以决明子乳酸菌发酵物为有效成份的便秘改善、治疗或预防用组合物及其制造方法

摘要

本发明涉及以决明子乳酸菌发酵物为有效成份的便秘改善、治疗或预防用组合物及其制造方法。本发明的决明子乳酸菌发酵物长期使用、安全性高、作为生药的副作用发生可能性小，显示出与因副作用问题而禁止用于保健功能食品的作为刺激性便秘治疗剂的番泻苷或以比沙可啶及多库酯钠为有效成份的商用化的乐可舒-S(Dulcolax-S)相同的使粪便个数、粪便水分含量及粪便重量中的任一种以上增加的效果，因而能够用作便秘治疗或预防用药物组合物、或者便秘改善或预防用保健功能食品。另外，本发明的高加索酸奶乳杆菌(Lactobacilluskefiri)MJ90菌株有利于制造增进便秘治疗、改善或预防活性的决明子乳酸菌发酵物。

说明书

技术领域

本发明涉及以决明子乳酸菌发酵物为有效成份的便秘改善或预防 用保健功能食品、便秘治疗或预防用药物组合物、以及使粪便的水分含 量和重量增加的决明子乳酸菌发酵物的制造方法。另外，本发明涉及所 述决明子乳酸菌发酵物的制造方法及用于其的菌株。

背景技术

就便秘(Constipation)而言，医学上将一周排便3次以下或一天排便 量为30g以下时定义为便秘。在正常状态下，摄取食物后24小时形成 粪便并排泄，但有便秘的人，几天排一次或即使每天排便，但其量少， 结果摄取的食物的肠内滞留时间变长。

作为便秘的原因，有忽略早餐导致大肠蠕动运动低下、膳食的西欧 化导致膳食纤维不足、运动不足导致基础体力及腹肌力量低下、节食、 服用过多药物导致药物中毒等多种。

自古以来，便秘便被称为万病之源，不仅没有食欲，经常处于腹部 胀满的状态，而且未排泄的粪便的毒素通过肠被吸收入血液，从而促使 皮肤老化，出现头痛或粉刺、皮肤斑疹等，如果便秘严重，则成为排便 时肛裂破损与痔核脱出等痔疮的原因，受便中毒素的影响，甚至发生大 肠癌。另外，如果便秘持续，则本应排出到体外的胆固醇或脂肪滞留于 体内，会诱发动脉硬化或胆结石症，进一步而言，会引起高血压和心脏 肥大，恶化成心脏病。此外，会成为中风、免疫缺乏、视力障碍、精神 疾病(忧郁症)等多种严重的2次疾病的原因，便秘是需要积极预防与治 疗的重要疾病。

因此，迄今有用于治疗或改善便秘的多种药品和保健功能食品正在 销售，但就药品而言，大部分使用番泻叶、大黄等含有蒽醌衍生物成份 的刺激性药剂，因而存在腹痛、腹泻等副作用，而且，在妊娠中服用或 持续服用方面存在问题，就保健功能食品而言，大部分其效果无法从科 学上充分验证，无法解决便秘改善的根本问题，制品的可靠性低。

决明子是属于豆科的一年生草本，已知草决明(CassiaobtusifoliaL.) 和小决明(CassiatoraL.)两个品种。决明子还称为草决明、马蹄决明。 草决明原产中美洲，在日本等地，决明子为亚热带出产，在中国、韩国 等栽培。

果实形状为不规则六角柱状，一端尖锐。外面颜色为黄褐色至黑褐 色，长3～6mm，直径2～3.5mm。种皮坚固有光泽，左右两侧有一条 有光泽的宽度较窄的凹陷纹理，略带特殊气味。C.obtusifolia种子为大 粒，C.tora为小粒。

决明子在韩医中已知利用清热明目作用来治疗急性结膜炎，眼球出 血，感到异物或痛症并流眼泪的情形，老人眼睛发生的角膜混浊现象， 即慢性进行性疾病，视神经、网膜萎缩导致的视力急剧减退，肥胖、血 压高、精神压力导致的头痛、耳鸣，眼部肿瘤；利用降压作用治疗高血 压症，由于冠状动脉扩张而减小血流阻抗来降低血压，治疗中风导致的 半身不遂，有轻微腹泻作用，治疗慢性疾病；利用降低胆固醇作用治疗 心血管疾病，即，治疗胆固醇值超过正常范围的情形或冠状动脉硬化导 致的心绞痛；就便秘治疗而言，是治疗老年性便秘症、老年性高血压症、 津液不足导致的口干、便秘迹象导致的腹部胀满感、习惯性便秘等。

在韩国公开专利第1999-0084271号中说明了混合决明子或决明子 叶与其它生药，经单纯粉碎及焙煎而制造的袋装茶对便秘改善有效，韩 国公开专利第2003-0062493号中说明了先对决明子进行提取、浓缩后 喷雾干燥，将制造的决明子提取物粉末与鼠李皮提取粉末等混合而制造 的混合浸出茶，口感优秀，有便秘症状改善效果，所述专利只不过是单 纯粉碎决明子并焙煎，或进行提取及浓缩并干燥，或将其与其它有便秘 改善效果的生药混合而已。

