基于罗丹明B-噻吩衍生物的快速响应性Hg2+显色-荧光探针的制备方法

摘要

本发明涉及一种基于罗丹明B-噻吩衍生物的快速响应性Hg2+显色-荧光探针的制备方法。由罗丹明B与二乙烯三胺进行缩合酰化反应，得到罗丹明B-二乙烯三胺衍生物，再将罗丹明B-二乙烯三胺衍生物与2-噻吩甲醛进行缩合反应，得到一种罗丹明B-噻吩衍生物，该基于罗丹明B-噻吩衍生物的水-乙醇混合溶液可用作快速响应性Hg2+显色-荧光探针。本发明可用于快速分析水样中Hg2+含量的快速响应性显色-荧光探针，它对其他金属离子（Na+，K+，Mg2+，Fe3+，Cu2+，Zn2+，Cr3+）的抗干扰能力强，适用pH范围为酸性到中性，是一种理想的Hg2+显色-荧光探针；该Hg2+显色指示剂对Hg2+的响应时间小于2分钟，最低检测限为2.0×10-7？mol/L；本发明具有合成工艺简单、成本低廉、操作简便、灵敏度高、响应速度快、检测限低、应用前景广泛等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种汞离子（Hg²⁺）检测剂，具体涉及一种基于罗丹明B-噻吩衍生物的 快速响应性Hg²⁺显色-荧光探针的制备方法。

背景技术

在全球工业化进程当中，人为活动造成环境中的重金属离子含量日益增加，污染 范围也日益扩大。我国水体重金属污染问题十分突出，江河湖库底质的污染率高达80.1% [周怀东,彭文启等.水环境与水环境修复.北京：化学工业出版社,2005]。早在80年代 初的调查中就发现，在金沙江、湘江、蓟运河、锦州湾等许多水体均有不同程度的重金属污 染，其中严重地段的水相重金属浓度高达几百ppb，沉积物中重金属浓度达上千ppm[HoK C,HuiKCC.ChemicalcontaminationoftheEastRiver(Dongjiang)andits implicationonsustainabledevelopmentinthePearlRiverDelta.Environment International,2001,26(5,6):303-308]。2003年黄河、淮河、松花江、辽河等十大流 域的流域片重金属超标断面的污染程度均为超Ⅴ类[胡必彬.我国十大流域片水污染现状 及主要特征.环境科学,2003,25:15-17]。2012年1月15日，广西龙江河拉浪水电站网箱 养鱼出现少量死鱼现象，经调查发现，龙江河宜州拉浪码头前200米水质重金属超标80倍。 农历龙年春节，龙江河段检测出重金属汞含量超标，使得沿岸及下游居民饮水安全遭到严 重威胁。这个事件的起因是两个厂家违法排污导致汞泄漏量达到约20吨。

汞是一种危害极大的环境污染物，近年来我国《重金属污染综合防治规划》和《“十 二五”重点区域大气污染联防联控规划》都把汞的污染及其综合防治列入重点领域。规划中 明确指出：“十二五”期间，要建立典型燃煤机组排放清单的计算模型，开展燃煤电厂大气汞 排放在线监测试点工作；尽量早日开发试点项目，在烟气除尘、脱硫、脱硝的同时，控制汞污 染，实现多污染物的联合控制，并对项目的经济、技术和环境效益进行总体评估。环境保护 部也提出了推进大气污染联防联控的指导意见，加强能源清洁利用，严格控制燃煤污染的 排放，研制火电机组烟气除尘、脱硫、脱硝和除汞等多污染物协同控制技术，加大重点污染 物防治力度。

汞污染所产生的严重影响，促进了汞离子检测技术的不断研究与发展。常用的对 汞离子进行检测的方法有原子吸收/发射光谱法、原子荧光法、电感耦合等离子体法、X射线 荧光光谱法、电感耦合等离子质谱法、电感耦合等离子体原子发射光谱法、免疫分析法、电 化学法、生物化学传感器法等。这些方法虽然各具优点，但在实际使用中仍存在很大的弊 端，如灵敏度低、仪器昂贵以及操作复杂等，这些方法需要专门的实验室、专业的操作技术 人员和复杂的样品前处理过程，耗费耗时，要求太高，况且对某些重金属离子并不敏感，甚 至无法检测等问题，不适用于日常生活中对水样、土壤和食品等样本的检测，也不能满足应 对突发事件时的需要。在突发环境污染事件调查和流域区域尺度的生态风险调查中，由于 区域范围广，需要采集的环境样品数量大，迫切需要高通量的、实时的现场筛查技术。因此， 寻求一种简单、快速、灵敏的重金属离子定性定量检测技术意义重大。

