人乳头瘤病毒的核酸检测试剂盒及其使用方法和应用

摘要

本发明公开了一种人乳头瘤病毒的核酸检测试剂盒及其使用方法和应用，该试剂盒包括：核酸扩增试剂；核酸扩增试剂包括：引物对、与引物对相对应的探针；该试剂盒的使用方法包括：1)样本的核酸提取；2)试剂配制；3)PCR扩增；4)在65～72℃下，将步骤3)得到的PCR扩增反应产物进行荧光检测，并根据靶标扩增曲线的Ct值及内标扩增曲线的Ct值的变化确定HPV的型别感染情况。该试剂盒可应用于检测低危型和高危型人乳头瘤病毒以及该试剂盒在对人乳头瘤病毒进行分型中的应用。该本试剂盒具有能对HPV相对病毒载量进行推算、避免污染、提高样本处理通量、避免检漏等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸检测试剂盒及其使用方法和应用，特别是涉及一种人乳头瘤病毒的核酸检测试剂 盒及其使用方法和应用。

背景技术

人乳头瘤病毒(HPV)是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是球形DNA病毒，具有高度 的特异性，可定向感染皮肤黏膜的鳞状上皮并引起增殖。目前已分离出130多种，不同的型别引起不同的 临床表现，根据侵犯的组织部位不同可分为：

皮肤低危型(HPV1、2、3、4、7、10、12、15等)，其与寻常疣、扁平疣、跖疣等相关；

皮肤高危型(HPV5、8、14、17、20、36、38)；

黏膜低危型(HPV6、11、13、32、34、40、42、43、44、53、54等)；

黏膜高危型(HPV16、18、30、31、33、35、39)。

2004年发布的HPVhandbook中提出HPV高危型别中有18个型别(HPV16、18、26、31、33、35、39、 51、53、56、59、66、68、73、82)可导致宫颈癌，而低危型别中6、11型别的感染概率也很高，能够导致 尖锐湿疣等疾病。

另外，目前发现的HPV型别中，约40多种可特异性的感染肛门生殖器部位的皮肤和粘膜。按照HPV 所导致皮肤损伤的性质，可将HPV型别分为高危型(HighRisk，HR)和低危型(LowRisk，LR)。同时， 大量研究表明，宫颈HR-HPV感染是宫颈上皮内瘤变和宫颈癌发病的必要条件。女性宫颈持续感染高危型 HPV不但为宫颈癌的发生埋下隐患，而且增加了病毒在性伴侣之间相互传播的机会。经研究，HPV的感 染在人群中普遍存在，女性的一生至少有80％感染HPV的风险，在临床观察中，注意控制HPV的持续感 染，可控制宫颈癌的发生。有研究发现，70％以上有性生活的妇女会感染HPV。因此，对预防和治疗性 HPV疫苗的研究在防治宫颈癌及其他恶性肿瘤方面具有极其重要的意义。虽然人们已经认识到HPV感染 的危害性，但是目前并没有一种被证实有效的方法来消除宫颈HPV的感染，提前注射HPV部分亚型的疫 苗，是目前唯一用于预防HPV感染的方法。因此，快速、准确、高效的对HPV亚型进行检测，对预防和 治疗HPV感染具有重要意义。

另外，目前HPV的检测诊断方法有宫颈细胞学检测、病理检查、核酸杂交检测、杂交捕获法、分子 导流杂交法、液态芯片法、免疫色谱层析试纸检测、实时荧光PCR法、PCR+基因测序法、ELISA+杂交捕 获法等，主要的几种如下：

1)子宫颈细胞学检测：液基为主的细胞学检测如CCT，TCT，LCT，CCT-传统制片，自动阅片系统； TCT－自动制片系统，人工阅片；LCT－自动制片系统+自动辅助阅片系统+人工阅片，其特点是镜下挖 空细胞，检出率28％。

2)显微镜下病理检查：病理科制片后，镜下观察检出率34％，受病理制片因素影响及病理科医师水 平影响。

3)第二代杂交捕获，HCII：第1个FDA批准临床检测应用的方法，能区分高低危，可以相对定量， 缺点是：无内标，检测时间较长(DNA分解45min、DNA-RNA杂交60min、抗体捕获60min、化学发光 30min、计算机判读15min)，灵敏度低，成本高，和检测范围外的HPV亚型存在交叉反应，造成假阳性 结果的产生。

4)分子导流杂交(凯谱)：利用了小通量核酸芯片的原理，定性，能够一次性确定单种或多种的具体 型别HPV感染情况，有内标准，控制了PCR的高敏感性及假阳性高的缺点，而且检测型别可以根据平台 要求有扩展空间。凯普生物使用该种技术已开发多种HPV检测试剂盒，其中37种(HPV)分型检测试剂 盒可对37种HPV型别精确分型，包括HPV6、11、42、43、44、16、18、31、33、35、39、45、51、52、 53、56、58、59、66、68、81、26、34、40、54、55、57、61、67、69、70、71、72、73、82、83及84。 优点：可对型别具体分型。缺点：灵敏度低，开盖操作易污染，价格昂贵。

