一种安宁铗蠓的特异基因及其分子鉴定方法

摘要

本发明公开一种安宁铗蠓的特异基因及其分子鉴定方法，其特征在于采用分子生物学方法获取该铗蠓的28S？rDNA基因序列，通过基因序列相似性的比对，对该铗蠓进行种类鉴定。本发明提供的安宁铗蠓分子鉴定方法，有利于实现安宁铗蠓准确、快速的鉴定。

说明书

技术领域

本发明涉及物种鉴定领域，具体涉及安宁铗蠓的特异基因序列及其分子鉴定方 法。

背景技术

蠓类是双翅目中的微小型昆虫，俗称小咬。目前，对蠓类的鉴定主要依靠经验丰富 的分类学专家识别形态学特征来实现，一旦遇到近缘种和形态特征掌握不全的标本鉴定就 很棘手；而且，对吸血蠓的形态鉴定需要通过制作玻片标本来完成，操作步骤繁琐、周期长、 难度大，因此，亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类方法的缺陷。

分子鉴定技术是以遗传物质DNA序列分析为依据来阐明物种间的差别，从分子水 平上快速而准确地鉴别物种。它是分子生物学、计算机科学与传统分类学相结合的产物，作 为一种崭新的分类学技术，极大弥补了传统形态学鉴定的缺陷，已引起越来越多生物学家 们的重视。近年来，随着以PCR基础的DNA序列测定方法的建立和广泛使用，核糖体DNA （rDNA）和线粒体DNA（mtDNA）等基因逐渐受到重视，并在吸血蠓的分子鉴定中得到广泛应 用。该技术与传统的分类方法互为佐证，不仅可解决鉴定中标本残缺不全等问题，而且可实 现吸血蠓的快速鉴定。本发明提供的安宁铗蠓特异基因序列有利于实现安宁铗蠓的快速鉴 定，缩短鉴定时间。

发明内容

本发明的目的在于提供一种安宁铗蠓的特异基因序列及其分子鉴定方法。通过分 子生物学方法获取安宁铗蠓（Forcipomyiaanningensis）特异基因—28SrDNA基因序列， 通过基因序列相似性的比对，可准确、快速地鉴定安宁铗蠓。

为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：

采用小型昆虫微量DNA模板制备方法，通过改进的PCR反应条件，由合成的引物扩增 安宁铗蠓的28SrDNA基因，PCR产物序列送由专业生物公司测定。测序结果通过手工校对、 序列拼接，并在NCBI中进行Blast相似性搜索，确保所得序列为目标序列。本发明所述的 安宁铗蠓特异基因，为28SrDNA基因，所述铗蠓的28SrDNA基因序列如SEQIDNo.1所示 （不含引物）：

本发明所述的安宁铗蠓28SrDNA基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列为：

正向引物5’TCCGTAACTTCGGGATAAGGATT3’

反向引物5’TGTACCGCCCCAGTCAAACT3’。

本发明所述的安宁铗蠓的分子鉴定方法，包括：

1）从待测的昆虫组织中分离提取DNA；

2）以该DNA为模板，采用的引物为：正向引物5’TCCGTAACTTCGGGATAAGGATT3’，反向引 物5’TGTACCGCCCCAGTCAAACT3’，通过聚合酶链式反应扩增出该昆虫的28SrDNA基因；

3）然后取适量步骤2）的聚合酶链式反应扩增出的28SrDNA基因用琼脂糖电泳分离，经 溴乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果。若能相应地特异性扩增出 大小约为819bp的条带，送生物公司测序；

4）根据测序结果，若目标基因序列与SEQIDNo.1的相似性均在98%以上，即可判断所 述的待测组织即为安宁铗蠓。

安宁铗蠓的种类鉴定依靠形态学鉴定所实现，并经权威专家复核，从而保证了结 果的可靠性。

所述引物根据文献合成，正向引物5’TCCGTAACTTCGGGATAAGGATT3’，反向引物5’ TGTACCGCCCCAGTCAAACT3’。

本发明可用琼脂糖凝胶电泳检测方法检测扩增结果。

本发明的优点为：

1）本发明采用传统的形态学鉴定与分子分类方法相结合，对所述铗蠓进行鉴定，可确 保物种鉴定的准确性和可靠性。

2）与传统的形态学鉴定方法相比，本发明建立的安宁铗蠓分子鉴定方法可有效缩 短安宁铗蠓的鉴定时间。

附图说明

图1为安宁铗蠓28SrDNA基因PCR扩增结果电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1-2为 安宁铗蠓雌虫的28SrDNA基因，检出大小约为819bp的条带。M为DL2000的DNAmarker。