其次，汞离子的种类多、含量低、样品组成复杂、具有流动性和不稳定性，根据环境 中汞离子的特点，决定了汞离子的分析技术和方法需要灵敏、准确、实时、快速的分析。为了 减少中间环节，测得汞离子在环境中的含量和污染程度，要实时对污染物进行定量检测。目 前国际上环境检测的发展方向为：在线、实时、简便、易携、灵敏度高，检出限低、灵敏性好， 可用于复杂样品的测量，可供大批量的检测，能用于不同来源的环境样品。

另外，因为汞离子长期存在并持续污染着自然环境，在极其微量的情况下也会产 生不良后果，怎样科学地评价环境汞离子的污染程度、怎样防治污染等都离不开对汞离子 的含量分析，因此进行微/痕量汞离子的分析具有非常重要的意义。

近年来，基于离子诱导产生的颜色和荧光变化机理检测金属离子的显色-荧光探 针技术由于具有灵敏度高、检测限低、操作简单、成本低等特点，已经成为目前检测汞离子 污染的重要手段[MaoJ,HeQ,LiuWS.An“off–on”fluorescenceprobefor chromium(III)iondeterminationinaqueoussolution.AnalBioanalChemistry, 2010,396:1197-1203；DongM,WangYW,PengY.Highlyselectiveratiometric fluorescentsensingforHg²⁺andAu³⁺respectivelyinaqueousmedia.Organic Letters,2010,12:5310-5313]，人们在利用分子识别原理设计各种金属离子显色-荧光 探针技术方面取得了极大的成功并广泛应用于化学、生物学和环境科学等领域。罗丹明 （Rhodamine）由于其出色的光谱性质，如长波发散效应、较高的荧光量子转化率以及强摩尔 消光系数[HauglandRP.Aguidetofluorescentprobesandlabeling technologies.InvitrogenCorporation,Karlsbad,CA,2005]，因此成为了一种被广 泛使用的显色-荧光探针。近几年来，利用罗丹明结构中的羧基与伯氨反应生成独特的五元 环内酰胺结构，通过结合重金属离子，使原先不具有颜色、没有荧光效应的内酰胺结构分子 开环转化为在可见光范围内有很强吸收能力且发出很强荧光的酰胺结构，达到检测某种重 金属离子的报道日益增多。由于具有响应机理独特、检测灵敏、干扰少等特点，基于罗丹明 类分子的显色-荧光探针在重金属和过渡金属离子的检测中得到了广泛应用，可检测的重 金属离子包括Cu²⁺，Pb²⁺，Zn²⁺，Hg²⁺等。

下式给出了罗丹明B与重金属离子作用的示意路线。如下式所示，闭环结构的罗丹 明分子摩尔吸光系数和荧光量子产率都非常低，几乎没有荧光。但当连上识别基团R后，在 羰基与识别基团的协同作用下可与某种重金属或过渡金属离子发生作用，从而导致探针的 内酰胺键断裂，形成开环结构，导致分子的荧光强度显著增强，实现对该离子的灵敏性识 别。

罗丹明B内酰胺结构的成环与开环过程

但是目前研究较多的汞离子的显色-荧光探针多采用有机基团络合金属离子的原理， 因而显色-荧光探针多为含有机杂环的分子，在水溶液中溶解度不甚理想。此外，微/痕量汞 离子与显色-荧光探针的结合效果仍然不够理想，因此检测灵敏度和适用范围受到许多限 制，对于汞离子而言，寻找更灵敏、高效的检测剂依然是摆在我们面前的难题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提出一种基于罗丹明B-噻吩衍生物 的快速响应性Hg²⁺显色-荧光探针制备方法。

本发明提出的一种基于罗丹明B-噻吩衍生物的快速响应性Hg²⁺显色-荧光探针，首 先由罗丹明B与二乙烯三胺进行缩合酰化反应，得到罗丹明B二乙烯三胺衍生物；该罗丹明B 二乙烯三胺衍生物再与噻吩甲醛发生酰氯反应，得到一种罗丹明B-噻吩衍生物；该罗丹明 B-噻吩衍生物的水-乙醇混合溶液可用作Hg²⁺显色荧光探针，在该罗丹明B-噻吩衍生物的 Hg²⁺显色-荧光探针的水-乙醇混合溶液中加入Hg²⁺后，混合溶液的颜色由无色变为粉红色， 对应的紫外-可见光吸收光谱中560nm处的吸收峰随着Hg²⁺浓度的升高而增强；该罗丹明B- 噻吩衍生物的快速响应性Hg²⁺显色-荧光探针对Hg²⁺的响应时间小于2分钟，最低检测限为 2.0×10^-7mol/L，并可用于水环境中微/痕量Hg²⁺的半定量检测。