5)液态芯片法(luminex)：利用液相芯片的原理可进行定性和定量分型，而且可以具体分型。目前上 海透景生命科技有限公司使用luminex平台已开发出HPV检测试剂盒，可对19种高危亚型16、18、31、 33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、26、53、55、68、82、8和7种低危亚型6、11、40、42、 44、61、73进行有效扩增。优点：能够具体分型；缺点：手工操作繁琐、开盖操作易污染、价格昂贵。

6)荧光PCR法：利用荧光PCR法检测HPV病毒，所需的检测时间较短，灵敏度高，可有效降低漏 检的的可能，成本相对较低，无需PCR后开盖操作，防污染系统完善，可预防由于污染产生假阳性结果。 然而荧光PCR法受到检测通道的限制，一般只对16、18、6、11进行分型，其他型别不能具体分型。同时 目前大多数PCR分型产品目标序列为L区，对某些型别不能准确区分。

综上所述，宫颈细胞学检测、病理学检查受主观因素影响较大，灵敏度也较低，所以临床应用中存在 一定的漏检率；核酸杂交法、杂交捕获法、分子导流杂交法、液态芯片法相对于前者，灵敏度有所提高， 对HPV型别检测的覆盖范围较大，但由于在操作过程中容易产生污染，导致假阳性结果的产生；实时荧 光PCR法具有更高的灵敏度及特异性，可以极大的降低假阳率和漏检率，检测过程可全自动化进行，降低 人力的投入，但由于荧光通道数量的制约和多重PCR技术的难度，在HPV型别确定方面存在一定的限制。

上述的检测方法均存在自身的缺陷，为临床HPV的诊断和治疗带来一定困难。因此，对已有技术所 存在的缺陷进行改进，使其在HPV临床检测时能够发挥更为有效的作用至关重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种人乳头瘤病毒(HPV)的核酸检测试剂盒及其使用方法和应用。 本发明利用多重实时荧光PCR法作为技术平台，以HPV基因组E区基因为目标序列进行引物探针设计， 并综合HPV在中国的主要感染型别及最新相关疫苗的研制情况进行试剂盒的开发，使其可对多种高危型 别及低危型别进行检测，并同时对多种HPV亚型进行分型鉴别，对于HPV感染跟踪监测、治疗以及HPV 相关疫苗的注射起到一定的辅助作用。同时，该试剂盒具有能对HPV相对病毒载量进行推算、避免污染、 提高样本处理通量、避免检漏等优点。

为解决上述技术问题，本发明的人乳头瘤病毒(HPV)的核酸检测试剂盒，包括：核酸扩增试剂；

其中，所述核酸扩增试剂包括：引物对、与引物对相对应的探针；

所述引物对包括：如SEQIDNO.1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、13-14、15-16、17-18、19-20、21-22、 23-24、25-26、27-28、29-30、31-32、33-34、35-36、37-38、39-40、41-42、43-44、45、46、47-48所示的 引物对和如SEQIDNO.73-74所示的内标(人类看家基因β-globin)引物对；引物对中的引物浓度优选为 80～140nmol/L；

所述与引物对相对应的探针包括：与如SEQIDNO.1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、13-14、15-16、 17-18、19-20、21-22、23-24、25-26、27-28、29-30、31-32、33-34、35-36、37-38、39-40、41-42、43-44、 45、46、47-48所示的引物对分别相对应的如SEQIDNO.49-72所示的探针，以及如SEQIDNO.75所示的 内标(人类看家基因β-globin)探针；探针的浓度优选为20～50nmol/L。

所述探针的两端(5’端和3’端)还分别连接有荧光基团和淬灭基团；其中，如SEQIDNO.49-72所示 的探针的5’端的荧光基团可以选用FAM、HEX、CY5或ROX，如SEQIDNO.49-72所示的探针3’端的淬 灭基团可以选用非荧光淬灭基因，包括：BHQ1或BHQ2；

内标探针的5’端还可标记有TAMARA荧光基团，3’端标记有BHQ1或BHQ2淬灭基团。

如SEQIDNO.51-52、69-72所示的探针(针对低危型人乳头瘤病毒的特异性探针)的5’端标记有FAM、 ROX或CY5荧光基团，3’端标记有BHQ1或BHQ2淬灭基团。

如SEQIDNO.49-50、53-68所示的探针(针对高危型人乳头瘤病毒的特异性探针)的5’端标记有FAM、 ROX、CY5或HEX荧光基团，3’端标记有BHQ1或BHQ2淬灭基团。

在本发明中，如SEQIDNO.49、51、53所示的探针(分别针对HPV16、HPV6和HPV31型的特异性 探针)的5’端优选使用ROX荧光基团标记；

如SEQIDNO.50、52、54所示的探针(分别针对HPV18、HPV11和HPV33型的特异性探针)的5’ 端优选使用CY5荧光基团标记；

如SEQIDNO.57、62所示的探针(分别针对HPV45和HPV58型的特异性探针)的5’端优选使用HEX 荧光基团标记；

如SEQIDNO.55-56、58-61、63-72所示的探针(分别针对HPV35、HPV39、HPV52、HPV53、HPV56、 HPV66、HPV59、HPV68、HPV82、HPV51、HPV26、HPV73、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44型的 特异性探针)的5’端优选使用FAM荧光基团标记；

