一种用于早期筛检大肠癌相关IGF2基因甲基化表型的引物、试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了一种用于早期筛检大肠癌相关IGF2基因甲基化表型的引物、试剂盒及其应用，属于疾病的早期筛检与防治领域。所述引物通过MS-HRM方法检测IGF2基因启动子区CpG岛的甲基化表型，其中正向引物具有如SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列，反向引物具有如SEQ？ID？NO.2所示的核苷酸序列。研究表明，采用该引物对待测硫化后的DNA进行MS-HRM分析，可以判断待检样品是否为人大肠癌高危人群。进一步的，本发明还提出了包含上述引物的试剂盒。采用本发明的引物或试剂盒筛检大肠癌，具有高通量、灵敏度高和特异性好等特点，能够在人外周血白细胞DNA水平上实现便捷快速地筛检大肠癌高危人群。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于筛检人大肠癌的引物及试剂盒，特别涉及一种基于人外周 血白细胞DNA水平的用于早期筛检人大肠癌的特异性甲基化检测引物、试剂盒及 其应用，属于疾病的早期筛检与防治领域。

背景技术

大肠癌(colorectalcancer,CRC)是常见的消化道恶性肿瘤之一。据 GLOBOCAN2012统计，2012年全球约有136万大肠癌新发病例，其发病率在男性 肿瘤中居第三位，在女性肿瘤中高居第二位。近年来，我国大肠癌的发病率呈逐年 上升的趋势(http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx)。据统计，2013年 全球约有69万大肠癌死亡病例。不过其死亡率在西方发达国家的大肠癌死亡率有 明显的下降趋势，究其原因，与早期筛检，早期诊断及早治疗密切相关。虽然大肠 癌的死亡率在全球范围内呈下降趋势，但发展中国家大肠癌的死亡率却有逐年上升 趋势。因此，如何提高我国大肠癌早期筛检早期诊断的水平，降低发病率和死亡率， 提高生存率已是我国大肠癌防治研究工作的重点。

大肠癌的形成是多因素作用、多基因参与、多阶段、多步骤的过程，是遗传因 素与环境因素交互作用的结果。表观遗传学改变的长期累积是导致大肠癌发生或者 加速大肠癌发展的重要分子生物学基础。然而，目前发表的绝大多数大肠癌相关甲 基化研究往往关注于肿瘤组织学水平，而针对于外周血白细胞DNA水平的基因甲 基化与大肠癌易感性的研究，并基于此进行大肠癌风险预测以鉴定大肠癌高危人群 过的研究也才刚刚起步。

最近一些研究证实，基于人外周血白细胞DNA水平的基因甲基化是一种可检 测的灵敏的肿瘤相关的标记物。与肿瘤组织DNA甲基化检测相比，外周血样本在 临床实践中更容易获得且几乎无创更容易被研究对象接受。综上所有证据提示我 们，人外周血白细胞基因甲基化表型的研究可能正好为我们理解这一关系提供了一 种更为可行更易被受试者接受的路径。因此，进一步筛选、验证有应用价值的人外 周血白细胞基因甲基化作为大肠癌早期分子标志物，探索并建立新的大肠癌早期筛 检技术，能够早期、灵敏并稳定地筛检大肠癌高危人群，以便及早采取措施进行早 预防，早治疗，可以有效降低医疗成本，节约社会资源。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于人外周血白细胞DNA水平的，用 于检测大肠癌相关IGF2基因甲基化表型的引物及试剂盒，以实现对大肠癌高危人 群的早期筛检。与常规的大肠癌筛检方法相比，本发明的方法具有创伤小、早期、 快速、高通量、灵敏度高以及特异性好等优点，能更好地应用于人大肠癌的早期筛 查。

本发明的目的主要体现为以下三个方面：

1.提供一种基于人外周血白细胞DNA水平的大肠癌特异性甲基化检测的 MS-HRM引物，用于人大肠癌的早期基因筛查。

2.建立一种人大肠癌的基因甲基化检测技术，以弥补现有筛查技术的不足。

3.提供一种用于早期筛查大肠癌高危人群的试剂盒。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术手段包括：

在人大肠癌基因组中IGF2基因启动子区的CpG岛区域设计一对甲基化特异性 高分辨率溶解曲线(MS-HRM)检测的引物；应用该对引物对待测硫化后DNA样 本进行RT-PCR和MS-HRM检测，根据MS-HRM结果判定待检样本是否为人大肠 癌样本。