本发明提出的一种基于罗丹明B-噻吩衍生物的快速响应性Hg²⁺显色-荧光探针的 制备方法，该罗丹明B-噻吩衍生物的合成路线如下所示：

具体步骤如下：

（1）称取1~10g罗丹明B和20~200mL醇溶剂加入到250mL反应瓶中，充分搅拌使罗丹 明B完全溶解，在保持搅拌的情况下逐滴加入1~10mL二乙烯三胺，在氮气保护下于75~85℃ 反应4~40h，反应结束后将反应瓶冷却至室温，抽滤并旋蒸除去溶剂，所得淡棕色固体用40 ~400mL二氯甲烷萃取2~4次，合并有机相，用水洗3~5次，用无水硫酸钠干燥2~20小时，过 滤，收集滤液，旋蒸得橘黄色固体，再过柱层析分离（展开剂为甲醇：二氯甲烷=1：5，v/v），得 到罗丹明B-二乙烯三胺衍生物，产率为85%-95%。

（2）称取0.5~5g步骤(1)制得的罗丹明B-二乙烯三胺衍生物和10~100mL无水乙 醇加入到250mL反应容器中，充分搅拌使完全溶解，再将0.5~5g2-噻吩甲醛溶解在2~20 mL无水乙醇中，使用恒压滴液漏斗逐滴加入250mL反应容器中，在氮气保护下于60～90℃ 反应4~24h，反应结束后旋蒸出无水乙醇，用10~100ml二氯甲烷萃取2~4次，合并有机相， 再用水洗2~4次，得有机相，用无水硫酸钠干燥1~10小时，旋蒸出二氯甲烷，再过柱层析分离 （展开剂为甲醇：二氯甲烷=1：10，v/v）得浅黄色固体，即为罗丹明B-噻吩衍生物，产率80%- 95%。

（3）称取0.01~0.1g步骤(3)制备的罗丹明B-噻吩衍生物溶于100~1000g水和醇 溶剂组成的混合溶液中得到一种基于罗丹明B-噻吩衍生物的快速响应性Hg²⁺显色-荧光探 针。

本发明中，罗丹明B的化学结构式如下：

本发明中，二乙烯三胺的化学结构式如下：

本发明中，2-噻吩甲醛的化学结构式如下：

本发明中，步骤(1)和(3)中所述醇溶剂采用乙醇、甲醇或异丙醇中任一种，步骤(3)中 所述水和醇溶剂的体积比为1：10~10：1，该罗丹明B-噻吩衍生物具有良好的溶解度，达到 0.01~1mmol/L，可用作一种基于罗丹明B-噻吩衍生物的快速响应性Hg²⁺显色-荧光探针。

本发明的优点是：①本发明为一种基于罗丹明B-噻吩衍生物的快速响应性Hg²⁺显 色-荧光探针的制备方法，可用于快速分析水样中Hg²⁺含量的快速响应性显色-荧光探针，它 对水样中其他共存金属离子（Na⁺,Fe³⁺,Pb²⁺,Zn²⁺,Mg²⁺,Fe²⁺,Cr³⁺）的抗干扰能力强， 适用pH范围广（酸性到中性），是一种高效的汞离子显色荧光探针；②该基于罗丹明B-噻吩 衍生物的快速响应性Hg²⁺显色-荧光探针对Hg²⁺的响应时间小于2分钟，最低检测限为2.0× 10^-7mol/L；③本发明具有合成工艺简单、成本低廉、操作简便、灵敏度高、响应速度快、检测 限低、应用前景广泛等优点，可用于水环境中复杂样品的实时和快速测量，也可用于微/痕 量汞离子浓度的半定量检测。

附图说明

图1是罗丹明B-噻吩衍生物的化学结构式（a）及其与Hg²⁺的结合原理示意图（b）。

图2是罗丹明B-噻吩衍生物的核磁氢图谱。

图3是基于罗丹明B-噻吩衍生物的快速响应性Hg²⁺显色-荧光探针在加入不同重金 属离子后的颜色变化情况（从左至右：Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Fe³⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Cr³⁺，Hg²⁺）。

图4是基于罗丹明B-噻吩衍生物的快速响应性Hg²⁺显色-荧光探针在加入Hg²⁺后不 同时间的紫外-可见光吸收谱图（溶剂：水-乙醇，3:1，v/v）。

图5是基于罗丹明B-噻吩衍生物的快速响应性Hg²⁺显色-荧光探针中加入不同浓度 Hg²⁺后的紫外-可见光吸收谱图（溶剂：水-乙醇，3:1，v/v）。

图6是基于罗丹明B-噻吩衍生物的快速响应性Hg²⁺显色-荧光探针在加入不同金属 离子（Hg²⁺,Na⁺,Fe³⁺,Pb²⁺,Zn²⁺,Mg²⁺,Fe²⁺,Cr³⁺等）后的荧光光谱谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明 本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做 进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

