检测和/或预测男性生殖功能障碍的精浆piRNA标志物或其组合及其应用

摘要

本发明公开了检测和/或预测男性生殖功能障碍的精浆piRNA标志物或其组合及其应用。所述piRNA标志物或其组合一共61个，主要包括piR-31068、piR-31925、piR-43771、piR-43773和piR-30198，该组合可用于弱精症及无精症的检测和/或预测。在本发明中，精浆较易获得，无需其它组织，属于无创性检查；精浆piRNA可反映整个生精阶段的病理、生理情况，以其作为辅助检测指标可以提高检测的准确水平，在分子水平上反映整个生精过程中的病理和生理状况，并为男性生殖功能障碍的诊断和治疗提供了潜在靶点。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及检测和/或预测男性生殖功能障碍的精浆piRNA标志物或其组合及其应用。

背景技术

男性不育现已成为全世界范围内生殖健康问题，据世界卫生组织估计，目前全世界不育(孕)夫妇接近8000万，约占育龄夫妇的8％～12％，其中男性因素约占30％～40％(1,2)，且60％～75％男性因素不育的病因目前尚不清楚(3)。近年来，男性不育的比例呈上升趋势，而人们对优生优育的要求越来越高，因此为了有效诊断和治疗男性不育，寻找临床价值更高的男性不育标志物迫在眉睫。

但是，目前临床上尚无一种能够精确诊断男性生育能力的方法。目前国内临床生殖实验室通过检测精液中精子的密度和活力、精浆生化指标、血液中性激素水平、染色体核型和Y染色体微缺失等方法来判断男性睾丸的生精功能。但目前这些技术对许多无、少精子症的病因都无法解释，检测的准确性也有缺陷，这给临床治疗带来了极大的困扰。精液中除精子外，绝大部分是精浆。精浆由附睾、精囊、前列腺、睾丸网及尿道旁腺的分泌物组成，其化学成分中除90％的水外，还有糖、脂质、蛋白质、肽类激素、胺类、有机酸、有机碱以及无机离子等多种成分。研究表明，相对于正常男性，男性生殖功能障碍患者的精液，特别是精浆中的化学成分和活性分子往往会发生一定程度的改变。目前开展的常规精浆检测项目包括果糖、α-葡糖苷酶、酸性磷酸酶、锌和肉毒碱以及一些免疫学指标(包括抗精子抗体和抗弓行虫抗体等)，这些检测项目仅有助于诊断有限的几种男性附属性腺功能异常及个别免疫学因素，不能直接反映睾丸的生精功能和全面评价精液质量(4)。因此，目前迫切需要寻找一种比现有方法更精确的方法来检测男性不育及鉴定男性睾丸的生精功能和附属性腺的健康状况。

2006年四个研究组几乎同时在果蝇、小鼠、大鼠和人等物种的生殖系细胞中发现了一类新型小分子非编码RNA，因为它们特异性地与PIWI蛋白质相互作用，所以被命名为PIWI相互作用RNA(PIWI-interactingRNA)，简称piRNA(5-8)。

伴随着在雄性生殖细胞中发现piRNA，进一步研究发现piRNA产生于精子发生的粗线期精母细胞到圆形精子细胞的过程中(9)。并且，研究发现在鼠的精母细胞或圆形精子细胞中存在大量的piRNA分子，达到每个细胞中含上百万个piRNA(8)。随着研究的深入，大量文章报道piRNA参与生殖的调控，并在精子形成过程中起着重要的作用(10,11)，其中一个重要的功能就是控制转座子和重复序列等基因组自私性遗传元件的活性，确保生殖系细胞基因组的稳定性和完整性。由于piRNA特异性地在生殖世系细胞中表达，而且piRNA途径中的重要蛋白质与配子形成事件或胚胎发育直接相关，因此piRNA和PIWI蛋白突变失去功能后，常常会导致该个体不育(12)。因此，通过对这些piRNA进行研究，有望发现一些与男性生殖功能特别是与睾丸生精功能密切相关的piRNA作为生物标志物，进而应用于男性生殖功能障碍的临床诊断、预测和筛查。

发明内容

本发明的目的是通过筛查男性生殖功能障碍过程中精浆piRNA的特异性变化，筛选出在不育和正常健康生育人群中表达差异显著的精浆piRNA，通过检测这些piRNA，为诊断男性生殖功能障碍提供新的信息和指标。精浆piRNA生物标志物的检测对于提早发现男性生殖功能障碍具有指示意义，将提供分子水平的遗传信息，有助于揭示男性生殖功能障碍的分子成因和发病机制，并对病程监控、疗效评价等提供数据支撑。目前，本发明已发现精浆中能够检测到高浓度的piRNA，并且发现特异性的piRNA组合与生殖功能密切相关，能作为男性生殖功能障碍的分子标志物，具有很高的特异性和灵敏性。