但是，本发明的发明人获知利用乳酸菌使传统上长期使用并已验证 其安全性的作为生药的决明子发酵而获得的决明子乳酸菌发酵物，与决 明子提取物相比，增加粪便个数、粪便水分含量或粪便重量，从而改善 或治疗便秘的效果显著增进，因而完成了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用长期使用、安全性高、作为生药的副 作用发生可能性小的决明子而使粪便水分含量及重量增加的效果得到 显著增进的便秘改善或预防用保健功能食品。

本发明的又一目的是提供一种利用决明子而使粪便水分含量及重 量增加的效果得到显著增进的便秘治疗或预防用药物组合物。

本发明的另一目的是提供一种具有便秘改善或预防活性的决明子 乳酸菌发酵物的制造方法。

本发明的目的是提供一种能够增进决明子的便秘改善或预防活性 的新菌株。

本发明提供一种以决明子乳酸菌发酵物为有效成份的便秘改善或 预防用保健功能食品。

所述决明子提取物可以为水、碳原子数为1～4的醇或它们的混合 溶剂的提取物。

所述保健功能食品可以为胶囊、锭剂、粉末、颗粒、液态、丸、片 状、糊状、糖浆、凝胶、胶冻或条(bar)形态的制剂。

另外，本发明提供一种以决明子乳酸菌发酵物为有效成份的便秘治 疗或预防用药物组合物。

所述决明子提取物可以为水、碳原子数为1～4的醇或它们的混合 溶剂的提取物。

另外，本发明提供一种使粪便个数、粪便水分含量及粪便重量中的 任一者以上增加的决明子乳酸菌发酵物的制造方法，其中，包括：制造 决明子提取物的步骤；以及将乳酸菌接种于所述决明子提取物而进行发 酵的步骤。

所述乳酸菌可以为选自乳杆菌属、双歧杆菌属、明串珠菌属、片球 菌属、肠球菌属乳酸菌中的任一种以上的乳酸菌。

所述乳酸菌可以为高加索酸奶乳杆菌MJ90(Lactobacilluskefiri MJ90)[保藏编号：KCCM11575P]。

所述决明子乳酸菌发酵物的制造方法可以包括：以水、碳原子数为 1～4的醇或它们的混合溶剂提取决明子或其粉碎物的步骤；以及将高加 索酸奶乳杆菌MJ90(LactobacilluskefiriMJ90)[保藏编号： KCCM11575P]接种于上述步骤的决明子提取物，使得达到1×10³～ 1×10⁶CFU/ml，在30～45℃下发酵1～7天时间的步骤。

所述提取的步骤可以是相对于决明子粉碎物1重量份，混合10～50 重量份的水后，在静置或搅拌的同时提取0.5～24小时。

所述提取的步骤可以是相对于决明子或其粉碎物1重量份，混合 20～80重量％的乙醇水溶液5～30重量份，提取0.5～24小时后，对所 述提取液进行干燥而去除乙醇。

可以在所述发酵的步骤的决明子提取物中还添加乳酸菌营养源。

本发明提供一种使决明子发酵而增进便秘改善或预防活性的高加 索酸奶乳杆菌MJ90(LactobacilluskefiriMJ90)[保藏编号： KCCM11575P]。

本发明的决明子乳酸菌发酵物长期使用、安全性高、作为生药的副 作用发生可能性小，显示出与因副作用问题而禁止用于保健功能食品的 作为刺激性便秘治疗剂的番泻苷或以比沙可啶及多库酯钠为有效成份 的商用化的乐可舒-S(Dulcolax-S)相同的使粪便个数、粪便水分含量及粪 便重量中的任一种以上增加的效果，因而能够用作便秘治疗或预防用药 物组合物、或者便秘改善或预防用保健功能食品。另外，本发明的高加 索酸奶乳杆菌MJ90(LactobacilluskefiriMJ90)菌株有利于制造增进便 秘治疗、改善或预防活性的决明子乳酸菌发酵物。

附图说明

图1是分别以不同发酵菌使实验例1中不同溶剂的决明子提取物发 酵时，通过在发酵时间36小时及72小时测量的pH的变化，确认乳酸 菌发酵的进行的图表，图1a是使制造例1的提取物发酵，图1b是使制 造例2的提取物发酵，图1c是使制造例3的稀释液发酵。

图2是表示实验例2的C中各实验组的粪便个数的图表。

图3是表示实验例2的C中各实验组的粪便重量的图表。

图4是表示实验例3的C中各实验组的粪便个数的图表。

图5是表示实验例3的C中各实验组的粪便重量的图表。

图6是实验例3的D中各实验组的实验动物处死后，摘取大肠并水 洗后的照片，各个大肠照片下方标记的点代表洋红(Carmine)移动的 距离。

图7是表示图6的洋红移动距离的图表。

图8a表示实验例4中制造例2的决明子乙醇水溶液提取物的 HPLC-IT/TOPMS图谱，图8b表示实验例4中制造例4的决明子乳酸 菌发酵物的HPLC-IT/TOPMS图谱。

图9是实验例9中分离及鉴定的高加索酸奶乳杆菌 MJ90(LactobacilluskefiriMJ90)菌株的系统图。

保藏信息

高加索酸奶乳杆菌MJ90(LactobacilluskefiriMJ90)

保藏单位：韩国微生物保藏中心(KCCM)(国外)(地址：韩国首尔 西大门区弘济内2街吉45，儒林大厦，邮编：120-861)

