一种石油降解菌株及分离方法、石油降解菌剂及其制备方法与应用

摘要

一种石油降解菌株，菌株为CN-3，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC？M？2015537。实验所用的筛选培养基和降解用培养基均是以石油为唯一碳源和能源，筛选出的CN-3菌株对石油具有高效的降解性能。且该石油降解菌株CN-3在中性偏碱性的环境中对石油的降解效果较好，能够耐受高盐度环境，特别适应于海洋环境。从而扩大了CN-3菌株在海洋石油污染治理中的应用范围，使其更加具有应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及石油污染治理技术领域，尤其涉及一种石油降解菌株及分离方法、石油降解菌剂及其制备方法与应用。

背景技术

石油又称原油，是一种粘稠的、深褐色液体。石油中不同的化合物组分，可分为饱和烃(包括烷烃和环烷烃)、芳香烃(不饱和烃)、非烃(包括氧、硫、氮的化合)和沥青质(碳、氢、氧、硫、氮等多种元素组成的复杂结构的高分子化合物)。

随着社会的不断发展，人类对能源的需求与日俱增。石油作为一种宝贵的能源和化工原料，它的普及使用给人类的生产生活带来了巨大的便利。但与此同时，由于使用不当和日渐频繁的原油泄漏事故的发生，石油，这把双刃剑，在发挥着正面作用的同时，其负面影响也不容忽视。由于井喷、船舶漏油以及输油管道的泄漏等事故造成的海洋石油污染日渐增多，严重影响了生态环境及海洋生物资源。从目前的海洋石油污染事件来看，石油污染大部分集中在海洋和河流入海口附近的水体和沉积物中。全世界范围内的海洋石油污染事件频繁发生，对海洋生态系统造成了严重破坏。另外，石油的主要化学成分是烷烃和苯、甲苯、二甲苯等复杂芳香烃等，不仅有致癌变、致畸变、致突变等作用，并很可能在动植物及人体内富集，危害生物健康。

虽然环境中存在着大量微生物，但其中可以利用石油烃物质作为碳源和能源的并不多。一般而言，当石油污染抑制部分微生物生长的同时，恰恰能促进利用石油烃作为碳源和能源的微生物生长。据报道，降解烃类的微生物一般只占微生物群落总数的不到1％。而当石油污染物存在时，降解烃类微生物比例会增加到10％。由此可见石油对于该类菌种具有某种刺激作用，能够诱导其生长增殖。

针对日益严重的石油污染问题，国内外研究人员已经利用物理、化学和生物修复法在该领域取得了一定的进展，但石油污染治理工作仍然任重而道远。物理处理法主要通过物理方法和机械装置回收溢油。主要使用的方法有围油栏、吸油船、磁性分离和吸着材料等。该方法处理海面及海岸带油污的效率最高，但对于厚度小于0.3cm的薄油层和乳化油效果较差，并且设备庞大、耗费高。化学方法主要使用分散剂、凝油剂、集油剂和沉降剂等，但化学方法的本质却是向海洋中投入人工合成的化学污染物。不但成本高，也造成了二次污染。正是由于物理和化学处理法的种种弊端，其应用受到限制。而生物修复方法利用微生物消除水体表面油膜和分散水中溶解的石油烃类，具有成本低、效率高、对环境友好、不产生二次污染等显著优点，已经成为一种经济效益和环境效益俱佳的、解决石油污染问题的有效方法。

目前，生物修复法治理石油污染主要依赖于高效石油降解菌株的筛选。而石油降解菌的筛选主要以实验室研究为主，更多的是以单一石油烃组分或几种石油烃及其中间产物为碳源进行筛选。然而，将石油降解菌真正应用到实际环境中治理石油污染的报道还相对较少。

发明内容

鉴于此，有必要提供一种能够有效降解石油的石油降解菌株和石油降解菌剂。

一种石油降解菌株，其特征在于，所述菌株为迪茨氏菌属(Dietziasp.)CN-3，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2015537。

一种上述石油降解菌株的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

将蓬莱19-3溢油点的沉积物放入BHB培养基中，置于160rpm-200rpm的摇床中，在30℃培养1-2周，得到富集培养菌液，将所述富集培养菌液分离纯化，得到所述石油降解菌株；