第一方面，本发明提供了一种基于人外周血白细胞DNA水平的，用于早期筛 检人大肠癌相关IGF2基因甲基化表型的引物，所述引物由正向引物和反向引物组 成，引物序列如下：

正向引物：5-GGGATTTGGTTGAGGTTTTAAG-3(SEQIDNO.1)

反向引物：5-TACGACTAAAAAAACCCCTAAACTC-3(SEQIDNO.2)

第二方面，本发明提供了一种基于人外周血白细胞DNA水平的，用于早期筛 检人大肠癌的相关IGF2基因甲基化表型的试剂盒，包括以上所述的用于早期筛检 人大肠癌相关IGF2基因甲基化表型的引物。

在本发明所述的试剂盒中，优选的，所述的试剂盒中还包括2×PCRMasterMix, 25mMMgCl₂以及PCR-gradeWater。

第三方面，本发明还提供了以上所述的引物及所述的试剂盒在制备早期筛检人 大肠癌试剂中的应用。

第四方面，本发明还提供了一种利用本发明的MS-HRM甲基化检测引物或试 剂盒早期筛检人大肠癌的方法，包括如下步骤：

(1)将待检的人外周血白细胞DNA进行硫化修饰处理，取硫化后DNA，作 为RT-PCR的反应模板进行MS-HRM检测；

(2)在总体积为10微升的RT-PCR反应体系中，加入1～2微升的待测硫化后 DNA作为模板，加入正向引物和反向引物；其他试剂按照常规方法及剂量加入；

(3)进行RT-PCR反应，反应条件为：95℃预变性10分钟；95℃变性10秒， 56℃复性30秒，72℃延伸20秒，采集荧光信号，循环45次；

(4)进行MS-HRM检测，检测条件为：95℃预变性1分钟；40℃复性1分钟， 从60℃梯度升温至98℃，并采集荧光信号，40℃复性10分钟；

(5)对MS-HRM结果进行Tm-Calling和Gene-Scanning分析：如果待测样品 与阳性标准品的Tm值相符，且待测样品的甲基化水平大于0.5％，即Cut-Off值取 为0.005，结果为阳性；反之，结果为阴性。

在本发明所述的方法中，优选的，硫化后DNA的量至少为20ng/反应。

在本发明所述的方法中，优选的，正向引物和反向引物在RT-PCR反应体系 中的终浓度均为0.4μM。

在本发明所述的方法中，优选的，步骤(4)中所述的梯度升温为按照0.1℃/ 秒的梯度进行升温。

相较于现有技术，本发明的有益效果体现在：

(1)灵敏度：本发明的方法可从最低20ng的硫化后DNA中检测到最低0.1％ 甲基化水平的甲基化改变，说明具有极高的灵敏度。

(2)特异性：用本发明的引物和方法检测大肠癌患者的外周血白细胞DNA以 及健康对照的外周血白细胞DNA样本，通过受试者工作特征曲线(ROC)分析发 现具有良好的区分度。这说明本发明有较好的特异性。