保藏编号：KCCM11575P

保藏日期：20141001

具体实施方式

本发明涉及以决明子乳酸菌发酵物为有效成份的便秘改善或预防 用保健功能食品，另外，本发明涉及以决明子乳酸菌发酵物为有效成份 的便秘治疗或预防用药物组合物，另外，本发明涉及一种使粪便个数、 粪便水分含量及粪便重量中的任一者以上增加的决明子乳酸菌发酵物 的制造方法，包括：制造决明子提取物的步骤；以及将乳酸菌接种于所 述决明子提取物而进行发酵的步骤。

所述决明子为草决明(CassiaobtusifoliaL.)或小决明(Cassiatora L.)，优选为在韩国栽培的小决明(CassiatoraL.)。

所述提取物不仅包括对提取原材料用提取溶剂处理而获得的粗提 取物，还包括粗提取物的加工物。例如，决明子提取物可以通过减压蒸 馏及冷冻干燥或喷雾干燥等追加性过程而制造成粉末状态。所述提取物 还包括对所述粗提取物进一步进行分馏(fractionation)的分馏物。

用于制造所述决明子乳酸菌发酵物的乳酸菌可以为选自乳杆菌属、 双歧杆菌属、明串珠菌属、片球菌属、肠球菌属乳酸菌中的任一种以上 的乳酸菌。例如，所述乳酸菌可以为副干酪乳杆菌、高加索酸奶乳杆菌、 嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、肠膜明串珠菌、戊糖片球菌、 粪肠球菌。优选为乳杆菌属乳酸菌，更优选为高加索酸奶乳杆菌或嗜酸 乳杆菌，最优选为本发明的发明人新分离并鉴定的高加索酸奶乳杆菌 MJ90(LactobacilluskefiriMJ90)。

所述决明子乳酸菌发酵物的制造方法可以包括：以水、碳原子数为 1～4的醇或它们的混合溶剂提取决明子或其粉碎物的步骤；以及将乳酸 菌接种于所述步骤的决明子提取物，使得达到1×10³～1×10⁶CFU/ml， 在30～45℃下发酵1～7天时间的步骤。所述决明子乳酸菌发酵物可以 是将乳酸菌接种于决明子提取物进行发酵而获得的。

当使用水作为所述提取的步骤的溶剂时，可以相对于决明子粉碎物 1重量份，稀释冷水或室温的水10～50重量份，在混合的稀释液中提取 决明子的成份。当利用冷水或室温的水提取决明子成份时，既可以独立 于发酵进行提取，也可以在接种乳酸菌并发酵的过程中，使得决明子的 成份从决明子溶出。因此，在本发明中，决明子提取物从广义上来说包 括将决明子粉末稀释于水中而得到的稀释液。在本发明的实验例中，与 使决明子热水提取物或决明子乙醇水溶液提取物进行乳酸菌发酵的乳 酸菌发酵物相比，以乳酸菌使决明子水稀释液发酵的乳酸菌发酵物的便 秘改善、治疗或预防效果稍低，但与不进行乳酸菌发酵的决明子提取物 相比，可以确认其效果显著增大。

当使用水作为所述溶剂时，为了增进提取效率，可以利用热水提取。 例如，相对于决明子或其粉碎物1重量份，可以混合80～105℃，优选 为90～100℃的水10～50重量份后，在静置或搅拌的同时，提取0.5～ 24小时，优选提取1～6小时。

作为所述提取的步骤的溶剂，可以将碳原子数为1～4的醇或该醇 的水溶液相对于决明子或其粉碎物1重量份来混合5～30重量份，用于 提取0.5～24小时。例如，以乙醇、甲醇、异丙醇等的醇水溶液提取， 优选以20～80重量％的醇水溶液提取，更优选以50～70重量％的醇水 溶液提取。使用醇提取物时，在接种乳酸菌之前，首先使醇提取物的醇 气化，使降低了醇含量的浓缩液或醇提取物浓缩及干燥后，溶解于水中 后使用。

在将乳酸菌接种于所述决明子提取物之前，为了增进乳酸菌繁育， 可以进一步混合蛋白质源、碳水化合物源、维生素或无机质等乳酸菌营 养源。所述乳酸菌营养源可以利用市销的培养基或只个别地添加必要的 营养源。

另外，所述决明子提取物、或决明子提取物与乳酸菌营养源的混合 物可以在接种乳酸菌之前进行加热杀菌。

所述决明子提取物的固体成份含量没有特殊限定的必要，但提取后 没有其它浓缩过程时，为1～15重量％，既可以直接使用，也可以浓缩 使用，还可以浓缩或干燥后稀释使用。

可以在利用所述本发明的高加索酸奶乳杆菌MJ90(Lactobacillus kefiriMJ90)菌株进行发酵的步骤或其之后，为了便秘改善或预防所需的 整肠作用而辅助地添加另外的乳酸菌。

所述乳酸菌可以为选自乳杆菌属、双歧杆菌属、明串珠菌属、片球 菌属、肠球菌属乳酸菌中的任一种以上的乳酸菌。

所述发酵的步骤的条件与普通的乳酸菌发酵相同，没有特殊限定的 必要，但可以在25～40℃下执行24～96小时。

所述决明子乳酸菌发酵物可以是包含乳酸菌菌体的发酵物，也可以 是去除乳酸菌菌体的发酵物。去除乳酸菌菌体的发酵物既可以对发酵物 进行灭菌而包括死菌体，也可以是通过过滤或离心分离而去除菌体的滤 液或离心分离上清液。