如SEQIDNO.49-72、75所示的探针(HPV特异性探针)的3’端优选使用BHQ1淬灭基团进行标记。

所述核酸扩增试剂还可包括：HPV反应液A、HotstartTaq酶和UNG酶；

其中，HPV反应液A是通过盐缓冲液将MgCl₂和dNTPs溶解而形成的，其中，MgCl₂在HPV反应液 A中的终浓度为130mM～200mM，dNTPs在HPV反应液A中的终浓度为0.15mM～0.5mM，盐缓冲液是 含20mM～40mMpH8.8Tris-HCl、50～55mMKCl的水溶液。

其中，HotstartTaq酶的浓度优选为3～7U/test(3～7U/次检测)；UNG酶的浓度优选为0.1～0.5U/test (0.1～0.5U/次检测)。

所述试剂盒还可包括：核酸提取试剂、HPV型别的阳性对照品和阴性对照品；其中，所述核酸提取试 剂包括：磁珠悬浮液；

HPV型别的阳性对照品中，优选地，其是由HPV多型别(HPV6、11、16、42、18、52、58、31、33、 45或53型别)临床样本配制的浓度为5×10⁴拷贝数/ml的阳性对照品，监控样本测试过程的准确性。

阴性对照品中，其是由HPV病毒阴性的脱落宫颈细胞保存液配制为阴性对照品，监控样本测试过程 的准确性。

所述磁珠悬液，可采用商业化产品，如可包括：chemagen公司的顺磁性氧化硅纳米磁珠的悬浮液(磁 珠为购自chemagen公司的M-PVA011型号的磁珠，该磁珠可通过纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进 行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠)。

所述核酸提取试剂还可包括以下组分：

1)裂解液，其是含异硫氰酸胍和TritonX-100的溶液，或者该裂解液是含异硫氰酸胍和Tween-20的 溶液；其中，裂解液中的异硫氰酸胍的浓度为2M～6M，TritonX-100或Tween-20的体积浓度为1％～2％；

2)结合液，其是含高氯酸盐、醋酸盐和有机溶剂的水溶液；其中，高氯酸盐包括：高氯酸钠；醋酸 盐包括：醋酸钠；有机溶剂包括：乙醇；高氯酸盐的浓度优选为17g/100mL～30g/100mL，醋酸盐的浓度 优选为1g/100mL～10g/100mL，有机溶剂的体积浓度优选为40％～60％。

优选地，结合液的配制方法为：取200g-300g高氯酸钠、20g-40g醋酸钠溶解于少量纯化水中，然后 加入400-600mL无水乙醇，并用纯化水定容至1L即可。

3)洗液A，其是含高氯酸钠、醋酸盐和乙醇的水溶液，其中，高氯酸钠的浓度优选为10g/100mL～ 30g/100mL，醋酸盐(包括：醋酸钠)的浓度优选为4g/100mL～15g/100mL，乙醇的体积浓度优选为35％～ 50％。

优选地，洗液A的配制方法为：取200g-300g高氯酸钠、40g-60g醋酸钠、溶解于少量纯化水中，然 后加入350ml-500ml无水乙醇，并用纯化水定容至1L即可。

4)洗液B，其为体积浓度40％～80％的乙醇；

5)洗脱液，其为10～20mMpH8.0的Tris-HCl。

6)蛋白酶K。

7)RNA的聚合酶A(PolyA)。

表1引物序列

表2探针序列

序列编号 序列(5’-3’) 对应HPV的型别 SEQ ID NO.49 CCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAAC HPV 16 SEQ ID NO.50 AACGACGATTCCACAACATAGCTGGGC HPV 18 SEQ ID NO.51 TGCAAATGCCTCCACGTCTGCAA HPV 6 SEQ ID NO.52 CAGGAATGCACTGACCACCGCAGA HPV 11 SEQ ID NO.53 TTTGTGCAAACCTACAGACGCCATGTTC HPV 31 SEQ ID NO.54 TGCCAAGCATTGGAGACAACTATACA HPV 33 SEQ ID NO.55 CAAAAACCGCTGTGTCCAGTTGAAAAGC HPV 35 SEQ ID NO.56 CCCCTCTCCCAGCGGTTCCATG HPV 39 SEQ ID NO.57 CTGCGGTGCCAGAAACCATTGAACC HPV 45 SEQ ID NO.58 TGTTGGAGACCCCGACCTGTGACC HPV 52 SEQ ID NO.59 AATCCAGAAGGGCGACCACGTAC HPV 53 SEQ ID NO.60 TCCACGACGCCTGCACCACTTG HPV 56 SEQ ID NO.61 CATATTCAGCAATACACAGGAACGTCCACG HPV 66 SEQ ID NO.62 ATGGAGACACATTAGAACAAACACTAAACA HPV 58 SEQ ID NO.63 ACGCCCCCCGAAGCCACG HPV 59 SEQ ID NO.64 TAGGCCTGCCTTAACTTCCCGAAGAGG HPV 68 SEQ ID NO.65 CAGTCCGCGGAGCAGCCCATTA HPV 82 SEQ ID NO.66 CCGGTGTGCCATCACGGAAAC HPV 51 SEQ ID NO.67 ACTGCCACTGCTGCGGTTTCCC HPV 26 SEQ ID NO.68 CCACTGTCTACTTGCCTCCTGTCCCAGT HPV 73 SEQ ID NO.69 TATTTACCACCGCCAACGCCTGTTG HPV 40 SEQ ID NO.70 TGTGCACTGCGACACTACGAAAGATCA HPV 42 SEQ ID NO.71 CCGTTTGCTGCATGCTTGGCC HPV 43 SEQ ID NO.72 CCACATATTGGACAAGGCGCGATTCA HPV 44 SEQ ID NO.75 GAATCGTATGTCCGATCCGAGTCC 内标(IC)