(3)高通量：本方法应用包含HRM分析模块的荧光定量PCR仪，一次可以 同时检测88例样本，具有较高的通量，从而大量地节省了时间，提高了检测效率。

(4)与常规的大肠癌筛检方法相比，本发明的方法采用的生物样本来自于人 外周血具有创伤性小，适合在普通人群中进行推广应用。

综上，本发明的引物和试剂盒具有快速、高通量、灵敏和特异性好等特点，能 更好地进行人大肠癌的早期筛检。

附图说明

图1为被检测区域示意图；

其中，被检测区域的具体位置为chr11:2，125，408-2，125，508；长度为101bp， 包含9个CpG位点；位于IGF2基因的启动子区。

图2为人外周血白细胞DNA样本的IGF2基因启动子区的RT-PCR扩增曲线；

图3为人外周血白细胞DNA样本的IGF2基因启动子区的MS-HRM分析的熔 解峰形图；

图4为人外周血白细胞DNA样本的IGF2基因启动子区的MS-HRM分析的标 准化熔解曲线图。

具体实施方式

下面结合实施实例，对本发明做进一步地说明，但本发明并不受限于下述实施 实例。

实施例1：一种基于人外周血白细胞DNA水平的，用于早期筛检大肠癌相关 IGF2基因甲基化表型的MS-HRM引物的建立

本发明的大肠癌甲基化特异的高分辨率溶解曲线检测的引物，是根据NCBI(美 国国立生物技术信息中心)公开的人类全基因组序列(Refseq.AC132217)，使用 MethprimerSoftware(http://www.urogene.org/methprimer/)以及PrimerPremier version5.0在人大肠癌基因组中IGF2基因启动子区的CpG岛区域(图1所示)设计 的一对甲基化特异性高分辨率溶解曲线(MS-HRM)检测的引物，由英潍捷基(上 海)贸易有限公司合成，所述引物的序列如下所示：

正向引物：5-GGGATTTGGTTGAGGTTTTAAG-3(SEQIDNO.1)

反向引物：5-TACGACTAAAAAAACCCCTAAACTC-3(SEQIDNO.2)

实施例2：一种基于人外周血白细胞DNA水平的，用于早期筛检大肠癌相关 IGF2基因甲基化表型的MS-HRM检测试剂盒

包括以下引物序列：

正向引物：5-GGGATTTGGTTGAGGTTTTAAG-3(SEQIDNO.1)

反向引物：5-TACGACTAAAAAAACCCCTAAACTC-3(SEQIDNO.2)

所述的试剂盒中还包括2×PCRMasterMix,25mMMgCl₂以及PCR-gradeWater。

实施例3:本发明的试剂盒在早期筛检人大肠癌中的应用

本发明采用的分析试剂盒为LightCycler480HighResolutionMeltingMasterMix (Roche,Mannheim,Germany)；DNA提取试剂盒为，QIAampBloodDNAMiniKit (Qiagen,Hilden,Germany)；硫化试剂盒为，EpiTectFastDNABisulfiteKit(Qiagen, Hilden,Germany)；实验采用的甲基化标准品为，HumanWGAMethylated& Non-methylatedDNASet(ZymoResearch，Orange，CA，USA)；其他试剂为国产 分析纯试剂。

本发明所采用的生物材料均来自哈尔滨医科大学附属肿瘤医院结直肠外科，所 有生物学样本的采集及试用均经由患者本人同意并签署知情同意书及伦理证明后 采集。

方法：

一、人外周血白细胞DNA提取流程(DNA提取试剂盒为QIAampBloodDNA MiniKit(Qiagen,Hilden,Germany))

1.在采集人外周血样本(5ml)2小时以内将其简单离心(1600g，10分钟) 分离血浆和白细胞层；

2.取适量白细胞层重悬于400μl的PBS缓冲液中，置于1.5ml离心管中；

3.加入40μlQiagenProtease，混匀；

4.加入400μlBufferAL，涡旋15秒，混匀；56℃孵育10分钟；

5.1600g简单离心2分钟；

6.加入400μl99.99％无水乙醇，涡旋15秒，混匀；

7.将所有上述混匀液体转移至吸附柱中(QIAampMinispincolumn，Qiagen)， 每次转移500μl；高速离心(6000g)1分钟后，弃掉离心下的液体；

8.重复第7步，直至将所有液体全部转移至吸附柱中；

9.在吸附柱中加入500μlBufferAW1，6000g离心1分钟后，弃掉离心下的液 体；将吸附柱转移至另一新的2ml的收集管上；

10.在吸附柱中加入500μlBufferAW2，20000g离心3分钟后，弃掉离心下的 液体；将吸附柱转移至另一新的2ml的收集管上；

11.20000g离心1分钟；

12.将吸附柱转移至另一新的1.5ml离心管中，向吸附柱中加入200μlBufferAE， 在室温下孵育1分钟，6000g离心1分钟；将离心管编号后，置于4℃冰箱中；

13.再将吸附柱转移至另一新的1.5ml离心管中，向吸附柱中加入120μlBuffer AE，在室温下孵育1分钟，6000g离心1分钟；将离心管编号后，置于4℃冰箱中；

14.将所得DNA分装至0.5ml离心管中冻存于-80℃深冻冰箱，并取一备份经 由NanoDrop2000cSpectrophotometer(ThermoFisherScientific)评测其浓度和纯度。