本发明的便秘改善、治疗或预防效果预计是因为在乳酸菌增殖的同 时，使决明子提取物中包含的成份生物转化成容易在生物体内利用的成 份，或生成了具有便秘改善、治疗或预防效果的新型活性成份，因而与 单纯附加乳酸菌自身而能获得的效果相比，效果显著上升。所述决明子 乳酸菌发酵物既可以直接使用液态的发酵物本身，也可以对其进行干燥 并粉末化。

可以以所述制造的决明子乳酸菌发酵物为有效成份，制造便秘改善 或预防用保健功能食品或者便秘治疗或预防用药物组合物。

所述“作为有效成份包含”意味着包含达成所述决明子乳酸菌发酵 物的便秘改善、治疗或预防效能或活性所需的充足的量。

所述保健功能食品意味着可以是将所述决明子乳酸菌发酵物制成 胶囊、锭剂、粉末、颗粒、液态、丸、片状、糊状、糖浆、凝胶、胶冻 或条(bar)形态，或者添加于饮料、茶类、调料、口香糖、点心等的食品 原料而制造成普通食品形态，当摄取其时，具有健康上的特定效果，但 与普通药品不同，以食品为原料，优点是没有长期服用药品时可能发生 的副作用等。

所述保健功能食品能够日常摄取，因而非常有用。在这种保健功能 食品中的决明子乳酸菌发酵物的添加量，因作为对象的保健功能食品的 种类而异，无法一律地规定，但只要在不损害食品本来口味的范围内添 加即可，相对于对象食品，通常添加0.01～50重量％，优选地为0.1～ 20重量％的范围。另外，当为胶囊、锭剂、粉末、颗粒、液态、丸、片 状、糊状、糖浆、凝胶、胶冻或条(bar)形态的保健功能食品时，通常在 0.1～100重量％的范围内，优选在0.5～80重量％的范围内添加即可。

所述保健功能食品不仅包含决明子乳酸菌发酵物作为有效成份，还 可以包含在食品制造时通常添加的成份，例如，包含蛋白质、碳水化合 物、脂肪、营养素、调味剂及香味剂。所述碳水化合物的示例为：单糖， 例如葡萄糖、果糖等；双糖，例如麦芽糖、蔗糖、低聚糖等；以及多糖， 例如糊精、环糊精等通常的糖及木糖醇、山梨醇、赤藓糖醇等糖醇。作 为香味剂，可以使用天然香味剂[索马甜、甜菊叶提取物(例如莱苞迪苷 A、甘草甜素等])及合成香味剂(糖精、阿斯巴甜等)。 例如，在本发明的保健功能食品制造成饮剂和饮料类的情 况下，除本发明的决明子发酵物之外，可以进一步包含柠檬酸、液态 果糖、砂糖、葡萄糖、醋酸、苹果酸、果汁及各种植物提取液等。

另外，在以决明子乳酸菌发酵物为有效成份的便秘治疗或预防用药 物组合物中，决明子乳酸菌发酵物例如包含0.001mg/kg以上，优选 0.1mg/kg以下，更优选10mg/kg以上，进一步优选100mg/kg以上，更 进一步优选250mg/kg以上，最优选0.1g/kg以上。决明子乳酸菌发酵物 作为天然物，即使过量投入也对人体无副作用，因此，在本发明的组合 物内包含的决明子乳酸菌发酵物的量的上限，可以由所属领域的技术人 员在适宜范围内选择并实施。

所述药物组合物除所述有效成份之外，可以使用在药剂学上适合、 在生理学上被允许的辅助剂进行制造，作为所述辅助剂，可以使用赋形 剂、崩解剂、甜味剂、结合剂、被覆剂、膨胀剂、润滑剂、增滑剂或香 味剂等。

所述药物组合物为了给药，除所述记载的有效成份之外，可以进一 步包含1种以上的药剂学上可允许的载体而进行制剂。

所述药物组合物的制剂形态可以为颗粒剂、散剂、锭剂、被覆锭剂、 胶囊剂、栓剂、液剂、糖浆、汁、混悬剂、乳剂、点滴剂或可注射的液 剂等。例如，为了制成锭剂或胶囊剂的形态，有效成份可以与诸如乙醇、 甘油、水等的口服、无毒性的药剂学上可允许的非活性载体结合。另外， 在希望或需要的情况下，还可以包含适合的结合剂、润滑剂、崩解剂及 发色剂以及它们的混合物。适合的结合剂并非限定于此，但包括淀粉、 明胶、葡萄糖或β乳糖之类的天然糖、玉米甜味剂、阿拉伯胶、黄蓍胶 或油酸钠之类的天然及合成胶、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸 钠、氯化钠等。崩解剂并非限定于此，但包括淀粉、甲基纤维素、琼脂、 膨润土、黄原胶等。