下面结合实施例详细说明本发明，应当理解，此处所描述的举例仅仅用以解释本 发明，并不用于限定本发明。

实施例1

称取3g罗丹明B和60mL乙醇加入到250mL三口瓶中，充分搅拌使罗丹明B完全溶解， 逐滴滴加3.00mL二乙烯三胺，滴加完毕80℃回流反应10小时，反应过程通氮气，反应结束 后将反应瓶冷却至室温，抽滤，旋蒸除去乙醇，所得淡棕色固体用100mL二氯甲烷萃取3次， 合并有机相，用水洗4次，用无水硫酸钠干燥2小时，过滤，收集滤液，旋蒸得橘黄色固体，再 过柱层析分离（展开剂为甲醇：二氯甲烷=1：5，v/v），得到罗丹明B-二乙烯三胺衍生物，产率 为93.2%。

称取2.0g上述罗丹明B-二乙烯三胺衍生物和50mL无水乙醇加入到250mL反应 容器中，充分搅拌使完全溶解，再将0.5g2-噻吩甲醛溶解在10mL无水乙醇中，使用恒压 滴液漏斗逐滴加入250mL反应容器中，在氮气保护下于80℃反应6h，反应结束后旋蒸出无 水乙醇，用30ml二氯甲烷萃取3次，合并有机相，再用水洗3次，得有机相，用无水硫酸钠干 燥5小时，旋蒸出二氯甲烷，再过柱层析分离（展开剂为甲醇：二氯甲烷=1：10，v/v）得浅黄色 固体，即为罗丹明B-噻吩衍生物，产率84%。

称取0.01g上述罗丹明B-噻吩衍生物，溶于500g水和乙醇的混合溶液（水：乙醇 =5：1，体积比）中，得到一种基于罗丹明B-噻吩衍生物的快速响应性Hg²⁺显色-荧光探针。

该罗丹明B-噻吩衍生物的化学结构式如图1所示，图2是罗丹明B-噻吩衍生物的核 磁氢图谱，图3是基于罗丹明B-噻吩衍生物的快速响应性Hg²⁺显色-荧光探针在加入不同重 金属离子后的颜色变化情况（从左至右：Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Fe³⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Cr³⁺，Hg²⁺），图4是基于 罗丹明B-噻吩衍生物的快速响应性Hg²⁺显色-荧光探针在加入Hg²⁺后不同时间的紫外-可见 光吸收谱图（溶剂：水-乙醇，3:1，v/v），图5是基于罗丹明B-噻吩衍生物的快速响应性Hg²⁺显 色-荧光探针中加入不同浓度Hg²⁺后的紫外-可见光吸收谱图（溶剂：水-乙醇，3:1，v/v），图6 是基于罗丹明B-噻吩衍生物的快速响应性Hg²⁺显色-荧光探针在加入不同金属离子（Na⁺，K ⁺，Mg²⁺，Fe³⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Cr³⁺，Hg²⁺）后的荧光光谱谱图。

实施例2：与实施例1相同，但是步骤(3)中水与乙醇的体积比变为4:1。

实施例3：与实施例1相同，但是步骤(3)中水与乙醇的体积比变为6:1。

实施例4：与实施例1相同，但是步骤(3)中水与乙醇的体积比变为3:1。

实施例5：与实施例1相同，但是步骤(3)中水与乙醇的体积比变为2:1。

实施例6：与实施例1相同，但是步骤(3)中水与乙醇的体积比变为1:1。

实施例7：与实施例1相同，但是步骤(3)中乙醇变为甲醇，其他不变。

实施例8：与实施例1相同，但是步骤(3)中乙醇变为异丙醇，其他不变。

实施例2-8中获得的罗丹明B-噻吩衍生物与Hg²⁺存在特殊的结合作用，而与其它常 见金属离子（Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Fe³⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Cr³⁺）则不具有这种作用。在该罗丹明B-噻吩衍生 物的水-乙醇混合溶液中加入Hg²⁺后，溶液颜色由无色变为红色，紫外-可见光吸收光谱中在 560nm处对应出现吸收峰，表明它是一种高效的Hg²⁺显色-荧光探针。该基于罗丹明B-噻吩 衍生物的Hg²⁺显色-荧光探针对汞离子浓度的最低检测限为2.0×10^-7mol/L，适用pH范围为 酸性到中性。该基于罗丹明B-噻吩衍生物的Hg²⁺探针显色-荧光响应时间小于2分钟，紫外- 可见光吸收特征峰的强度和荧光强度随着Hg²⁺浓度的升高而增强，在低浓度下依然符合线 性关系，可用于微/痕量汞离子浓度的半定量检测。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是 能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精 神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。