的 乙醇。然后，使用洗脱缓冲液或类似的手段，将核酸从硅石纳米膜中脱附。

在预备实验中，获得DNA和RNA两者的共纯化。为了消除RNA污 染，可以在裂解步骤之后立即将RNA酶H(NewEnglandBiolabs)添加至 样品以消化RNA。消化的RNA将不结合纳米结合基底并且将被洗去。由 于小片段相对大片段的不同溶解度，乙醇百分数对结合硅石的DNA/RNA 片段的大小具有大的影响。在消化方案中，结合缓冲液和洗涤缓冲液的乙 醇含量可以是可变的以确保所有RNA被除去。

RNAFFPE提取法

因为RNA降解比DNA降解更容易且更快发生，所以归档的FFPE样 品不可能包含可以被用于mRNA表达谱的长的RNA分子，但可以包含可 以被提取并且被分析的完整的小RNA，例如miRNA。另外，对于诊断应 用，新鲜的FFPE样品作为新鲜的冷冻样品的有活力的并且较不昂贵的可 选物出现。脱石蜡、细胞裂解、以及RNA结合与上文用于FFPEDNA样 品相同的进行，然而不是进行基底上RNA酶消化，DNA酶I(NewEngland Biolabs)消化将在蛋白酶K消化之后进行。然后，消化的DNA将被基于乙 醇的洗涤缓冲液带走。由于小片段相对大片段的不同溶解度，乙醇百分数 对结合硅石的DNA/RNA片段的大小具有大的影响。DNA酶消化方案(时 间、温度等)和结合缓冲液和洗涤缓冲液的乙醇含量是可变的以确保消化的 DNA完全被洗去。

在FFPE组织中的DNA和RNA分析

PCR形成分子分析技术的骨架。尽管这些方法通常具有高的检测灵敏 度，然而PCR对背景污染物是极其敏感的并且要求高纯度起始材料。使用 硅石纳米膜从FFPE组织中分离的DNA和RNA可以在原型表观遗传学分 析测定和遗传分析测定中被使用，包括例如甲基化特异性的qPCR、qPCR、 以及RT-PCR。

本领域普通技术人员还将理解，使用本发明的硅石纳米膜的组合物、 装置以及方法可以与本领域已知的可用于分离、纯化和分析核酸的任何其 他分析技术组合。

根据一个实施方案，本发明提供用于从样品中提取核酸的装置，所述 装置包括具有至少一个开口的设备，并且还包括在该设备中的一个或更多 个纳米膜，该设备能够保持液体样品或组织样品。在一些实施方案中，该 装置是具有闭合装置(closure)或盖子的容器。在一些实施方案中，该装置 是管，例如测试管或1.5ml离心管。对包含本发明的硅石纳米膜的管的大 小没有限制。本领域技术人员将理解，硅石纳米膜可以被包括进入设备， 例如柱的内部并且被附于例如内表面。

根据一个实施方案，本发明还提供试剂盒，其包括一个或更多个硅石 纳米膜以及，硅石纳米膜用于从样品分离或纯化DNA或RNA的使用说明。 这样的试剂盒将在具有进行核酸分离和纯化必需的其他试剂或材料的容 器中被提供。本发明的试剂盒还可以包括包含硅石纳米膜的装置或设备。

实施例

硅石纳米膜制造。用于本发明的硅石纳米膜的实施方案的制造方法的 实例在图1中被示出。以的沉积速率使用电子束(E束)物理气相沉积 法将硅石沉积在PO膜的两侧。如上文所描述的，硅石还可以通过溅射法、 低压化学气相沉积法、等离子体增强化学气相沉积法、电化学法、以旋转 在玻璃上的旋转涂覆法、以及液体沉积法被沉积。然后，将硅石涂覆的PO 膜在烘箱中在250℉烘焙持续3分钟以诱导收缩因此表面起皱。通过热诱 导的收缩，获得的膜缩回至小于其原始大小的10％，并且其表面呈现分层 的微米结构和纳米结构，所述分层的微米结构和纳米结构在扫描电子显微 镜(SEM)下被确证。