本发明的上述目的是采用以下技术方案来实现的：

一种与男性生殖功能障碍相关的piRNA标志物或其组合，包括下列piRNA中的任意一种或多种：

piR-55521、piR-43771、piR-55522、piR-31704、piR-43773、piR-36038、piR-30841、

piR-45054、piR-55694、piR-55555、piR-55471、piR-36242、piR-31068、piR-33043、

piR-45053、piR-47305、piR-55440、piR-36707、piR-40978、piR-55505、piR-55484、

piR-52970、piR-55559、piR-61814、piR-44921、piR-47031、piR-59390、piR-44920、

piR-61400、piR-53928、piR-31925、piR-55525、piR-40349、piR-46576、piR-55485、

piR-30495、piR-43853、piR-55441、piR-39888、piR-61773、piR-55458、piR-55696、

piR-34549、piR-33740、piR-61322、piR-31355、piR-47020、piR-31746、piR-41483、

piR-55272、piR-56291、piR-36894、piR-55456、piR-46117、piR-30198、piR-55476、

piR-45057、piR-53604、piR-45797、piR-55438、piR-33880；其中，所述的男性生殖功能障碍选自弱精症或无精症。

本发明所述的piRNA标志物或其组合，优选包括以下几种piRNA：piR-31068、piR-31925、piR-43771和piR-43773；其中所述的男性生殖功能障碍优选弱精症。

本发明所述的piRNA标志物或其组合，优选包括以下几种piRNA：piR-31068、piR-31925、piR-43771、piR-43773和piR-30198；所述的男性生殖功能障碍为无精症。

piR-31068、piR-31925、piR-43771和piR-43773组合在制备检测和/或预测男性生殖功能障碍的检测试剂中的应用；所述的男性生殖功能障碍选自弱精症。

piRNA对应的核苷酸序列序列编号piR-31068AGCAUUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGCSEQ ID NO.1piR-31925AUUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGCCUGSEQ ID NO.2piR-43771UCCCUGGUGGUCUAGUGGUUAGGAUUCGGCASEQ ID NO.3piR-43773UCCCUGGUUCGAUCCCGGGUUUCGGCACCSEQ ID NO.4

piR-31068、piR-31925、piR-43771、piR-43773和piR-30198组合在制备检测和/或预测男性生殖功能障碍的检测试剂中的应用；所述的男性生殖功能障碍选自无精症。

piRNA对应的核苷酸序列序列编号piR-31068AGCAUUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGCSEQ ID NO.1piR-31925AUUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGCCUGSEQ ID NO.2piR-43771UCCCUGGUGGUCUAGUGGUUAGGAUUCGGCASEQ ID NO.3piR-43773UCCCUGGUUCGAUCCCGGGUUUCGGCACCSEQ ID NO.4piR-30198AAGACUUAGAGAUGGAAAGUAGUUCAAUGGSEQ ID NO.5

piR-30198在制备判断男性无精症与弱精症的检测试剂中的应用。

检测piR-31068、piR-31925、piR-43771和piR-43773的TaqMan探针和引物在制备检测和/或预测男性生殖功能障碍的试剂中的应用；所述的男性生殖功能障碍选自弱精症。

检测piR-31068、piR-31925、piR-43771、piR-43773和piR-30198的TaqMan探针和引物在制备检测和/或预测男性生殖功能障碍的试剂中的应用；所述的男性生殖功能障碍选自无精症。

检测piR-30198的TaqMan探针和引物在制备判断男性无精症与弱精症的检测试剂中的应用。

一种用于检测和/或预测男性生殖功能障碍的试剂盒，包含TaqMan探针Real-timePCR法检测piR-31068、piR-31925、piR-43771和piR-43773的探针和引物。

一种用于检测和/或预测男性生殖功能障碍的试剂盒，包含TaqMan探针Real-timePCR法检测piR-31068、piR-31925、piR-43771、piR-43773和piR-30198的探针和引物。

一种用于区分男性无精症与弱精症的试剂盒，包含TaqMan探针Real-timePCR法检测piR-30198的探针和引物。

根据已知RNA序列设计并合成TaqMan探针Real-timePCR法检测相应RNA的TaqMan探针和引物为本发明的成熟技术。本领域技术人员可以自行设计合成，或自行设计、委托合成，亦或是直接向生物公司订购相应RNA或miRMA的TaqMan探针和引物。本发明所述的用于检测相应piRNA的TaqMan探针和引物可以自行设计、合成，也可以通过商业化购买。针对同一种piRNA涉及的多种TaqMan探针和引物均属于本发明的保护范围。

