一种去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体及包含它的重组体系

摘要

本发明公开了一种去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体及包含它的重组体系。去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体，其DNA序列如SEQ？NO：1所示。与现有技术相比，本发明所提供的去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体(M52A突变体)具有降低蛋白稳定性和可化学诱导重新获得蛋白稳定性的特性，其四级结构并未发生明显变化，仍为球形壳状结构；野生型铁蛋白T

说明书

技术领域

本发明涉及一种去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体及包含它的重组体系，属于基因工程技术领域。

背景技术

铁元素是大多数生物有机体进行新陈代谢所必须的元素之一，它在维持细胞生长代谢过程中起到重要的作用。铁蛋白是一类广泛存在于动植物、微生物细胞内的用来维持铁代谢平衡的重要蛋白。

大肠杆菌铁蛋白结构呈球形，由铁核和蛋白壳两部分组成，前者以氢氧化铁和磷酸盐的形式存在于蛋白壳，后者是由24个亚基单体组成的八面体高度对称性结构。铁蛋白外径12nm，内径约8nm，由于其独特的纳米级立体空间结构，其在药物载体以及纳米结构材料设计等方面已成为研究热点。大肠杆菌铁蛋白的血红素分子存在于二相对称轴的相邻亚基之间，距离蛋白壳外表面10埃，血红素的卟啉环与二相对称轴平行，对称的两个亚基上的Met52从卟啉环两侧与卟啉环的铁配位络合。血红素参与了蛋白的铁存储和释放过程中的电子传递，是细菌铁蛋白的电子隧道组成之一。Met52被认为是大肠杆菌铁蛋白与血红素结合的关键氨基酸位点，但将其突变为丙氨酸且发现其对铁蛋白稳定性影响至今未见报道。

发明内容

本发明提供一种去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体及包含它的重组体系，所得突变体具有可调控的温度稳定性，可作为一种通过小分子诱导控制温度稳定性的蛋白质纳米载体。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体，其DNA序列如SEQNO：1所示。

上述的去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体，为定点突变，是将第52位蛋氨酸突变为丙氨酸。

上述去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体，其氨基酸序列如SEQNO：2所示。

用于扩增去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体的引物对为：

上游引物：5’-ATCGATGAAGCGAAACATGCAGATCG-3’

下游引物：5’-GCTTTCATGGTATTCCACATCGTTCAG-3’。

上述去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体的纯化方法包括顺序相接的如下步骤：

(1)挑取含重组质粒pET32Ek/LIC-M52A的大肠杆菌摇菌培养；当培养至OD₆₀₀达到0.6，30℃下用终浓度0.5mMIPTG诱导3h；

(2)离心收集菌体并洗涤；

(3)用Ni-NTA亲和柱纯化：向洗涤后的菌体中加入1×BindingBuffer重悬菌体，超声破碎菌液后离心，然后取离心液通过0.22μm水系膜过滤后上样，用10mM咪唑洗脱去除杂蛋白，最后用15mM咪唑洗脱液收集目标蛋白洗脱，最后在25℃温度下用2U/μL肠激酶酶切20h，即可获得目标蛋白。

上述pET32Ek/LIC为载体，M52A为去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体。

上述去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体恢复稳定性的化学诱导方法为：将血红素与去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体以摩尔比1:10均匀混合，在25℃下诱导36h。

大肠杆菌细菌铁蛋白由24个亚基单体组成，该铁蛋白热力学稳定性高(熔点T_m为69.9℃)，亚基之间以C4、C3和C2形式高度对称、精密排列，其中处在C2对称性上每两个亚基即存在一个血红素分子，血红素是一种铁卟啉化合物，申请人经研究发现，去除血红素虽然对铁蛋白的自组装没有明显影响，但是对其热稳定性产生较大影响，其T_m值54.3℃远小于野生型铁蛋白T_m值69.9℃，且经过氯化血红素与该突变体M52A化学诱导结合后，发现其T_m值重新恢复至67.7℃，由此可知，突变体M52A对大肠杆菌铁蛋白稳定性影响很大，且血红素具有调控铁蛋白稳定性的作用。

一种重组体系，在所述的重组体系上克隆有如SEQNO：1所示的DNA序列；所述的重组体系包括重组质粒和重组菌。

本发明未提及的技术均参照现有技术。

有益效果：与现有技术相比，本发明所提供的去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体(M52A突变体)具有降低蛋白稳定性和可化学诱导重新获得蛋白稳定性的特性，其四级结构并未发生明显变化，仍为球形壳状结构；野生型铁蛋白T_m(50％蛋白质发生变性的温度)为69.9℃，而突变体M52A的T_m仅为54.3℃，与氯化血红素化学诱导后其T_m恢复为67.7℃，因此该突变体具有温度稳定性可调控性；由于铁蛋白已被广泛应用于纳米材料的载体，此突变体M52A不影响蛋白的聚合度，且仍形成24聚体壳状结构，因此仍可作为载体应用于纳米材料的合成；其显著优点在于可通过加入小分子化合物氯化血红素使铁蛋白温度稳定性提高，可应用于温敏性材料的合成。