另外，本发明还公开了上述试剂盒的使用方法，即利用上述试剂盒检测人乳头瘤病毒的方法，包括步 骤：

1)样本的核酸提取

利用上述的核酸提取试剂，并按照常规的磁珠法，对保存于细胞保存液中的宫颈脱落细胞样本进行核 酸提取，得到PCR模板；

2)试剂配制

HPV荧光反应液B1：HPV16、18、52、58、IC的引物对(SEQIDNO.1-2、3-4、19-20、27-28、73-74 所示的引物对)和其型别对应的探针(SEQIDNO.49、50、58、62、75所示的探针)，各对引物浓度为 80-140nmol/L，探针浓度为20-50nmol/L；

HPV荧光反应液B2：HPV31、33、45、35、39、51、53、56、59、66、68、73、82、26、IC的引物 对(SEQIDNO.9-10、11-12、17-18、13-14、15-16、35-36、21-22、23-24、29-30、25-26、31-32、39-40、 33-34、37-38、73-74所示的引物对)和其型别对应的探针(SEQIDNO.53、54、57、55、56、66、59、60、 63、61、64、68、65、67、75所示的探针)，各对引物浓度为80-140nmol/L，探针浓度为20-50nmol/L；

HPV荧光反应液B3：HPV6、11、40、42、43、44、内标(IC)的引物对(SEQIDNO.5-6、7-8、41-42、 43-44、45-46、47-48、73-74所示的引物对)和其型别对应的探针(SEQIDNO.51、52、69、70、71、72、 75所示的探针)，各对引物浓度为80-140nmol/L，探针浓度为20-50nmol/L；

然后，在分别含有3～5μl荧光反应液B1、B2、B3的每管中，加入14～16μlHPV反应液A、Hotstart Taq酶3～7U/test(3～7U/次检测)和UNG酶0.1～0.5U/test(0.1～0.5U/次检测)(如1μlHotstartTaq酶 和0.15μlUNG酶)，形成混合液；

UNG酶，在开始PCR扩增反应的第一次变性步骤之前，进行37～50℃保温1～10分钟。

3)PCR扩增

将步骤1)得到的PCR模板加入到步骤2)中的混合液中，进行PCR扩增反应，并且阳性对照品与阴 性对照品与样本同时进行PCR扩增反应；

其中，PCR扩增方法包括：

I、37～50℃保温2～5min，1个循环；

II、94～95℃下1～10mins，1个循环；

III、94～95℃下10～60s的变性步骤，50～65℃下10～60s的退火步骤，65～72℃下30～90s的延伸 步骤，反复进行40～50个循环；

优选地，PCR扩增方法为：37℃保温2min；94℃热变性10min；94℃10秒，55℃10秒，65℃35秒 交替循环45次；

4)在65～72℃下，将步骤3)得到的PCR扩增反应产物进行荧光检测，并根据靶标扩增曲线的Ct 值及内标(IC)扩增曲线的Ct值的变化确定HPV的型别感染情况。

再者，本发明还公开了上述试剂盒的应用，即所述试剂盒在检测低危型和高危型人乳头瘤病毒中的应 用以及所述试剂盒在对人乳头瘤病毒进行分型中的应用；

其中，低危型人乳头瘤病毒包括：HPV6型、HPV11型、HPV40型、HPV42型、HPV43型、HPV44 型；

高危型人乳头瘤病毒包括：HPV16型、HPV18型、HPV52型、HPV58型、HPV31型、HPV33型、 HPV45型、HPV26型、HPV35型、HPV39型、HPV51型、HPV53型、HPV56型、HPV59型、HPV66型、 HPV68型、HPV73型、HPV82型；

所述试剂盒在对人乳头瘤病毒进行分型中的应用中，包括：对HPV6型和HPV11型进行分型，以及 对HPV16型、HPV18型、HPV52型、HPV58型、HPV31型、HPV33型和HPV45型进行分型。

本发明的试剂盒中，采用磁珠提取法用于HPV核酸提取，该法运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的 表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性 地识别和高效结合。利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在Chaotropic盐(盐酸胍、异硫氰酸胍等)的作用 下，使血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中的细胞裂解，然后向裂解液中加入磁珠，当溶液的PH 值小于6.5时，磁珠选择性的与提取的DNA/RNA结合，此时将吸附有DNA/RNA的磁珠置于磁场中，通 过缓冲液去除没有被吸附的杂质(蛋白等)，然后将磁珠置于PH值8.5的缓冲液中，纯化的DNA/RNA即 可进入缓冲液中，然后用于作为后续PCR扩增的模板。磁珠法提取核酸既可以保证较高的核酸提取效率， 同时有利于HPV核酸检测过程自动化的实行。