就制成液态溶液的组合物而言，作为可允许的药物载体，适合灭菌 及生物体者，可以混合食盐水、灭菌水、林格氏液、缓冲食盐水、白蛋 白注射溶液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇及这些成份中 的1种以上成份而使用，根据需要，可以添加抗氧化剂、缓冲液、抑菌 剂等其它通常的添加剂。另外，可以附加地添加稀释剂、分散剂、表面 活性剂、结合剂及润滑剂，制成水溶液、混悬液、乳浊液等注射用剂型、 丸药、胶囊、颗粒或锭剂。

进一步而言，作为相应领域的适当方法，可以利用在雷明顿医药科 学，马克出版公司，宾夕法尼亚州伊士顿(Remington'sPharmaceutical Science,MackPublishingCompany,EastonPA)中公开的方法，根据各 疾病或成份良好地进行制剂。

所述药物组合物可以口服或非口服给药，在非口服给药的情况下， 可以通过静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注入、经皮给药等进行 给药，优选口服给药。

所述药物组合物的适合的给药量因制剂化方法、给药方式、患者的 年龄、体重、性别、疾病状态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度 及反应敏感性之类的因素而多种多样，一般而言，熟练的医师可以容易 地决定对所希望的治疗或预防有效的给药量并进行处方。根据优选的实 施方式，所述药物组合物的1日给药量为0.001～10g/㎏。

所述药物组合物可以根据本发明所属技术领域的技术人员能够容 易地实施的方法，利用在药学上可允许的载体和/或赋形剂进行制剂， 从而制造成单位容量形态或置于大容量容器内而制造。此时，剂型可以 是油或水性介质中的溶液、混悬液或乳液形态，或提取剂、粉剂、颗粒 剂、锭剂或胶囊剂形态，可以进一步包括分散剂或稳定剂。

下面参照下述实施例，更具体地说明本发明。不过，下述实施例只 用于帮助本发明的理解，本发明的范围并非限定于下述实施例。

制造例1：决明子热水提取物的制造

决明子精选从全南生药农业协同组合(和顺郡)购入的韩国产小决明 (CassiatoraL.)，水洗后利用粉碎机均匀粉碎，制造平均粒子直径300μm 的决明子粉末，冷藏保管并使用。

将所述粉碎的决明子重量10倍的蒸馏水加入回流提取器，在100 ℃下、3小时期间提取2次后冷却，过滤后利用减压浓缩机浓缩，进行 冷冻干燥，获得了决明子热水提取物粉末。收率为2.2％。

制造例2：决明子乙醇水溶液提取物的制造

添加所述制造例1的粉碎的决明子重量4倍的50重量％酒精(乙 醇水溶液)，在室温下提取3日，过滤后利用减压浓缩机浓缩，进行冷 冻干燥，获得了决明子乙醇水溶液提取物粉末。收率为9.8％。

制造例3：决明子水稀释液的制造

将所述制造例1的粉碎的决明子与水混合，使得决明子达到7重量 ％，制造了决明子水稀释液。

制造例4：决明子发酵物的制造

针对将所述制造例1或2的决明子提取物粉末在蒸馏水中稀释成5 重量％的决明子提取物、或者制造例3的决明子水稀释液，在121℃、 1.5气压下灭菌15分钟后，将表1的乳酸菌分别利用MRS肉汤(broth) 和GAM肉汤(broth)，在37℃下静置培养24小时，使其活化后，将 乳酸菌培养液5重量％(1×10⁷CFU/ml)分别接种于所述决明子提取物， 在37℃下，以150rpm搅拌72小时进行培养，获得了培养液。

就酵母的情形而言，将预先活化了面包常用酵母(Saccharomyces cerevisiae，酿酒酵母)的酵母培养液5重量％(1×10⁷CFU/ml)接种于制造 例2的决明子提取物(固体成份5重量％)，在30℃下，以150rpm搅拌 72小时进行培养，获得了培养液。

将所述培养液在4℃下，在6000rpm下离心分离15分钟，对去除 了菌体的上清液进行浓缩及冷冻干燥，制造了决明子发酵物粉末。

【表1】

实验例1：决明子发酵物的发酵特性的确认

为确认制造例4的决明子乳酸菌发酵物或决明子酵母发酵物的发酵 特性，接种后第36及72小时确认了发酵物的pH及活菌数的变化。

活菌数是将试样1ml在灭菌生理食盐水9ml中稀释，充分混合后分 阶段稀释，然后取0.1ml，乳杆菌属、片球菌属涂抹于MRS琼脂，双 歧杆菌属涂抹于含有5％的马血(horseblood)的BL琼脂，利用厌氧 罐(anaerobicjar)(BBLGasPakAnaerobicSystem)，最大限度以厌氧 状态保管，在37℃下培养24～48小时后，计量生成的集落数，酵母属 涂抹于YM琼脂，在25℃下培养48小时后，计量生成的集落数，其平 均集落数乘以稀释倍数，算出各培养液的集落(colony)。

A.pH变化

在图1a、图1b及图1c中表示根据发酵菌的种类及培养时间的pH 变化。图1a是使制造例1的提取物发酵，图1b是使制造例2的提取物 发酵，图1c是使制造例3的稀释液发酵。

初始pH为6.4，第36小时减少为5.2～5.8，第72小时减少为4.9～ 5.5。

如果按发酵菌比较pH的变化，则高加索酸奶乳杆菌MJ90(L1)及副 干酪乳杆菌(L2)以比嗜酸乳杆菌128(L3)、植物乳杆菌144(L4)、长双歧 杆菌(B1)、戊糖片球菌(P1)相对较大的幅度减少。另外，酿酒酵母(S1) 在制造例1的提取物和制造例3的稀释液中，pH减少为L2与L3的中 间程度，在制造例2的提取物中，pH减少为与L3类似的水平。