其中，所述BHB培养基中添加质量体积浓度为0.5％-1％石油作为唯一的碳源和能源；

所述BHB培养基的组分为：

MgSO₄0.2g，CaCl₂0.02g，KH₂PO₄1g，K₂HPO₄1g，NH₄NO₃1g，FeCl₂0.05g，NaCl25g，蒸馏水1000mL，pH为6-8。

在其中一个实施例中，将所述富集培养菌液分离纯化包括如下步骤：

取所述BHB培养基中培养后的菌液加入至质量体积浓度为0.9％的无菌生理盐水中，依次稀释成10^-2、10^-3、10^-4的梯度稀释液；

分别取三种不同梯度稀释液涂布于BHA培养基平板上，在30℃恒温培养箱中培养24-48小时，其中，所述BHA培养基含质量体积浓度为0.5％-1％的石油；

选择不同形态的单菌落，分别在BHA培养基平板上进行划线分离，重复划线分离操作，直至形成形态单一的纯化菌落，得到所述石油降解菌株，其中，所述BHA培养基含质量体积浓度为0.5％-1％石油；

所述BHA培养基的组分为：MgSO₄0.2g，CaCl₂0.02g，KH₂PO₄1g,K₂HPO₄1g，NH₄NO₃1g，FeCl₂0.05g，NaCl25g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH为6-8。

一种石油降解菌剂，包括石油降解菌株迪茨氏菌属(Dietziasp.)CN-3，所述石油降解菌株迪茨氏菌属CN-3的保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2015537。

一种上述石油降解菌剂的制备方法，包括如下步骤：

无菌条件下取纯化的石油降解菌株CN-3于试管斜面培养基Ⅰ中，在30℃，培养24-48小时，得到一级种子，其中，所述培养基Ⅰ的组成为：Difco^TMMarineAgar2216培养基55.1g，1000mL蒸馏水，pH为6-8；

无菌条件下取所述一级种子接入到培养基Ⅱ中，置于160rpm-200rpm的摇床中，在30℃，培养24-48小时，得到二级种子，其中，所述培养基Ⅱ组成为：Difco^TMMarineBroth2216培养基37.4g，1000mL蒸馏水，pH为6-8；

按体积比为10％的接种量将所述二级种子接入到发酵罐的培养基Ⅲ中，置于80rpm-100rpm的摇床中，在30℃，培养12-24小时，得到所述石油降解菌剂，其中，所述培养基Ⅲ的组成为：蛋白胨8g，酵母粉2g，MgSO₄0.2g，CaCl₂0.02g，KH₂PO₄1g，K₂HPO₄1g，FeSO₄0.07g，NaCl10g，蒸馏水1000mL，pH为6-8。

一种采用上述石油降解菌剂降解石油的方法，包括如下步骤：按照1％-2％的接种量将石油降解菌剂接种到石油质量体积浓度为0.5％-1％的BHB培养基中，在30℃，160rpm-200rpm摇床中培养1-2周；

所述BHB培养基的组分为：

MgSO₄0.2g，CaCl₂0.02g，KH₂PO₄1g，K₂HPO₄1g，NH₄NO₃1g，FeCl₂0.05g，NaCl25g，蒸馏水1000mL。

在其中一个实施例中，所述BHB培养基的pH为6-8。

本发明还提供上述石油降解菌株或石油降解菌剂在降解石油中的应用。

上述石油降解菌株或石油降解菌剂还可以通过生物修复法去除环境中石油污染物。

上述石油降解菌株或石油降解菌剂还可以通过生物修复法治理石油污染土壤。

上述石油降解菌株CN-3，在中性偏碱性的环境中对石油的降解效果较好，并且能够耐受高盐度环境，特别适应于海洋环境。从而扩大了CN-3菌株在海洋石油污染治理中的应用范围，使其更加具有应用前景。

上述石油降解菌株的分离方法和石油降解菌剂的制备方法中，在石油降解菌的富集、分离纯化、种子液的制备和菌剂的发酵过程中，培养基都是以石油为唯一碳源和能源。这种条件下分离的石油降解菌株，以及制备的石油降解菌剂能够对石油有更好的耐受力，有利于提高其在实际石油污染环境中的生存能力和降解效率等。