上述piRNA组合的筛选方法包括以下步骤：

(1)收集精浆样本，包括正常生育男性以及生殖功能障碍男性(包括弱精症患者和非梗阻性无精症患者)的精浆样本，并提取总RNA；

(2)采用高灵敏度、精确性和高重复性的高通量二代测序技术(high-throughputsequencingtechnology)，对上述RNA进行检测，初步筛选出生殖功能障碍与正常生育男性精浆中表达差异显著的一组piRNA；

(3)进一步使用实时荧光定量PCR方法验证。

具体来说，上述筛选方法包括以下步骤：(1)分别收集正常生育男性及生殖功能障碍男性的精浆，并提取总RNA，其中所述生殖功能障碍包括无精(非梗阻性或炎症等原因)或弱精，并造成了不育；(2)根据NCBIdatabase中已经知道的piRNA，对上述RNA进行高通量二代测序检测，检测范围为10～45个核苷酸的全部小RNA，初筛出正常男性与生殖功能障碍男性精浆中表达差异明显的一组piRNA；(3)从个体精浆中提取RNA，逆转录成cDNA，采用荧光定量PCR(TaqMan探针法)方法进一步对初筛出的piRNA进行复筛和验证，挑选出稳定、特异性变化的piRNA作为生殖功能障碍的生物标志物，特异性检测和/或预测弱精症及无精症等男性生殖功能障碍疾病。

本发明使用的检测方法可以选自：高通量二代测序技术(high-throughputsequencingtechnology)、Real-timePCR方法以及生物芯片方法中的一种或几种。例如，精浆中piRNA分子的检测方法包括以下步骤：

(1)使用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取精浆总RNA；

(2)通过RNA逆转录反应得到cDNA；

(3)根据人piRNA序列设计引物及TaqMan探针，进行PCR反应对piRNA进行精确定量检测；

(4)比较生殖功能障碍患者精浆相对于正常男性精浆中piRNA的量的变化。

本发明所述的piRNA组合和单个piRNA及其对应的探针组合可应用于男性生殖功能障碍的检测中，例如为男性生殖功能障碍补充新的检测指标、用于病程监测、预后和药效评价之中。本发明所提供的上述piRNA组合具有以下几个方面的有益效果：

第一，精浆相对其它组织较易获得，与睾丸活检或者睾丸穿刺相比，属于无创性检查，极大地方便了医疗人员的使用，减轻了患者的痛苦；

第二，精浆中的piRNA反映的是整个生精过程中的病理和生理状况，其检测结果更具有临床指导意义；

第三，精浆piRNA检测能在分子水平上反映精子发生中的状态，提高了检测的准确水平，并为男性生殖功能障碍尤其是生精功能障碍的治疗提供了潜在靶点。

综上所述，检测精浆中的piRNA，简单易行且效果优越，从精浆piRNA的特异性变化这一新角度出发，发现疾病并且区分男性生殖功能障碍，从而建立起一种检测生精功能障碍的新技术。该技术仅仅需要病人的精浆而不需要任何其它组织，通过简单的piRNA组合及单个piRNA来预测男性生殖功能障碍发生的可能性及指导诊断和治疗该疾病。由此可见，检测精浆piRNA水平能拓展男性生殖功能障碍，例如睾丸生精功能的诊断指标，提高检测的灵敏度，丰富诊断男性生殖功能障碍的手段，这些精浆piRNA的水平有望成为诊断男性不育的重要标志分子，具有极重要的临床应用潜力和价值。

附图说明

图1本发明的主要流程图。

图2TaqMan探针Real-timePCR法测定piRNA(piR-31068、piR-31925、piR-43771、piR-43773和piR-30198)在无精或弱精患者与正常对照精浆样本中的浓度及差异性变化。如图所示piR-31068、piR-31925、piR-43771和piR-43773在弱精及无精患者精浆中相对正常对照均出现显著降低，因此piR-31068、piR-31925、piR-43771和piR-43773是可以区分生殖功能障碍(包括无精患者和弱精患者)与正常对照的特异性生物标志物piRNA；而piR-30198仅在无精患者精浆中相对正常对照出现显著降低，因此piR-30198既是区分无精患者与正常对照的特异性生物标志物piRNA，也是区分无精患者与弱精患者的特异性生物标志物piRNA。