二、DNA重亚硫酸盐修饰流程(DNA硫化试剂盒为，EpiTectFastDNABisulfite Kit(Qiagen,Hilden,Germany))

1.取待硫化DNA置于室温下，取2μgDNA(按照每一样品的浓度计算所需体 积)放入200μlPCR反应管中；

2.依次加入85μlBisulfiteSolution,35μlDNAProtectBuffer，和适量的 Rnase-freeWater调整总体积至140μl；

3.涡旋，彻底混匀，1600g简单离心20秒后，将混匀液体置于热循环仪中进 行硫化修饰反应；反应条件如下：95℃变性5分钟，60℃孵育20分钟，2个循环； 20℃孵育20分钟；

4.将所有液体转移至1.5ml离心管中；加入310μl新鲜配制的BufferBL，涡旋 彻底混匀，1600g简单离心20秒；

5.加入250μl99.99％无水乙醇，涡旋15秒，1600g简单离心20秒；

6.将所有混匀液体转移至吸附柱中(MinEluteDNASpinColumn，Qiagen)，每 次转移500μl，20000g离心1分钟；

7.重复第6步，直至将所有混匀液体全部转移至吸附柱；

8.向吸附柱中加入500μlBufferBW，20000g离心1分钟，弃掉离心下的液体；

9.向吸附柱中加入500μlBufferBD，室温下孵育15分钟，20000g离心1分钟， 弃掉离心下的液体；

10.向吸附柱中加入500μlBufferBW，20000g离心1分钟，弃掉离心下的液体；

11.重复第10步；

12.向吸附柱中加入250μl99.99％无水乙醇，20000g离心1分钟，弃掉离心下 的液体；

13.将吸附柱转移至另一新的2ml离心管中，20000g离心1分钟；

14.将吸附柱转移至另一新的1.5ml的收集管中，向吸附柱中加入15μlBuffer EB，室温下孵育1分钟，15000g离心1分钟，洗脱硫化DNA；

15.将所得硫化后DNA采用NanoDrop2000cSpectrophotometer(ThermoFisher Scientific)评测其浓度和纯度；

16.根据每一份样品的浓度计算所需加入BufferEB的体积，将所有硫化后DNA 样品稀释至20ng/μl；

17.分装至200μl冻存管中，置于-80℃深冻冰箱。

三、甲基化特异性高分辨率溶解曲线(MS-HRM)检测甲基化水平流程(检测 仪器为LightCycler480Instrument(RocheAppliedScience,Mannheim,Germany)； RT-PCR反应试剂盒为LightCycler480HighResolutionMeltingMasterMix(Roche, Mannheim,Germany))

1.配备MS-HRM分析所需的RT-PCR反应体系，总体积为10μl，反应体系如 下：5μl2×conc.MasterMix,0.4μlIGF2正向引物(10μM，SEQIDNO.1)，0.4μlIGF2 反向引物(10μM，SEQIDNO.2)，0.6μlMgCl₂(25mM)，1μl硫化后DNA作为模 版，2.6μlPCR-gradeWater。

2.进行RT-PCR反应，反应条件如下：95℃预变性10分钟；95℃变性10秒， 56℃复性30秒，72℃延伸20秒(采集荧光信号)，循环45次。

3.进行MS-HRM检测，检测条件为：95℃预变性1分钟；40℃复性1分钟， 60℃～98℃梯度升温(0.1℃/秒，并采集荧光信号)，40℃复性10分钟。

4.对MS-HRM结果进行Tm-Calling和Gene-Scanning分析：如果待测样品与 阳性标准品的Tm值(83.6℃)相符，且待测样品的甲基化水平大于0.5％，即Cut-Off 值取为0.005，结果为阳性；反之，结果为阴性。

四、345例大肠癌病例与394例健康对照的IGF2基因启动子区CpG岛甲基化 水平的MS-HRM检测结果

所得结果见图2～4。统计分析结果见表1～2。

表1739例人外周血白细胞DNAIGF2基因启动子区CpG岛甲基化水平的 MS-HRM检测结果

表2卡方检验

a.0cells(0.0％)haveexpectedcountlessthan5.Theminimumexpectedcountis53.22.

b.Computedonlyfora2x2table

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性 的。本技术领域的普通技术人员在本发明权利要求所限定的实质范围内，做的变化、 修改，添加或等效效变更，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利 要求书为准。