另外，本发明采用Taqman定量PCR原理，以人类看家基因β-globin作为低危型人乳头瘤病毒检测和 高危型人乳头瘤病毒检测的内标，并设计针对HPV各型别序列的特异性引物，扩增HPV型别的特异性核 酸序列，并在上下游引物之间设计，针对HPV型别特异性序列的Taqman探针。针对HPV序列的探针其 5’端标记荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团。当探针完整时，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基 团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在核酸链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3’→5’ 外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团原理淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以， 每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模 板DNA的拷贝数。

本发明有益效果：

1)本试剂盒主要针对宫颈脱落细胞悬浮液中的乳头瘤病毒核酸的定性检测，并采用人类看家基因为 内标对整个HPV检测过程进行监控，有效地避免了样本在采集、运输保存以及在提取过程中的操作不当 而造成的假阴性，并可反映样本中宫颈脱落细胞含量，可对HPV相对病毒载量进行推算；

2)本发明采用荧光-PCR法，并能够同时检测24种型别(18种HPV高危型别和6种HPV低危型别 即HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82、6、11、40、42、 43、44)，有效地避免了膜杂交法开盖杂交容易污染，并能够有效地提高样本处理通量。

3)本发明对我国分布较普遍的6、11、16、18、31、33、45、52、58型单独分型的检测，即同时能 够准确分辨出：低危型别6、11；高危型别16、18、52、58、31、33、45，共计9种型别。其中，6、11 均为性病常见的感染型别，16、18、52、58、31、33、45为中国最为常见的高位感染型别，这些型别的分 辨对于临床有重要的指导意义。

4)本发明所采用的引物探针设计均在E区进行设计，有效地避免了现阶段在L1区设计而造成的漏检。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1是HPV16、31、6型的1.0×10³拷贝数/ml分型参考品的扩增曲线；

图2是HPV18、33、11型的1.0×10³拷贝数/ml分型参考品的扩增曲线；

图3是HPV45、52型的1.0×10³拷贝数/ml浓度的扩增曲线；

图4是HPV16型重组质粒梯度稀释荧光PCR扩增曲线，曲线由左到右对应的样本拷贝数分别为1×10⁷拷贝数/ml，1×10⁶拷贝数/ml，1×10⁵拷贝数/ml，1×10⁴拷贝数/ml，1×10³拷贝数/ml，1×10²拷贝数/ml；

图5是试剂盒检测HPV阴性样本的内标扩增曲线；

图6是试剂盒检测HPV阴性样本的靶标扩增曲线；

图7是1号混合感染样本扩增曲线；

图8是2号混合感染样本扩增曲线。

具体实施方式

第一实施方式

本实施例中提供了一种人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒，可以对高危型别和低危型别的人乳头瘤病毒 (HPV)的感染情况进行定性检测，如可对16、18、52、58、31、33、45、6、11进行型别检测，同时也 可对35、39、51、53、56、59、66、68、73、82、26、40、42、43、44进行检测。该试剂盒可用于临床 HPV感染的辅助诊断和宫颈癌的早期筛查。

1、试剂盒A：保存温度：2～8℃

表3核酸提取试剂

其中，裂解液是含异硫氰酸胍和TritonX-100的溶液，或者该裂解液是含异硫氰酸胍和Tween-20的溶 液；其中，裂解液中的异硫氰酸胍的浓度为4M，TritonX-100或Tween-20的体积浓度为1.5％；

结合液，其配制方法为：取200g高氯酸钠、30g醋酸钠溶解于少量纯化水中，然后加入500ml无水乙 醇，并用纯化水定容至1L即可。

蛋白酶K：外购于Roche公司，5-10μL/sample。

RNA的聚合酶A(PolyA)：外购于chemagen公司，5-10μL/sample。

磁珠悬浮液：chemagen公司的顺磁性氧化硅纳米磁珠的悬浮液(磁珠为购自chemagen公司的 M-PVA011型号的磁珠)。

洗液A，其配制方法为：取250g高氯酸钠、50g的醋酸钠、溶解于少量纯化水中，然后加入450ml 无水乙醇，并用纯化水定容至1L即可。

2、试剂盒B：保存温度：-18℃以下

表4核酸扩增试剂

上述核酸扩增试剂中，一些组分的配制如下：

HPV反应液A是通过盐缓冲液将MgCl₂和dNTPs溶解而形成的，其中，MgCl₂的终浓度为150mM， dNTPs的终浓度为0.5mM，盐缓冲液是含20mMpH8.8Tris-HCl、50mMKCl水溶液。

HPV荧光反应液B1：HPV16、18、52、58、内标(IC)的引物对(SEQIDNO.1-2、3-4、19-20、27-28、 73-74)和其型别对应的探针(SEQIDNO.49、50、58、62、75)，各对引物浓度为80nmol/L，探针浓度为 20nmol/L；