在发酵菌相同的情况下，使用制造例1的决明子热水提取物、制造 例2的决明子乙醇提取物、制造例3的决明子水稀释液作为基质的培养 液的pH几乎无差异，制造例3的情形与其余者相比，第36小时及第 72小时的pH稍高。

B.活菌数变化

再次预培养发酵菌6种，为了了解菌株的生长性能，在固体成份含 量为6重量％的决明子提取物中分别接种乳酸菌各1重量％，在37℃下 发酵24小时，酵母菌接种1重量％，在25℃下发酵24小时后，测量活 菌数，将其结果显示于表2中。

【表2】

如上述表2所示，使用制造例1的决明子热水提取物作为基质与使 用制造例2的乙醇水溶液提取物作为基质，几乎没有差异，但在使用制 造例3的决明子水稀释液作为基质时，发酵后活菌数为不及制造例1和 2的活菌数一半的水平。

可以确认，使用高加索酸奶乳杆菌MJ90(L1)菌株制造的培养液的 活菌数比使用副干酪乳杆菌(L2)菌株制造的培养液的活菌数多3倍左 右，比使用酿酒酵母(S1)菌株制造的培养液的活菌数多5倍左右。

使用嗜酸乳杆菌128(L3)菌株及植物乳杆菌144(L4)菌株制造的培养 液的活菌数为L1菌株的1/10水平，使用长双歧杆菌(B1)菌株及戊糖片 球菌(P1)菌株制造的培养液的活菌数为L1菌株的1/100水平。

因此，在pH减少与活菌数增加方面，作为发酵特性优秀的乳酸菌， 选择高加索酸奶乳杆菌MJ90(L1)菌株及副干酪乳杆菌(L2)菌株以及属 于酵母的酿酒酵母(S1)菌株，作为发酵特性相对较低的比较组，选择嗜 酸乳杆菌128(L3)菌株及长双歧杆菌(B1)菌株，通过动物实验，确认了 便秘改善或预防效果是否比决明子提取物得到增进。

实验例2：通过不同发酵菌种类的动物实验确认便秘预防效果

A.实验动物及实验组

实验动物从DamoolScience(大田)购入4周龄雄性SD(Sprague Dawley)大鼠使用，在温度20±2℃、湿度55±5％、12小时明暗条件下 饲养。实验动物在购入后适应1周时间，之后每组配置5只，如表3所 示设定了实验组。

【表3】

除正常对照组(NOR)及阴性对照组(LOP)之外的所有实验组在洛哌 丁胺给药前，分别在5天期间口服给药阳性对照组药物或制造例4的发 酵物。

除正常对照组(NOR)以外的阴性对照组(LOP)及除阳性对照组 (CON1,CON2)之外的所有实验组，在5天期间皮下给药洛哌丁胺而诱 发了便秘，从洛哌丁胺给药开始日起第6日处死实验动物。

B.体重、饲料摄取量及饮水量

对所有实验组确认从洛哌丁胺给药开始日至实验动物处死时为止 的实验动物体重变化量(g)、饲料摄取量(g)及饮水量(mL)的结果，实验 期间在饲料摄取量及饮水量方面没有显著差异，在体重增加量方面未显 示出显著差异。

C.粪便个数

各实验组的粪便个数结果显示于图2中。

在粪便个数方面，正常对照组(NOR)为47.2±5.8个，与之相比，洛 哌丁胺给药阴性对照组(LOP)减少为23.1±3.6个，确认洛哌丁胺诱发了 便秘，可以确认，番泻苷(CON1)比乐可舒-S(Dulcolax-S)(CON2)的粪便 个数增加效果优异。

将制造例2的决明子乙醇水溶液提取物以200mg/kg给药的2-200 实验组，几乎未出现显著的粪便个数增加效果，与2-200实验组相同地 以200mg/kg给药的2-L1-200、2-L2-200实验组，显示出与番泻苷(CON1) 同等的粪便个数增加效果。

在增加给药量而以500mg/kg给药的情况下，将制造例2的决明子 乙醇水溶液提取物以500mg/kg给药的2-500实验组，依然未出现显著 的粪便个数增加效果，但在200mg/kg给药组中未曾出现粪便个数显著 增加的2-L3-500、2-B1-500实验组，粪便个数显著增加。不过，2-S1-500 实验组在500mg/kg给药时，粪便个数也没有增加。

综合所述结果，在粪便个数方面，高加索酸奶乳杆菌MJ90(L1)菌 株及副干酪乳杆菌(L2)菌株的发酵物具有与番泻苷(CON1)和乐可舒 -S(Dulcolax-S)(CON2)同等或其以上的粪便个数增加效果，嗜酸乳杆菌 128(L3)菌株及长双歧杆菌(B1)菌株的发酵物只在500mg/kg给药组中显 示出粪便个数增加效果，属于酵母的酿酒酵母(S1)菌株即使发酵，也没 有粪便个数增加效果。