图2为未知铗蠓雌虫28SrDNA基因PCR扩增结果电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1 为未知铗蠓雌虫的28SrDNA基因，检出大小约为819bp的条带。M为DL2000的DNAmarker。

具体实施方式

实施例1安宁铗蠓（Forcipomyiaanningensis）28SrDNA基因序列的获取

1、安宁铗蠓标本的获取

安宁铗蠓为野外采集获得的标本，经冷冻处死后直接保存于95%酒精中。标本制成玻片 后经权威专家鉴定，确保鉴定结果的准确性。标本制作前，挑取安宁铗蠓胸部末端和腹部前 几节置于95%酒精中，供DNA提取。

2、DNA模板制备

采用小型昆虫微量DNA模板制备方法提取安宁铗蠓DNA（文礼章主编.昆虫学研究方法 与技术导论[M].北京：科学出版社，2010.pp278-286），提取的DNA样品保存于-20℃备用。

3、引物合成

本实施例所用引物如下：

正向引物5’TCCGTAACTTCGGGATAAGGATT3’

反向引物5’TGTACCGCCCCAGTCAAACT3’。

4、PCR扩增

本实施例的PCR反应体系如表1所示。

表1安宁铗蠓28SrDNA基因PCR反应体系（50uL体系）

成分 体积（uL） 模板 2 引物1 1 引物2 1 10×缓冲液 5 dNTPs 1 Taq DNA聚合酶 2.5 ddH₂O 37.5

本实施例的反应程序如表2所示。

表2安宁铗蠓28SrDNA基因PCR反应程序

步骤 反应温度（℃） 时间 循环数 预变性 94 3 min — 变性 94 45 s 35 退火 48 45 s 35 延伸 72 60 s 35 延伸 72 7 min —

PCR产物于4℃保存备用。

5、PCR扩增产物检测

取5μLPCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V电压，电泳35min）。溴乙锭染色，凝胶 成像系统检测，电泳图谱参见附图1。

6、基因序列测定

选取3-5个效果较好的PCR扩增产物送由生物公司纯化后测序（测序所用引物与PCR所 用引物相同），所得基因序列经校正拼接后即为安宁铗蠓的28SrDNA基因序列—SEQID No.1。

实施例2未知铗蠓的鉴定

1、标本的采集与保存

采用挥网法或灯诱法进行采集，采获的标本经冷冻处死后直接保存于95%酒精中。

2、DNA模板制备

在解剖镜或体视显微镜下，从采集到的蠓类标本中随机挑出一只雌性铗蠓，采用小型 昆虫微量DNA模板制备方法提取铗蠓DNA（文礼章主编.昆虫学研究方法与技术导论[M]. 北京：科学出版社，2010.pp278-286），提取的DNA样品于-20℃保存备用，每份标本一个编 号。

3、目的基因序列的获取

3.1引物合成

以获得的未知铗蠓DNA为模板，合成引物，所用引物序列如下：

正向引物5’TCCGTAACTTCGGGATAAGGATT3’

反向引物5’TGTACCGCCCCAGTCAAACT3’。

3.2PCR扩增

本实施例的PCR反应体系如表3所示。

表3未知铗蠓28SrDNA基因PCR反应体系（50uL体系）

成分 体积（uL） 模板 2 引物1 1 引物2 1 10×缓冲液 5 dNTPs 1 Taq DNA聚合酶 2.5 ddH₂O 37.5

本实施例的反应程序如表4所示。

表4未知铗蠓28SrDNA基因PCR反应程序

步骤 反应温度（℃） 时间 循环数 预变性 94 3 min — 变性 94 45 s 35 退火 48 45 s 35 延伸 72 60 s 35 延伸 72 7 min —

PCR产物于4℃保存备用。

3.3PCR扩增产物检测与基因序列测定

取5μLPCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V电压，电泳35min）。溴化乙锭染色。凝 胶成像系统检测，电泳图谱参见附图2。由附图2看出实施例2的未知铗蠓也能特异性扩增出 大小约为819bp的产物，将大小约为819bp的产物送生物公司测序，结果显示与基因序 列SEQIDNO.1的相似性为99.9%，因而可判定该未知铗蠓为安宁铗蠓。