HPV荧光反应液B2：HPV31、33、45、35、39、51、53、56、59、66、68、73、82、26、内标(IC) 的引物对(SEQIDNO.9-10、11-12、17-18、13-14、15-16、35-36、21-22、23-24、29-30、25-26、31-32、 39-40、33-34、37-38、73-74)和其型别对应的探针(SEQIDNO.53、54、57、55、56、66、59、60、63、 61、64、68、65、67、75)，各对引物浓度为80nmol/L，探针浓度为20nmol/L；

HPV荧光反应液B3：HPV6、11、40、42、43、44、内标(IC)的引物对(SEQIDNO.5-6、7-8、41-42、 43-44、45-46、47-48、73-74)和其型别对应的探针(SEQIDNO.51、52、69、70、71、72、75)，各对引 物浓度为80nmol/L，探针浓度为20nmol/L；

其中，SEQIDNO.49-72用于HPV靶标的检测，探针SEQIDNO.75用于检测人类看家基因。

如SEQIDNO.49、51、53所示的探针(分别针对HPV16、HPV6和HPV31型的特异性探针)的5’ 端使用ROX荧光基团标记；

如SEQIDNO.50、52、54所示的探针(分别针对HPV18、HPV11和HPV33型的特异性探针)的5’ 端使用CY5荧光基团标记；

如SEQIDNO.57、62所示的探针(分别针对HPV45和HPV58型的特异性探针)的5’端使用HEX荧 光基团标记；

如SEQIDNO.55-56、58-61、63-72所示的探针(分别针对HPV35、HPV39、HPV52、HPV53、HPV56、 HPV66、HPV59、HPV68、HPV82、HPV51、HPV26、HPV73、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44型的 特异性探针)的5’端使用FAM荧光基团标记；

如SEQIDNO.49-72、75所示的探针的3’端使用BHQ1淬灭基团进行标记。

如SEQIDNO.75所示的内标探针的5’端标记有TAMARA荧光基团。

阴性对照品：由HPV病毒阴性的脱落宫颈细胞保存液配制为阴性对照品，监控样本测试过程的准确 性。

阳性对照：是由HPV多型别(HPV6、11、16、42、18、52、58、31、33、45或53型别)临床样本 配制的浓度为5×10⁴拷贝数/ml的阳性对照品，监控样本测试过程的准确性。

本试剂盒采用多重PCR荧光检测法，能同时检测宫颈脱落细胞中的18种高危型别(HPV16、18、26、 31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82)和6种低危型别(HPV6、11、40、 42、43、44)。

以下实施例中使用上述试剂盒做性能指标测试。

一、样本准备

1、采样

本试剂盒可对人宫颈脱落细胞中的HPV进行检测。医护人员以专业的设备打开阴道，暴露出宫颈， 用棉拭子清理宫颈口过多的分泌物。用宫颈刷插入到宫颈口(宫颈刷的刷头既要保证充分插入到宫颈口， 但又不能插入太深，以刷头最外层的刷毛能接触到外宫颈为最佳)，顺时针旋转3-5周获得足量的脱落细胞 样本，然后取出宫颈刷，并将其刷头插入到保存液管底，使刷头完全浸入保存液中，旋紧管盖。

2、标本保存

样本采集后，需尽快送检测试。标本室温保存不超过24小时；4℃保存不超过一周；-20℃保存不超过 三个月；如样本需长期保存，应放置于-70℃以下环境保存，需避免反复冻融样本。

3、标本运输

在运输过程中需保证试剂盒的保存温度，可利用冰袋保持较低的温度。

二、检验方法

1、HPV核酸的提取

本试剂盒采用常规的磁珠法对HPV核酸进行提取。

本实例用EZbeads核酸提取仪为例进行说明。

1.1实验前准备

A.将核酸提取试剂、对照品取出，平衡至室温并漩涡震荡混匀。

B.配制蛋白酶K/PolyA混合液：

蛋白酶K5μL

C.在样本制备用96孔深孔反应盘中预分装下列试剂：

表5

孔位 试剂 A1～H1、A7～H7 无 A2～H2、A8～H8 结合液600μl+磁珠悬液15μl A3～H3、A9～H9 洗液A 500μl A4～H4、A10～H10 洗液B 500μl A5～H5、A11～H11 无 A6～H6、A12～H12 洗脱液150μl

1.2待测样本核酸提取过程

A、使用细胞保存液充分洗脱宫颈刷上的宫颈脱落细胞，并在管壁上挤干。将细胞保存液混匀后，取 待测样本以及试剂盒中的阴性对照，阳性对照各200μL分别加入到1.5ml离心管中，并每管中加入10μL 蛋白酶K/PolyA混合液，然后每管中加入200μL裂解液，混合均匀后，将离心管放入金属浴保温55℃10min。

B、将保温完成的样本混合液离心后，分别加入到预分装试剂的反应盘A2～H2或A8～H8孔中。每 块反应盘可处理16个样本。每台仪器可同时放入2个反应盘处理32个样本。

C、将金属条对准反应盘的A6～H6及A12～H12列底部，并将反应盘及金属条固定于EZbead System-32核酸提取仪上，进行核酸提取(提取程序见表6)。

表6提取程序

D、待程序结束后，取下反应盘，吸取洗脱液进行PCR扩增反应。如果提取的样本当天不进行扩增， 则要放-18℃以下保存)。

2、核酸扩增

2.1HPV反应混合液配制：

根据待测样本的数量，按照下列比例配制HPV反应混合液。

表7HPV反应管B1混合液

HPV反应管B1混合液 单份测定用量 HPV反应液A 16μl HPV荧光反应液B1 3μl Hotstart Taq酶 1μl UNG酶 0.15μl 总计 20.15μl