因此，虽然乳酸菌存在有效含量的差异，但使决明子提取物发酵， 从而使粪便个数增加，其中，高加索酸奶乳杆菌MJ90(L1)菌株在 500mg/kg给药组中显示出与正常对照组(NOR)同等水平的粪便个数，粪 便个数增加效果最好。

D.粪便重量

各实验组的粪便重量结果显示于图3中。

粪便重量方面，正常对照组(NOR)为4.8±0.89个，与之相比，洛哌 丁胺给药阴性对照组(LOP)减少为2.6±0.32个，确认洛哌丁胺诱发了便 秘，在番泻苷(CON1)与乐可舒-S(Dulcolax-S)(CON2)的粪便重量方面没 有显著的差异。

将制造例2的决明子乙醇水溶液提取物以200mg/kg给药的2-200 实验组比番泻苷(CON1)弱，但与阴性对照组(LOP)相比，使粪便重量显 著增加。与2-200实验组相同地给药200mg/kg的2-L1-200、2-L2-200 实验组，显示出与番泻苷(CON1)同等而比乐可舒-S(Dulcolax-S)(CON2) 优异的粪便重量增加效果。

在增加给药量而以500mg/kg给药的情况下，将制造例2的决明子 乙醇水溶液提取物以500mg/kg给药的2-500实验组显示出与2-200实 验组类似的粪便重量，给药量增加带来的粪便重量增加效果不突出，但 在200mg/kg给药组中曾未出现粪便重量显著增加的2-L3-500、2-B1-500 实验组的粪便重量显著增加。不过，2-S1-500实验组在500mg/kg给药 下，也没有粪便重量增加。

综合所述结果，在粪便重量增加效果方面，高加索酸奶乳杆菌 MJ90(L1)菌株的发酵物优于番泻苷(CON1)，副干酪乳杆菌(L2)菌株的 发酵物具有与番泻苷(CON1)及乐可舒-S(Dulcolax-S)(CON2)同等或其 以上的粪便重量效果，嗜酸乳杆菌128(L3)菌株及长双歧杆菌(B1)菌株 的发酵物低于番泻苷(CON1)及乐可舒-S(Dulcolax-S)(CON2)，但只在 500mg/kg给药组中出现粪便重量增加效果，属于酵母的酿酒酵母(S1) 菌株即使发酵，也没有粪便重量增加效果。

实验例3：通过不同提取物种类的动物实验确认便秘改善及预防效 果

A.实验动物及实验组

实验动物与实验例2相同地准备，实验动物购入后适应1周时间， 之后每组配置5只，如表4所示设定实验组。

【表4】

1-L1-100及1-L1-200是将决明子水提取物的发酵物进行给药， 3-L1-100及3-L1-200是将决明子水稀释液的发酵物进行给药， 2-L1-200(P)进行洛哌丁胺预处理，诱发便秘后，用于确认便秘治疗效果。

除正常对照组(NOR)、阴性对照组(LOP)及2-L1-200(P)之外的各实 验组，在洛哌丁胺给药之前，将各自的阳性对照组药物或制造例4的发 酵物进行5天的口服给药。

除正常对照组(NOR)以外的阴性对照组(LOP)、除阳性对照组 (CON1,CON2)及2-L1-200(P)以外的所有实验组，在5天期间皮下给药 洛哌丁胺而诱发便秘后，自洛哌丁胺给药开始日起第6天处死实验动物。

2-L1-200(P)与阴性对照组(LOP)相同地在5天期间皮下给药洛哌丁 胺而诱发便秘后，将与2-L1-200相同的制造例2提取物的L1菌株发酵 物(制造例4)以200mg/kg口服给药5天后，在最后发酵物给药次日处死 实验动物。

B.体重、饲料摄取量及饮水量

除2-L1-200(P)之外的所有实验组，从洛哌丁胺给药开始日至处死实 验动物时为止，2-L1-200(P)是从发酵物给药开始日至处死实验动物时为 止，确认实验动物的体重变化量(g)、饲料摄取量(g)及饮水量(mL)，结 果在实验期间，饲料摄取量及饮水量没有显著的差异，在体重增加量方 面，也未出现显著的差异。

C.粪便个数

各实验组的粪便重量结果显示于图4中。

2-L1-200(P)是从发酵物给药开始日起第4日，其余是从洛哌丁胺给 药开始日起第4日，清除笼子里的粪便，换床之后，在1天期间收集粪 便，测量粪便个数及粪便重量。

与将制造例1的决明子水提取物以200mg/kg给药的1-200实验组 相比，在相同地以200mg/kg给药的1-L1-200及3-L1-200实验组中， 粪便个数均显著增加，3-L1-100实验组即使给药100mg/kg，也使粪便 个数显著增加，出现与乐可舒-S(Dulcolax-S)(CON2)同等水平的效果。

诱发便秘后将制造例2的决明子乙醇水溶液提取物的L1菌株发酵 物进行给药的2-L1-200(P)实验组，其粪便个数为26.2±3.1个，与阴性 对照组(LOP)相比，再次使粪便个数显著增加。

D.粪便重量

各实验组的粪便重量结果显示于图5中。

与将制造例1的决明子水提取物以200mg/kg给药的1-200实验组 相比，在相同地以200mg/kg给药的1-L1-200及3-L1-200实验组中， 粪便重量均显著增加，即使是以100mg/kg给药的1-L1-100及3-L1-100 实验组，也使粪便重量显著增加，出现与乐可舒-S(Dulcolax-S)(CON2) 同等水平的效果。