取决于沉积的硅石的厚度，这些覆盖的硅石分层结构从纳米尺度至微 米尺度变化，如在图2中所示出的。在2nm硅石层的情况下，膜仅从表 面呈现轻微的微米褶皱上升(图2A1)。它们是平滑的，无覆盖的纳米结构(图 2A2)。在20nm厚度处，硅石的微米嵴(micro-ridge)生长更高并且开始 更密集地堆积(图2B1)。近处观察揭示，硅石纳米褶皱开始在嵴上出现， 形成二级分层结构(图2B2)。在50nm硅石层的情况下，纳米片与覆盖在 微米嵴上的纳米褶皱一起被观察到(图2C1和2C2)。当硅石层厚度被提高 至100nm时，在从几十纳米至微米范围内的大量硅石片出现(图2D1和 2D2)。随着硅石层的厚度增大，这些片开始代替那些纳米褶皱，并且当硅 石沉积超过150nm时，完全代替微米嵴(对于150nm，图2E1和2E2，对 于200nm，图2F1和2F2)。这些纳米片彼此交织以形成微米尺度的二级结 构，因此分层模式保持。当硅石层增加时，更多的纳米片出现并且其微米 尺度二级结构变得越来越有序，导致较大的总硅石表面积。

在本发明的纳米膜上的从纳米尺度至微米尺度的分层硅石模式明显 地扩大硅石的比表面积，因此增强其作为用于固相提取的新颖的基底的 DNA吸附能力。为了评价作为用于DNA分离的固体基底的硅石纳米膜的 效率，将使用该纳米膜重新分离的对照DNA的回收收率与使用商购的磁 性硅石珠的回收收率比较。

使用硅石纳米膜分离DNA。使用与在图3中描绘的类似的实施方案， 使用4μg商购基因组DNA输入，使用具有200nm硅石层的纳米膜回收约 3.2μg(80％)的DNA(图4)，而使用商购的硅石磁性珠回收仅约0.8μg (20％)。然而，并非所有纳米膜具有可比较的性能。在相同的条件下，仅 具有5nm硅石层的纳米膜事实上没有呈现DNA回收，这可以通过由不同 的硅石厚度(如在图2中所示出的)造成的纳米膜的表面结构差异来解释。 硅石的较厚的沉积诱导较粗糙的表面，因此较大的比表面积，并且导致提 高纳米膜上的DNA吸附能力。

利用本发明的硅石纳米膜在培养的细胞上进行DNA提取。我们能够 从约2×10⁶个细胞中提取11±4μg的基因组DNA。此收率与金标准苯酚氯 仿法是相当的。还将使用本发明的纳米膜从培养的细胞的DNA收率与使 用商购的试剂盒，例如旋转柱和硅石磁性珠的方法相比。使用约3～4×10⁶ 个细胞，使用本发明的纳米膜回收约21.2±2.6μg的基因组DNA。与之相 比，在相同的条件下，使用旋转柱回收约9.0±2.9μg的基因组DNA，并且 使用磁性珠回收11.9±3.1μg的基因组DNA(图5)。使用旋转珠和磁性颗粒 的DNA收率分别仅是使用本发明的纳米膜的DNA收率的约42％和56％。

在膜上的分层的微米结构和纳米结构明显扩大用于DNA吸附的硅石 的总表面积，并且因此增强其DNA结合能力。为了评价硅石纳米膜的DNA 结合能力，将膜切割成具有约6mm的直径的小圆块，并且将一块放在1.5 mL管中以从在从0.5×10⁶至2.5×10⁷范围内的不同量的培养的细胞中提取 DNA。如在图6中所示出的，本发明的硅石纳米膜作为用于从以广泛范围 的样品量的培养的细胞中DNA提取的固相基底，呈现稳定的DNA收率。 具有仅28mm²的面积的微小6mm块的纳米膜在单个1.5mL管中能够从 多达2千5百万个细胞的细胞中有效地回收基因组DNA。这指示，本发明 的硅石纳米膜，由于其明显扩大的硅石表面积能够捕获多达6μg的基因组 DNA每平方毫米。与之相比，使用旋转柱或磁珠的大多数商购的试剂盒仅 可以处理多达2×10⁶个细胞每管。考虑到在图4中的容量曲线在这样的高 输入下未曾达到平台期，硅石纳米膜具有在单一管中处理大量DNA的大 的可能。