附图说明

图1为一实施方式的石油降解菌株的分离方法流程图。

图2为不同石油降解菌株降解饱和烃的气相色谱图(GC-FID)，从上至下依次为空白对照组、菌株CN-1、菌株CN-2、菌株CN-3、菌株CN-4、菌株CN-5降解饱和烃的效果图。

图3为石油降解菌株CN-3的扫描电镜图。

图4为一实施方式的石油降解菌剂的制备方法的流程图。

图5为石油降解菌剂CN-3实验组和空白对照组对石油的降解效果图。A为空白对照组，只加入石油，未加入石油降解菌剂；B实验组，同时加入石油和石油降解菌剂CN-3。

图6为石油降解菌剂CN-3对石油组分饱和烃降解效果的GC-MS图。A为空白对照组，未加入石油降解菌剂CN-3，只加入石油；B为实验组，同时加入石油和石油降解菌剂CN-3。

图7为不同pH条件下石油降解菌株CN-3降解饱和烃的效果图。

图8为不同盐度条件下石油降解菌株CN-3降解饱和烃的效果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，如下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一种石油降解菌株，菌株为迪茨氏菌属(Dietziasp.)CN-3，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCM2015537。保藏日期为2015年9月15日。保藏单位地址：武汉，中国典型培养物保藏中心(武汉大学)。邮编：430072。

请参考图1，一实施方式的上述石油降解菌株的分离方法，包括如下步骤：

S110、将蓬莱19-3溢油点的沉积物放入BHB(Bushnell–HaasBroth)培养基中，置于160rpm-200rpm的摇床中，在30℃培养1-2周，得到富集培养菌液。其中，BHB培养基中添加质量体积浓度为0.5％-1％石油作为唯一的碳源和能源。

具体的，取10g19-3溢油点的沉积物放入100mLBHB培养基中进行培养。

S120、将富集培养菌液分离纯化，得到石油降解菌株。

S120中，将富集培养菌液分离纯化包括如下步骤：

S122、取BHB培养基中培养后的菌液加入至质量体积浓度(m/v)为0.9％的无菌生理盐水中，依次稀释成10^-2、10^-3、10^-4的梯度稀释液。

具体的，菌液和无菌生理盐水的体积比为1:9。

S124、分别取三种不同梯度稀释液涂布于BHA(Bushnell–HaasAgar)培养基平板上，在30℃恒温培养箱中培养24-48小时。其中，BHA培养基含质量体积浓度为0.5％-1％的石油。

S126、选择不同形态的单菌落，分别在BHA培养基平板上进行划线分离，重复划线分离操作，直至形成形态单一的纯化菌落，得到石油降解菌株。其中，BHA培养基含质量体积浓度为0.5％-1％的石油。

S126中可以重复划线2-3次，以形成形态单一的纯化菌落。

BHB培养基的组分为：

MgSO₄0.2g，CaCl₂0.02g，KH₂PO₄1g，K₂HPO₄1g，NH₄NO₃1g，FeCl₂0.05g，NaCl25g，蒸馏水1000mL，pH为6-8。BHB培养基在121℃灭菌20分钟。

BHA培养基的组分为：MgSO₄0.2g，CaCl₂0.02g，KH₂PO₄1g,K₂HPO₄1g，NH₄NO₃1g，FeCl₂0.05g，NaCl25g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH为6-8。BHA培养基在121℃灭菌20分钟。

S126后，还可将纯化后的菌落接种于斜面保存培养基Ⅰ中，30℃恒温培养箱中培养24-48小时，保存于4℃冰箱中待用。其中，培养基Ⅰ的组成为：55.1gDifco^TMMarineAgar2216培养基，1000mL蒸馏水，pH为6-8；

上述石油降解菌株的分离方法中，在石油降解菌的富集、分离纯化过程中，均以石油为唯一碳源和能源。这种条件下筛选的菌种能够对石油有更好的耐受力，有利于提高其在实际石油污染环境中的生存能力、降解效率等。