2-L1-200(P)实验组的粪便重量为3.18±0.28个，与阴性对照组(LOP) 相比，再次显著增加。

E.洋红(Carmine)色素肠移动距离

洋红色素肠移动距离是使洋红色素在生理食盐水中达到1.5％(w/v) 浓度，在第6天口服给药3mL，口服给药20分钟后处死实验动物，大 肠结扎从盲肠之后部分至直肠为止的部位的两端并摘取，利用PBS对 肠进行水洗后的照片显示于图6中，测量图6中标识的洋红色素移动的 距离，显示于图7中。

就洋红色素的肠移动距离而言，正常对照组(NOR)为13.4±0.94cm， 与之相比，洛哌丁胺给药阴性对照组(LOP)减少为6.6±0.75cm，确认了 洛哌丁胺诱发的便秘，番泻苷(CON1)与乐可舒-S(Dulcolax-S)(CON2) 的肠移动距离比阴性对照组(LOP)显著增加。

1-200实验组在肠移动距离方面与阴性对照组(LOP)没有显著差异， 但2-200实验组的肠移动距离比阴性对照组(LOP)显著增加。

确认了1-L1-100及3-L1-100实验组虽然按2-200实验组的1/2量进 行给药，但显示出与2-200实验组类似的肠移动距离，以与1-200及2-200 实验组相同量进行给药的1-L1-200及3-L1-200实验组，其肠移动距离 比2-200实验组显著增加。

1-L1-200及3-L1-200实验组出现与作为阳性对照组的番泻苷及乐 可舒-S(Dulcolax-S)同等或其以上的肠移动距离，特别是3-L1-200实验 组，出现了与正常对照组(NOR)同等的肠移动距离。

实验例4：发酵前后HPLC-IT/TOPMS图谱比较

针对制造例2的决明子乙醇水溶液提取物粉末与以L1菌株使制造 例2的决明子乙醇水溶液提取物粉末发酵的制造例3的决明子乳酸菌发 酵物粉末，按相同的浓度，利用HPLC-IT/TOPMS仪器(岛津，日本) 实施HPLC-IT/TOPMS，对图谱进行了比较。利用AcquityUPLC(超高 效液相色谱)C-18、1.7m2.1×100mm柱，流速0.3mL/分钟，在乙腈10％ 水溶液中，以70％水溶液进行梯度测量。

制造例2的决明子乙醇水溶液提取物的图谱显示于图6a中，制造 例3的决明子乳酸菌发酵物的图谱显示于图6b中。通过所述图谱比较， 确认了在制造例2的决明子乙醇水溶液提取物图谱中，多个峰值通过发 酵而降低含量或消失，取而代之生成了新峰值。

实验例5：高加索酸奶乳杆菌MJ90(L1)菌株的鉴定

A.菌株的分离

对在便秘改善或预防活性优异的决明子发酵物制造中最优异的高 加索酸奶乳杆菌MJ90菌株的分离过程进行说明。

针对1块西藏灵菇，为进行表面清洗而用灭菌水反复 冲洗数次。将准备的1块西藏灵菇在MRS液体培养基中，在37度下以 150rpm振荡培养24小时后，在含有1％CaCO₃的MRS平坦培养基中， 用10倍灭菌水稀释3次。将稀释为1×10³倍的西藏灵菇培养试样分株 100L后涂抹于MRS固体培养基。涂抹的培养基在恒温恒湿培养器中培 养36～48小时时间。而且，在培养的集落中，选择形态学上相异者， 在MRS琼脂中进行平板划线并培养，进行了纯化分离。

B.通过16s-rDNA序列分析的菌株鉴定

为了序列分析，将分离的高加索酸奶乳杆菌MJ90菌株在乳酸杆菌 MRS肉汤中培养，取培养液1.5mL进行离心分离后，用0.8％灭菌生理 食盐水进行水洗。然后，使用基因组DNA试剂盒(genomicDNAkit)， 提取染色体DNA(chromosomalDNA)，用作PCR所需的模板DNA， 为了扩增细菌的16srRNA，使用了9F(5'-GAGTTTGATCCTG GCTCAG-3')和1412R(5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT -3')引物。执行PCR后，将PCR产物通过电泳确认扩增产物，使用QI A快速PCR纯化试剂盒(QIAquickPCRpurificationkit)(凯杰，德 国希尔登)进行纯化。碱基序列使用ABIPRISMBigDye^TMTermina torCycleSequencingKits(测序试剂盒)(AppliedBiosystems,USA) 和ABIPRISM3730xl分析器(AppliedBiosystems)，在吉诺思公司(Gen oTechCo.)(韩国大田)实施。利用提供的碱基序列，在NCBI中实施 了blast检索，使用MEGA5.0程序，调查系统图并显示于 图9中，所述菌株鉴定为高加索酸奶乳杆菌。

所述高加索酸奶乳杆菌MJ90(LactobacilluskefiriMJ90)的16s rRNA碱基序列显示于序列号1中，所述高加索酸奶乳杆菌 MJ90(LactobacilluskefiriMJ90)菌株于2014年10月1日保藏于韩国 微生物保存中心，被赋予KCCM11575P保藏编号。