附图说明

图1是pET32Ek/LIC-M52A的琼脂糖凝胶核酸电泳图；

图2是M52A的SDS-PAGE蛋白电泳图；

图3是M52A和M52A+Hemin在25℃下圆二色谱扫描图；

图4是M52A和M52A+Hemin在200-600nm范围内的紫外可见扫描图；

图5是野生型铁蛋白、突变体M52A以及M52A+Hemin的热稳定性比较图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

大肠杆菌铁蛋白突变基因M52A的制备方法：

以含有野生型大肠杆菌铁蛋白基因的质粒pET32Ek/LIC为模板，通过常规PCR的方法可得到含有点突变M52A的基因序列(引物采用实施例2的引物)。

大肠杆菌铁蛋白突变体M52A基因序列如SEQNO：1所示。

实施例2

大肠杆菌铁蛋白基因M52A的克隆：

用下述一对引物PCR扩增实施例1中的大肠杆菌铁蛋白基因：

上游引物：5’-ATCGATGAAGCGAAACATGCAGATCG-3’

下游引物：5’-GCTTTCATGGTATTCCACATCGTTCAG-3’

PCR反应体系：1μL合成序列(实施例1所得)，1μL上游引物，1μL下游引物，10μL5×PrimeSTARTMBuffer，32.5μLddH₂O，4μLdNTP，0.5μLPrimeSTARTMHSDNA聚合酶。

PCR反应条件：95℃5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸4.5min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保温。

实施例3

重组克隆、表达载体pET32Ek/LIC-M52A(实施例2所得)的验证：

将PCR产物(实施例2制备)进行琼脂糖凝胶验证：制备10％琼脂糖凝胶，加入核酸染料至终浓度为0.5μg/mL，将5μLDNA样品与1μL6×LoadingBuffer混匀，小心加入加样孔中，同时加入DL10000或1kbladderMarker。

设定100～120V恒压电泳，待溴酚蓝前沿跑至距凝胶正极端约1cm左右时停止电泳。如图1所示，在7000bp处有明显的条带，与目的片段理论大小一致，说明此基因已被成功克隆。

实施例4

pET32Ek/LIC-M52A(实施例2所得)重组质粒的去模板、纯化、磷酸化及自身环化：

构建反向PCR产物去模板反应体系(50μL)：44μL反向PCR产物(实施例2所得),5μLDpnIBuffer,1μLDpnI，置于37℃水浴4h。

为降低产物浓度，采用PCR产物纯化试剂盒进行纯化(BIOMIGA，上海)。

DNA浓缩后进行磷酸化反应：8μLPCR纯化产物；1μLT4Ligase10×buffer；1μLT4PolynucleotideKinase，37℃水浴3h后，加热至70℃，5min使T4磷酸化激酶失活。

磷酸化后的DNA进行质粒的自身环化反应：8μL磷酸化质粒,1μLT4Ligase10×buffer,1μLT4DNALigase，将上述体系置于16℃水浴12h。

实施例5

pET32Ek/LIC-M52A(实施例4所得)重组质粒的热击转化与提取：

取一管E.coliTOP10热激感受态细胞，冰上化冻，加入20μL连接液，冰浴10min；42℃热激90s；取出冰浴放置5min；加入1mLSOC培养基，37℃，180rpm，振荡培养45min；取出菌液涂布于含0.1mg/mL氨苄抗生素的LLB平板上，放于37℃恒温培养箱中倒置培养12h左右，可见明显单菌落产生；质粒提取采用提取试剂盒进行(BIOMIGA，上海)。

实施例6

M52A蛋白诱导表达与纯化：

(1)将测序正确的质粒(实施例5所得)重新通过热击的方式导入BL21(DE3)的感受态细胞中。挑取LLB平板上的单菌落接种于含5mLLLB+Amp培养基的试管中，并在37℃下以180r/min培养至OD₆₀₀大约0.6。

(2)取上述菌液1.5mL于含150mLLLB+Amp培养基的500mL摇瓶中，37℃，180r/min培养至OD₆₀₀大约0.8。

(3)加入IPTG使其终浓度为0.5mM，在30℃下诱导3h。

(4)4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。

(5)超声波破壁，功率600W，工作时间5s，每次脉冲间隔10s，共5min×3次，破壁直至菌液澄清为止。

(6)4℃，10000rpm离心15min，留上清液。

样品为超声波破壁后的上清液，上样前用0.22μm的滤膜过滤。

肠激酶所使用的缓冲液(EkBuffer)为20mMTris-HCl,100mMNaCl,pH8.0。纯化步骤为：先加入BindingBuffer润洗镍柱使其平衡到Bindingbuffer缓冲液环境，然后加入样品(超声波破壁后的上清液)使其与镍柱充分结合，分别加入10mM咪唑、15mM咪唑程序多次洗脱杂蛋白，再转换至EkBuffer环境中，依据蛋白浓度加入适量肠激酶(2U/μL)，放置于25℃摇床，80rpm中酶切20h，保存所得上清液，并取少量纯化后样品(纯化后所得上清液)进行SDS-PAGE验证，由图2可知目的蛋白已成功获得。