通过上述石油降解菌株的分离方法，得到了5种单一菌种，其菌落形态如表1所示。

表1石油降解菌株形态

下面采用气相色谱法验证菌株对石油烃的降解效果。

分别挑取不同菌株的单菌落接种于100mLBHB培养基(添加0.5g石油)中，置于180rpm的摇床中，30℃培养7天。不加菌的100mLBHB+0.5g石油样品为对照组。每组均设置三组平行。培养7天后，将培养液倒入分液漏斗中，用100mL正己烷分三次萃取石油。经过过滤、浓缩，将石油样品定容至25mL。然后利用柱层析方法分离石油组分。其中，柱层析方法分离石油组分的主要步骤包括：称量硅胶、氧化铝、无水硫酸钠进行装柱、上样、正己烷洗脱、二氯甲烷与正己烷混合溶液洗脱、甲醇洗脱，将石油组分中的饱和烃、芳香烃和胶质依次分离。

利用气相色谱法GC-FID对石油烃的降解率进行测定。降解效果如图2所示。从图中可以看出，经过7天的培养，5株菌对石油的饱和烃组分都有一定的降解效果。其中，CN-2、CN-3两株菌降解效果较好，特别是CN-3，对较多饱和烃组分有很大程度的降解。并且对于难以降解的姥鲛烷(Pr)和植烷(Ph)也有所降解。其余菌株降解效果一般。

因此，石油降解菌株CN-3可用于石油的降解。并且具有高效降解石油的效果。图3为菌株CN-3的扫描电镜图。

一种石油降解菌剂，包括石油降解菌株CN-3，石油降解菌株CN-3的保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2015537，保藏日期为2015年9月15日。

请参考图4，一实施方式的上述石油降解菌剂的制备方法，包括如下步骤：

S210、无菌条件下取纯化的石油降解菌株CN-3于试管斜面培养基Ⅰ中，在30℃，培养24-48小时，得到一级种子。

其中，培养基Ⅰ在121℃，高压蒸汽灭菌20min。培养基Ⅰ的组成为：55.1gDifco^TMMarineAgar2216培养基，1000mL蒸馏水，pH为6-8。

S220、无菌条件下取一级种子接入到培养基Ⅱ中，置于160rpm-200rpm的摇床中，在30℃，培养24-48小时，得到二级种子。

其中，培养基Ⅱ在121℃，高压蒸汽灭菌20min。培养基Ⅱ组成为：37.4gDifco^TMMarineBroth2216培养基，1000mL蒸馏水，pH为6-8。

S230、按体积比为10％的接种量将二级种子接入到发酵罐的培养基Ⅲ中，置于80rpm-100rpm的摇床中，在30℃，培养12-24小时，得到石油降解菌剂。

其中，培养基Ⅲ在121℃，高压蒸汽灭菌20min。培养基Ⅲ的组成为：蛋白胨8g，酵母粉2g，MgSO₄0.2g，CaCl₂0.02g，KH₂PO₄1g,K₂HPO₄1g，FeSO₄0.07g，NaCl10g，蒸馏水1000mL，pH为6-8。

上述石油降解菌剂的制备方法，种子液的制备和菌剂发酵过程中的培养基都是以石油为唯一碳源和能源。该条件下制备的石油降解菌剂能够对石油有更好的耐受力，有利于提高其在实际石油污染环境中的生存能力、降解效率等。

上述石油降解菌剂可用于石油的降解。

一实施方式的采用上述石油降解菌剂降解石油的方法，包括如下步骤：按照1％-2％的接种量将石油降解菌剂接种到石油质量体积浓度为0.5％-1％的BHB培养基中，在30℃，160rpm-200rpm摇床中培养1-2周。其中，BHB培养基的pH可以为6-8。

以上培养基中添加的石油均来自山东省东营市胜利油田。

采用上述石油降解菌剂降解石油的过程中，培养液中石油分散比较均匀，菌液浑浊，说明该石油降解菌剂CN-3可能能够产生表面活性剂，促进了石油在培养基中的溶解及分散。

上述石油降解菌株和石油降解菌剂在通过生物修复法去除环境中的石油污染物以及石油污染的土壤方面具有一定的应用前景。

下面为具体实施例部分。

实施例1

一、石油降解菌株的制备

(1)石油降解菌的富集

称取10g蓬莱19-3溢油点沉积物样品放入经高温灭菌(121℃灭菌20min)处理后的100mLBHB培养基中，其中添加0.5g石油作为唯一的碳源和能源。置于180rpm的摇床中，30℃培养7天。