表8HPV反应管B2混合液

HPV反应管B2混合液 单份测定用量 HPV反应液A 16μl HPV荧光反应液B2 3μl Hotstart Taq酶 1μl UNG酶 0.15μl 总计 20.15μl

表9HPV反应管B3混合液

HPV反应管B3混合液 单份测定用量 HPV反应液A 16μl HPV荧光反应液B3 3μl Hotstart Taq酶 1μl UNG酶 0.15μl 总计 20.15μl

注：配制HPV反应混合液时，请计算阴阳性对照的数量。

配制的HPV反应混合液需振荡混匀，离心20秒去除气泡后再分装到PCR扩增用反应管中。

2.2HPV扩增参数：

A、在PCR扩增用反应管中分装20μlHPV反应混合液(PCR扩增用反应管推荐使用Axygen0.2ml平盖八 联管，CatNo：管PCR-0208-C、盖PCR-2CP-RT-C)；

B、取制备好的样品40μl到加入上述PCR扩增反应管中，盖上盖子，轻微震荡混匀，离心20秒去除气泡；

C、将PCR扩增用反应管放到PCR荧光仪上进行扩增；

D、循环条件设置：

Step1：37℃2min1个循环

Step2：94℃10min1个循环

Step3：(94℃10s；55℃10s；65℃35s)45个循环

E、仪器检测通道选择：荧光信层设定为FAM、ROX、HEX、CY5、TAMRA荧光素，荧光信号采集设 定在Step3的65℃；

样品信息设定：根据PCR荧光热循环以软件要求在PCR扩增开始前或结束后进行样品信息设定。

三、结果判定

3.1结果分析条件设定：

I、阈值(threshold)设定：阈值设定原则以超过阴性对照曲线的最高点为基准。不同仪器阈值表达方 式不同，参考仪器软件设定。

II、基线(baseline)设定：基线设定原则以本次实验所有样本指数扩增前荧光信号稳定的区域。起始 点循环数一般从3～5个循环开始，终止点循环数一般选在最早出现指数扩增前1～2个循环(如第15个循 环)。对于能自动给出实验结果基线的仪器，以仪器软件给出的基线为基准。

3.2质控标准：

阴性对照品：内标(HEX)Ct值小于40，靶标(FAM、ROX、CY5、TAMRA)Ct值应大于45。

阳性对照品：内标(HEX)Ct值小于40，靶标(FAM、ROX、CY5、TAMRA)Ct值应小于40。

3.3检验结果的解释

根据设置的基线和阈值，仪器自动显示检测Ct值。根据Ct值即可进行结果判断，按照下表报告检测结 果。

表10

本试剂盒的定性检测下限可为1.0×10³拷贝数/ml，低于定性检测下限的结果仅供参考，高于定性 检测上线的结果要想准确定量，可梯度稀释后进行测定，测定结果乘以稀释倍数校正后报告结果。另 外，本试剂盒可对16、18、6、11、31、33、45、52、58等进行准确分型。

实施例1使用上述试剂盒检测临床样本中的HPV感染情况

用上述试剂盒对100例阳性临床样本进行检测，所有样本均采用金标准测序法进行验证，检测结果和 分析结果见下表。

使用上述试剂盒检测临床样本中HPV感染情况。

表11

标本编号 本试剂盒检测结果 测序结果 1 反应性 HPV 18 2 反应性 HPV 52

3 反应性 HPV 35 4 反应性 HPV 52 5 反应性 HPV 16 6 反应性 HPV 16 7 反应性 HPV 31 8 反应性 HPV 33 9 反应性 HPV 58 10 反应性 HPV 52 11 反应性 HPV 66 12 反应性 HPV 68 13 反应性 HPV 44 14 反应性 HPV 42 15 反应性 HPV 6 16 反应性 HPV 6 17 反应性 HPV 18 18 反应性 HPV 39 19 反应性 HPV 53 20 反应性 HPV 73 21 反应性 HPV 16 22 反应性 HPV 31 23 反应性 HPV 33 24 反应性 HPV 58 25 反应性 HPV 52 26 反应性 HPV 66 27 反应性 HPV 68 28 反应性 HPV 44 29 反应性 HPV 42 30 反应性 HPV 58 31 反应性 HPV 52 32 反应性 HPV 66 33 反应性 HPV 68 34 反应性 HPV 44 35 反应性 HPV 42 36 反应性 HPV 16 37 反应性 HPV 18 38 反应性 HPV 11 39 反应性 HPV 52 40 反应性 HPV 56 41 反应性 HPV 59 42 反应性 HPV 16 43 反应性 HPV 59 44 反应性 HPV 33 45 反应性 HPV 56 46 反应性 HPV 6