将所得上清液加入超滤管置换为GFCBuffer，并以凝胶过滤层析法对其进行纯化。

凝胶过滤纯化所使用的色谱柱为SephadexG-200葡聚糖凝胶柱，所使用的缓冲液(GFCBuffer)为50mMNaH₂PO₄,150mMNaCl,pH7.0。

实施例7

将氯化血红素(Hemin)与突变蛋白M52A(实施例6所得)进行化学诱导结合：

利用氯化血红素(Hemin)易溶于氢氧化钠溶液的性质，先将氯化血红素溶于1mol/L氢氧化钠溶液中制成母液浓度为1.27mg/mL，再按照摩尔浓度比为1:10(血红素与突变蛋白M52A的摩尔比)将母液加入到70μg/mL的M52A突变蛋白溶液中，保持温度为25℃，以8r/min速率旋转诱导结合，反应时间为36h。

实施例8

圆二色谱仪表征突变蛋白M52A(实施例6所得)的二级结构及热力学性质：

利用圆二色谱仪(法国BioLogicMOS500)对样品的二级结构进行检测。样品池光程为2mm，扫描范围为190-250nm，扫描速度50nm/min，25℃。

由图3可知突变蛋白M52A和野生型大肠杆菌铁蛋白的二级结构相比并没有发生改变，均主要是α螺旋结构，这就说明血红素的去除对于铁蛋白的二级结构形成并不造成影响。

利用法国BioLogicTCU250仪器考察在222nm处从25℃升温至95℃时M52A的变性过程，通过对数据进行拟合，得到图5。由图5可知，突变蛋白M52A的T_m＝54.3℃,远远小于野生型铁蛋白的T_m＝69.9℃。

实施例9

M52A+Hemin蛋白(实施例7所得)的表征：

对波长在200-600nm范围进行全波长扫描，得到图4。由图可知，M52A蛋白及M52A+Hemin的络合蛋白在280nm处均有特征吸收，而在300-450nm处则为Hemin的特征吸收峰，最大吸收峰约在395nm处。

利用圆二色谱仪对M52A+Hemin蛋白溶液进行25℃下圆二色谱检测，可知M52A+Hemin的二级结构与M52A相比并没有发生改变，均主要是α螺旋结构，这就说明氯化血红素的重新络合对铁蛋白的二级结构形成并不造成影响。

通过考察蛋白样品在222nm处从25℃升温至95℃时蛋白质的变性过程，对数据进行拟合，得到图5。

由图5可知，络合蛋白M52A+Hemin的T_m＝67.7℃,远远大于蛋白M52A的T_m＝54.3℃，接近于野生型铁蛋白的T_m＝69.9℃。

SEQUENCELISTING

<110>南京林业大学

<120>一种去除血红素的大肠杆菌铁蛋白突变体及包含它的重组体系

<130>20151230001

<160>4

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>474

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(474)

<400>1

atgaaaggtgataccaaagtgatcaactacctgaacaaactgctgggtaacgaactggtg60

gcaatcaaccagtacttcctgcatgcacgtatgttcaaaaactggggtctgaaacgtctg120

aacgatgtggaataccatgaaagcatcgatgaagcgaaacatgcagatcgttacatcgaa180

cgtatcctgttcctggaaggtctgccgaacctgcaggatctgggtaaactgaacatcggt240

gaagatgtggaagaaatgctgcgtagcgatctggcactggaactggatggtgcaaaaaac300

ctgcgtgaagcaatcggttacgcagatagcgtgcatgattacgtgagccgtgatatgatg360

atcgaaatcctgcgtgatgaagaaggtcatatcgattggctggaaaccgaactggatctg420

atccagaaaatgggtctgcagaactacctgcaggcacagatccgtgaagaaggt474

<210>2

<211>158

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>人工序列

<220>

<221>CHAIN

<222>(1)..(158)

<400>2

MetLysGlyAspThrLysValIleAsnTyrLeuAsnLysLeuLeuGly

151015

AsnGluLeuValAlaIleAsnGlnTyrPheLeuHisAlaArgMetPhe

202530

LysAsnTrpGlyLeuLysArgLeuAsnAspValGluTyrHisGluSer

354045

IleAspGluMetLysHisAlaAspArgTyrIleGluArgIleLeuPhe

505560

LeuGluGlyLeuProAsnLeuGlnAspLeuGlyLysLeuAsnIleGly

65707580

GluAspValGluGluMetLeuArgSerAspLeuAlaLeuGluLeuAsp

859095

GlyAlaLysAsnLeuArgGluAlaIleGlyTyrAlaAspSerValHis

100105110

AspTyrValSerArgAspMetMetIleGluIleLeuArgAspGluGlu

115120125

GlyHisIleAspTrpLeuGluThrGluLeuAspLeuIleGlnLysMet

130135140

GlyLeuGlnAsnTyrLeuGlnAlaGlnIleArgGluGluGly

145150155

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(26)

<400>3

atcgatgaagcgaaacatgcagatcg26

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(27)

<400>4

gctttcatggtattccacatcgttcag27