(2)石油降解菌的分离纯化

a.采用梯度稀释法分离细菌。取富集培养后的菌液1mL加入9mL无菌0.9％(m/v)生理盐水中，依次稀释成10^-2、10^-3、10^-4梯度稀释液，每个梯度作三组平行。

b.分别取三种不同梯度的菌液100μL涂布于BHA培养基平板(含0.5％石油)上。30℃恒温培养箱中培养24小时。

c.选择不同形态的单菌落，分别在BHA培养基平板(含0.5％石油)上进行划线分离。重复划线分离操作，直至形成形态单一的纯化菌落。

d.纯化后的菌落接种于斜面保存培养基Ⅰ中，30℃恒温培养箱中培养24h，保存于4℃冰箱中待用。培养基Ⅰ组成为：55.1gDifco^TMMarineAgar2216培养基，1000mL蒸馏水，pH为7.6。

二、石油降解菌剂的制备

(1)一级种子培养

无菌条件下取纯化的海洋石油降解菌CN-3于试管斜面培养基Ⅰ中。培养基Ⅰ组成为：55.1gDifco^TMMarineAgar2216培养基，1000mL蒸馏水，pH为7.6。121℃，高压蒸汽灭菌20min。培养条件为：30℃，培养24小时，作为一级种子。

(2)二级种子培养

无菌条件下取一环一级种子接入到100mL培养基Ⅱ中摇床培养。培养基Ⅱ组成为：37.4gDifco^TMMarineBroth2216培养基，1000mL蒸馏水，pH为7.6。121℃，高压蒸汽灭菌20min。培养条件为：30℃，180rpm，培养24小时，作为二级种子。

(3)种子罐培养

按体积10％的接种量将二级种子接入到5L发酵罐的培养基Ⅲ中。培养基Ⅲ组成为：蛋白胨8g，酵母粉2g，MgSO₄0.2g，CaCl₂0.02g，KH₂PO₄1g,K₂HPO₄1g，FeSO₄0.07g，NaCl10g，蒸馏水1000mL，pH为7.6。121℃，高压蒸汽灭菌20min。培养条件为：30℃，80rpm，培养24小时，培养结束。

三、石油降解菌剂对石油的降解

将高效石油降解菌剂CN-3按照1％的接种量接种到石油浓度0.5％(w/v)的BHB培养基中，BHB培养基pH为7.0，30℃，180rpm摇床培养14天，培养液用于石油降解率的测定。培养完成后，加入有石油，未加入石油降解菌剂CN-3的空白对照组和同时加入石油和石油降解菌剂CN-3的实验组中石油的状态见图5所示。空白对照组中石油成团状，无法分散。而实验组石油被细菌分散成小液滴，培养液整体呈现浑浊状态，可见细菌生长量得到了明显的富集。从表观上可以看出该海洋石油降解菌CN-3对石油具有明显的分散作用。

四、石油降解菌剂CN-3对石油降解率的测定

将经过石油降解菌剂CN-3降解的培养液倒入分液漏斗中，用100mL正己烷分三次萃取石油。经过过滤、浓缩，将石油样品定容至25mL。然后利用柱层析方法分离石油组分。

其中，柱层析方法分离石油组分的主要步骤包括：称量硅胶、氧化铝、无水硫酸钠进行装柱、上样、正己烷洗脱、二氯甲烷与正己烷混合溶液洗脱、甲醇洗脱，将石油组分中的饱和烃、芳香烃和胶质依次分离。

利用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对石油烃的降解率进行测定。降解效果见图6。从峰图中可以明显看出，经过14天的培养，饱和烃各组分的峰发生了明显的变化，菌株CN-3的降解效果十分显著。链烷烃组分已经基本被完全降解，特别是对于碳原子数较少的低沸点的链烷烃，环烷烃只剩极小部分未被降解。另外，常被作为石油降解生物标记物的姥鲛烷(Pr)和植烷(Ph)是支链烷烃，它们的降解也非常明显。

实施例2

一、石油降解菌株的制备

(1)石油降解菌的富集

称取10g蓬莱19-3溢油点沉积物样品放入经高温灭菌(121℃灭菌20min)处理后的100mLBHB培养基中，其中添加1g石油作为唯一的碳源和能源。置于180rpm的摇床中，30℃培养10天。