47 反应性 HPV 18 48 反应性 HPV 18 49 反应性 HPV 11 50 反应性 HPV 31 51 反应性 HPV 16 52 反应性 HPV 6 53 反应性 HPV 16 54 反应性 HPV 6 55 反应性 HPV 18 56 反应性 HPV 39 57 反应性 HPV 53 58 反应性 HPV 73 59 反应性 HPV 16 60 反应性 HPV 31 61 反应性 HPV 35 62 反应性 HPV 52 63 反应性 HPV 16 64 反应性 HPV 16 65 反应性 HPV 31 66 反应性 HPV 33 67 反应性 HPV 58 68 反应性 HPV 52 69 反应性 HPV 56 70 反应性 HPV 59 71 反应性 HPV 16 72 反应性 HPV 59 73 反应性 HPV 33 74 反应性 HPV 11 75 反应性 HPV 52 76 反应性 HPV 56 77 反应性 HPV 59 78 反应性 HPV 16 79 反应性 HPV 59 80 反应性 HPV 33 81 反应性 HPV 56 82 反应性 HPV 6 83 反应性 HPV 18

84 反应性 HPV 18 85 反应性 HPV 11 86 反应性 HPV 31 87 反应性 HPV 16 88 反应性 HPV 16 89 反应性 HPV 59 90 反应性 HPV 33 91 反应性 HPV 56 92 反应性 HPV 16 93 非反应性 HPV 71 94 反应性 HPV 59 95 反应性 HPV 16 96 反应性 HPV 59 97 反应性 HPV 33 98 反应性 HPV 58 99 反应性 HPV 52 100 反应性 HPV 56

上述试剂盒检测结果与测序结果对比见下表：

表12

注：上述试剂盒未检测到的该临床样本型别为试剂盒检测范围之外的HPV型别。

上述试剂盒对100例阳性临床样本进行检测，对于检测范围之内的HPV型别(HPV16、18、52、58、 31、33、45、6、11、35、39、51、53、56、59、66、68、73、82、26、40、42、43、44)具有较好的检 测能力，对于试剂盒检测范围之外的其他型别，本试剂盒的检测结果为阴性，阴性符合率100％，特异性 较高。

实施例2使用上述试剂盒检测临床混合感染样本中的HPV感染情况。

对收集的50例混合感染样本分别进行检测，检测结果如下：

表13

50例混合感染样本中，上述试剂盒的检测结果与取样单位给定的结果相同，检测范围内的HPV基因 型可以准确检出，个别稀有样本在本次收集样本中未包含。

综上所述，本实施例中的试剂盒的性能指标如下：

1)灵敏度：本试剂盒能稳定检出的HPV的最低检出限为：1.0×10³copies/ml。图1-5给出了上述试 剂盒对HPV各型别最低检测限(LOD)的检测。

2)基因型检测：本品可用于26、31、33、35、39、52、53、56、58、59、66、68、73、82、16、18、 6、11、40、42、43、44型别HPV感染的检测，并可对16、18、6、11、31、33、45、52、58进行准确分 型。

3)精密性：对精密性参考品测定结果应符合Ct值的变异系数(CV，％)≤15％。

4)准确性：本试剂盒检测HPV病原体的准确性大98％以上。

5)特异性：本试剂盒检测HPV病原体的准确性大99％以上。

6)干扰试验：试剂盒检测不受样本中全血、抗病毒药物、阴道分泌物的影响。

7)交叉反应：试剂盒对奈瑟淋球菌、沙眼衣原体、解脲衣原体、巨细胞病毒、EB病毒、单纯疱疹病 毒I型、单纯疱疹病毒II型、HIV-1型病毒、阴道毛滴虫、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、梅毒螺旋体等 均无特异性扩增。

第二实施方式

本实施方式中，提供一种人乳头瘤病毒(HPV)的核酸检测试剂盒，其仅含有第一实施方式的引物对 和探针(但各对引物浓度为100或140nmol/L，探针浓度为30或50nmol/L)，或者仅含有第一实施方式的 核酸扩增试剂。

第三实施方式

本实施方式中，提供一种HPV的核酸检测试剂盒，其含有：第一实施方式的核酸扩增试剂、核酸提 取试剂、HPV型别的阳性对照品和阴性对照品；

但核酸扩增试剂、核酸提取试剂中的组分浓度变更成如下形式：

1)核酸扩增试剂中的HPV反应液A

MgCl₂在HPV反应液A中的终浓度为130mM或200mM，dNTPs在HPV反应液A中的终浓度为0.15 mM或0.3mM，盐缓冲液是含30mM或40mMpH8.8Tris-HCl、55mMKCl的水溶液；

2)核酸提取试剂

裂解液是含异硫氰酸胍和TritonX-100的溶液，或者该裂解液是含异硫氰酸胍和Tween-20的溶液；其 中，裂解液中的异硫氰酸胍的浓度为2M或6M，TritonX-100或Tween-20的体积浓度为1％或2％；

结合液中的高氯酸盐的浓度为17g/100mL或30g/100mL、醋酸盐的浓度为1g/100mL或10g/100mL、 乙醇的体积浓度优选为40％或60％；

洗液A中的高氯酸钠的浓度为10g/100mL或30g/100mL，醋酸钠的浓度为4g/100mL或15g/100mL， 乙醇的体积浓度为35％或50％；

洗液B为体积浓度40％或80％的乙醇。