通过硅石纳米膜分离的DNA与磁性颗粒分离的DNA的比较。由于机 械应力，通过磁性颗粒分离的DNA常被剪切成小的片段。此现象通过在 凝胶电泳中运行重新分离的DNA被观察到(图7)。相比于通过苯酚氯仿法 获得的对照DNA，使用磁性颗粒(P1和P2)分离的DNA被剪切成更小的片 段。使用P2(直径约100nm)分离的DNA被剪切最明显。相比之下，使用 本发明的硅石纳米膜分离的DNA保持高的完整性。使用硅石纳米膜从培 养的细胞中提取的DNA的完整性也与使用苯酚氯仿法提取的DNA比较。 凝胶电泳示出，硅石纳米膜提取法产生与通过苯酚氯仿法提取的那些相当 的高分子量DNA(超过23kb)(图8)。

不希望被任何特定的理论所约束，为了解释用硅石纳米膜分离的DNA 分子为何保持其完整性，而用颗粒分离的那些被剪切，人们认为多个颗粒 将结合至单个长的DNA(图9)。这些颗粒单独地移动、拉伸、并最后将长 的DNA链破坏成短的片段。较小的颗粒允许更多的颗粒结合至相同的 DNA链，导致更多的破坏点，因此甚至更小的DNA片段。相比之下，当 DNA分子被吸附至硅石纳米膜上时，虽然活性表面结构是在纳米尺度尺寸 内，但纳米膜的物理尺寸是在毫米内。结果，长的DNA链能够结合至相 同的平面的膜，阻止其被拉伸和被破坏。因此，使用纳米膜分离的DNA 能够保持完整性。

FFPE提取法。将取自结肠息肉的约20块7μm厚的FFPE切片放在 1.5mL管中，使用二甲苯/分级的乙醇脱石蜡，用蛋白酶K裂解，并且经 受使用单个6mm块的硅石纳米膜的DNA提取。然后，将提取的DNA洗 涤并且在TE缓冲液中洗脱。试验一式两份地进行。PicoGreen测量指示， 硅石纳米膜成功分离201±2ng的DNA。这说明，硅石纳米膜与FFPE核 酸提取是完全相容的，并且在容易的和高性能的FFPE核酸提取方面具有 大大的可能。我们的初步试验使用分离大量DNA和RNA两者的提取化学 品。当比较从吸光度测量(其包括DNA和RNA)获得的提取收率与使用 PicoGreen测量(其仅包括DNA)获得的提取收率时，这是明显的(图10)。这 些结果指示，约60％的提取的核酸是RNA。

使用硅石纳米膜提取的DNA的PCR分析。进行初步试验以确证使用 硅石纳米膜提取的DNA不含污染物并且适于PCR。使用引物进行PCR以 扩增人类GAPDH基因的148bp区域。将使用硅石纳米膜从卵巢癌细胞中 分离的DNA与使用苯酚氯仿提取的DNA和商购的人类基因组DNA比较。 在所有情况下，预期产物被干净地扩增，指示，硅石纳米膜成功分离不含 PCR抑制剂的纯的DNA(图11)。

本文提及的所有参考文献，包括出版物、专利申请、以及专利通过引 用特此并入，其程度如同每个参考文献单独地且具体地被指示通过引用被 并入并且以其整体在本文被陈述。

除非本文另外指示或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文 中(尤其是在以下权利要求书的上下文中)使用的术语“a(一)”和“an(一)”以 及“the(该)”和相似的指示物，被解释为覆盖单数和复数两者。除非另外注 明，否则术语“包括(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”以及“包 含(containing)”被解释为是开放式的术语(即，意指“包括但不限于”)。除非 本文另外指示，否则本文值的范围的提及仅仅意图用作单独指示落在该范 围内的值的各个单独值的简写方法，并且各个单独值被并入本说明书，如 同在本文单独提及。除非本文另外指示或另外与上下文明显矛盾，否则本 文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。除非另外声明，否则本文 所提供的任何以及所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅仅意 图更好地说明本发明且不对本发明的范围施加限制。本说明书中的语言不 应解释为指示任何未要求保护的要素对本发明的实践必不可少。

本文描述了本发明的优选的实施方案，包括本发明人已知用于进行本 发明的最佳方式。在阅读前述描述后，那些优选的实施方案的变型对于本 领域普通技术人员可以变得明显。本发明人预期技术人员视需要利用此类 变型，并且本发明人意图本发明以不同于本文具体描述的方式被实施。因 此，本发明包括被适用法律许可的在附于此的权利要求书中叙述的主题的 所有修改和等同物。此外，除非本文另外指示或另外与上下文明显矛盾， 否则在其所有可能的变型中的上文描述的要素的任何组合被包含在本发 明内。