(2)石油降解菌的分离纯化

a.采用梯度稀释法分离细菌。取富集培养后的菌液1mL加入9mL无菌0.9％(m/v)生理盐水中，依次稀释成10^-2、10^-3、10^-4梯度稀释液，每个梯度作三组平行。

b.分别取三种不同梯度的菌液100μL涂布于BHA培养基平板(含1％石油)上。30℃恒温培养箱中培养24小时。

c.选择不同形态的单菌落，分别在BHA培养基平板(含1％石油)上进行划线分离。重复划线分离操作，直至形成形态单一的纯化菌落。

d.纯化后的菌落接种于斜面保存培养基Ⅰ中，30℃恒温培养箱中培养24h，保存于4℃冰箱中待用。培养基Ⅰ组成为：55.1gDifco^TMMarineAgar2216培养基，1000mL蒸馏水，pH为6。

二、石油降解菌剂的制备

(1)一级种子培养

无菌条件下取纯化的海洋石油降解菌CN-3于试管斜面培养基Ⅰ中。培养基Ⅰ组成为：55.1gDifco^TMMarineAgar2216培养基，1000mL蒸馏水，pH为6。121℃，高压蒸汽灭菌20min。培养条件为：30℃，培养24小时，作为一级种子。

(2)二级种子培养

无菌条件下取一环一级种子接入到100mL培养基Ⅱ中摇床培养。培养基Ⅱ组成为：37.4gDifco^TMMarineBroth2216培养基，1000mL蒸馏水，pH为6。121℃，高压蒸汽灭菌20min。培养条件为：30℃，160rpm，培养24小时，作为二级种子。

(3)种子罐培养

按体积10％的接种量将二级种子接入到5L发酵罐的培养基Ⅲ中。培养基Ⅲ组成为：蛋白胨8g，酵母粉2g，MgSO₄0.2g，CaCl₂0.02g，KH₂PO₄1g,K₂HPO₄1g，FeSO₄0.07g，NaCl10g，蒸馏水1000mL，pH为6。121℃，高压蒸汽灭菌20min。培养条件为：30℃，90rpm，培养12小时，培养结束。

三、石油降解菌剂对石油的降解

将高效石油降解菌剂CN-3按照2％的接种量接种到石油浓度1％(w/v)的BHB培养基中，BHB培养液pH为6.0，30℃，160rpm摇床培养10天，培养液用于石油降解率的测定。培养完成后，加入有石油，未加入石油降解菌剂CN-3的空白对照组和同时加入石油和石油降解菌剂CN-3的实验组中石油的状态见图5所示。空白对照组中石油成团状，无法分散。而实验组石油被细菌分散成小液滴，培养液整体呈现浑浊状态，可见细菌生长量得到了明显的富集。从表观上可以看出该海洋石油降解菌CN-3对石油具有明显的分散作用。

四、石油降解菌剂CN-3对石油降解率的测定

测定方法同实施例1。结果表明，菌株CN-3对石油的的降解效果十分显著。链烷烃组分已经基本被完全降解，特别是对于碳原子数较少的低沸点的链烷烃，环烷烃只剩极小部分未被降解。另外，姥鲛烷(Pr)和植烷(Ph)是支链烷烃，它们的降解比较困难且常被作为石油降解的生物标记物，但菌株CN-3对姥鲛烷(Pr)和植烷(Ph)的降解也非常明显。

实施例3

一、石油降解菌株的制备

(1)石油降解菌的富集

称取10g蓬莱19-3溢油点沉积物样品放入经高温灭菌(121℃灭菌20min)处理后的100mLBHB培养基中，其中添加0.7g石油作为唯一的碳源和能源。置于200rpm的摇床中，30℃培养10天。

(2)石油降解菌的分离纯化

a.采用梯度稀释法分离细菌。取富集培养后的菌液1mL加入9mL无菌0.9％(m/v)生理盐水中，依次稀释成10^-2、10^-3、10^-4梯度稀释液，每个梯度作三组平行。

b.分别取三种不同梯度的菌液100μL涂布于BHA培养基平板(含0.7％石油)上。30℃恒温培养箱中培养48小时。

c.选择不同形态的单菌落，分别在BHA培养基平板(含0.7％石油)上进行划线分离。重复划线分离操作，直至形成形态单一的纯化菌落。

d.纯化后的菌落接种于斜面保存培养基Ⅰ中，30℃恒温培养箱中培养48h，保存于4℃冰箱中待用。培养基Ⅰ组成为：55.1gDifco^TMMarineAgar2216培养基，1000mL蒸馏水，pH为8。

二、石油降解菌剂的制备

(1)一级种子培养

无菌条件下取纯化的海洋石油降解菌CN-3于试管斜面培养基Ⅰ中。培养基Ⅰ组成为：55.1gDifco^TMMarineAgar2216培养基，1000mL蒸馏水，pH为8。121℃，高压蒸汽灭菌20min。培养条件为：30℃，培养48小时，作为一级种子。

(2)二级种子培养

无菌条件下取一环一级种子接入到100mL培养基Ⅱ中摇床培养。培养基Ⅱ组成为：37.4gDifco^TMMarineBroth2216培养基，1000mL蒸馏水，pH为8。121℃，高压蒸汽灭菌20min。培养条件为：30℃，200rpm，培养48小时，作为二级种子。

(3)种子罐培养

按体积10％的接种量将二级种子接入到5L发酵罐的培养基Ⅲ中。培养基Ⅲ组成为：蛋白胨8g，酵母粉2g，MgSO₄0.2g，CaCl₂0.02g，KH₂PO₄1g,K₂HPO₄1g，FeSO₄0.07g，NaCl10g，蒸馏水1000mL，pH为8。121℃，高压蒸汽灭菌20min。培养条件为：30℃，100rpm，培养20小时，培养结束。

三、石油降解菌剂对石油的降解

将高效石油降解菌剂CN-3按照2％的接种量接种到石油浓度0.7％(w/v)的BHB培养基中，BHB培养液pH为8.0，30℃，200rpm摇床培养7天，培养液用于石油降解率的测定。培养完成后，加入有石油，未加入石油降解菌剂CN-3的空白对照组和同时加入石油和石油降解菌剂CN-3的实验组中石油的状态见图5所示。空白对照组中石油成团状，无法分散。而实验组石油被细菌分散成小液滴，培养液整体呈现浑浊状态，可见细菌生长量得到了明显的富集。从表观上可以看出该海洋石油降解菌CN-3对石油具有明显的分散作用。

四、石油降解菌剂CN-3对石油降解率的测定

测定方法同实施例1。结果表明，菌株CN-3对石油的的降解效果十分显著。

实施例四

pH对饱和烃降解效果的影响：

调节含0.5％石油的BHB培养基的pH分别为5、6、7、8、9、10，接入已预先培养的石油降解菌剂CN-3。设置未加菌的含0.5％石油的BHB培养基为空白对照组。每组均设置三个平行。置于30℃、180rpm的摇床中培养10天后，用气相色谱法测定菌株对饱和烃的降解效果。

由图7可以看出：不同pH条件下，菌株CN-3对饱和烃的降解率具有显著的差异。在pH为5和10时，降解率偏低，分别约为42％和57％；在pH为6-9范围内，均具有较高的降解率。其中，在pH为7时饱和烃的降解率最大，约高达83％。可见，CN-3菌株中性偏碱性的环境中降解效果较好，最佳pH为7。而海洋环境是弱碱性环境，这更加扩大了CN-3菌株在海洋石油污染治理中的应用范围和应用前景。

实施例五

盐度对饱和烃降解效果的影响：

添加NaCl，调节含0.5％石油的BHB培养基的盐度分别为10g/L、25g/L、40g/L、55g/L、70g/L、85g/L，接入预先培养的石油降解菌剂CN-3。设置未加菌的含0.5％石油的BHB培养基为空白对照组。每组均设置三个平行。置于30℃、180rpm的摇床中培养10天后，用气相色谱法测定菌株对石油烃的降解效果。

由图8可以看出：不同盐度条件下，CN-3菌株对饱和烃的降解率差异不显著，石油烃的降解率均在75％以上。并且高盐度条件下，降解率仅仅稍有下降。可见，盐度对于石油烃降解率的影响不明显，该菌株具有一定的耐盐性，特别适应于海洋环境中。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。