图3单一piRNA(piR-31068、piR-31925、piR-43771、piR-43773或piR-30198)或piRNA组合(piR-31068、piR-31925、piR-43771和piR-43773四种piRNA组合及piR-31068、piR-31925、piR-43771、piR-43773和piR-30198五种piRNA组合)区分生殖功能障碍(包括无精患者和弱精患者)与正常对照的ROC曲线。A-D.piR-31068、piR-31925、piR-43771或piR-43773分别区分弱精患者与正常对照的效力(AUC接近于1，代表区分效果优异)；E-I.piR-31068、piR-31925、piR-43771、piR-43773或piR-30198分别区分无精患者与正常对照的效力(AUC接近于1，代表区分效果优异)；J.piR-30198单独区分无精患者与弱精患者的效力(AUC接近于1，代表区分效果优异)；K.四种piRNA组合(piR-31068、piR-31925、piR-43771和piR-43773)区分弱精患者与正常对照的效力(AUC几乎等于1，代表区分效果十分优异)；L.五种piRNA组合(piR-31068、piR-31925、piR-43771、piR-43773和piR-30198)区分无精患者与正常对照的效力(AUC等于1，代表区分效果十分优异)。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

本发明通过研究男性生殖功能障碍过程中精浆piRNA的特异变化，筛选出在疾病及正常生理状态下表达差异显著的一组精浆piRNA，将它们的探针应用于男性生殖功能障碍的检测，以提高疾病的发现率以及诊断的准确性和疗效。

以下实施例中使用的检测各piRNA的TaqMan探针和引物是由上海吉玛制药技术有限公司设计制定。名称为Hairpin-it^TMReal-TimePCR，订单号为探10122。

实施例1：高通量二代测序筛选特异性变化的piRNA作为生殖功能障碍的生物标志物

(1)研究对象为结婚后未采取任何避孕措施2年内不育者，以年龄匹配的已育不超过两年的男性为正常对照，所有受试者禁欲3～5天后留取精液，用WLJY-9000伟力彩色精子质量检测系统(北京伟力公司)进行精子质量和功能分析。分析标准均按世界卫生组织标准进行(WHO人类精液检查和处理实验室手册(第5版))。待精液分析后将其1000g离心10min,收集上清，再12000g离心5min，收集上清(精浆)。

(2)收集正常生育者、弱精以及非梗阻性无精的精浆标本分别21例、24例和17例，三组中的标本分别混合，三组总体积均为5ml。分别提取三组混合精浆中的RNA，具体方案为：利用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取总RNA。

(3)对三组精浆中总RNA进行高通量二代测序分析(华大基因)。

(4)piRNA表达谱分析。

高通量二代测序后得到了小RNA的序列和登录号，和NCBI核酸数据库比对后，在正常组精浆中测到piRNA3200种，弱精组精浆中测到1339种，无精组精浆中测到743种，总共在精浆中发现3575种piRNA。并获得了每种piRNA的reads数，reads数反映各个piRNA的表达量。若reads等于0则表示精浆中没有该piRNA，reads数值越大，其相对的piRNA的含量就越多。

不育患者精浆中变化显著的piRNA的入选标准如下：若piRNA在正常组中的reads数大于1000，且正常组的reads数是疾病组3倍以上；若piRNA在正常组中的reads在100和1000之间，且正常组reads是疾病组10倍以上。以上这两种情况视为变化差异明显。筛选结果显示，在检测到的3575种piRNA中，共有61种piRNA符合该条件，即在不育患者精浆中相对正常对照出现显著下降(详见表1)。

表1.高通量二代测序筛选不育患者精浆中变化下降的piRNA

实施例2：TaqMan探针Real-timePCR法测定piRNA在精浆中的绝对浓度并确定特异性变化的piRNA作为生殖功能障碍的生物标志物

针对表1中筛选出的piRNA，挑选部分进行单个样本的TaqMan探针Real-timePCR定量检测，从而确定piRNA在精浆中的绝对浓度，并进一步确定特异性变化的piRNA作为生殖功能障碍的生物标志物。

具体步骤为：提取100μL单个样本精浆中总RNA。针对每一种piRNA，设计一个含相同茎环结构的特异性反向引物，利用piRNA特异性反向引物进行逆转录，得到含共同茎环结构但属于特定piRNA的cDNA。进行基于TaqMan探针的Real-timePCR反应，将每种piRNA扩增并记录荧光信号，仪器使用的是Roche480荧光定量PCR仪。数据处理方法为绝对定量法，即每次进行荧光定量PCR时，将所需检测的样本与标准曲线同时进行PCR扩增，扩增结束后根据扩增曲线设定统一的阈值，然后根据标准品的浓度及每个浓度对应的CT值绘制标准曲线，计算出该样本中piRNA的绝对含量。

实验流程分为两阶段(复筛组和验证组)。在复筛组中，男性不育者共40例(无前列腺疾病、性功能障碍、精索静脉曲张、生殖道感染等病史，患者病程1～7年)，其中弱精症20例、无精症20例，以年龄匹配的生育能力正常的男性16例作对照。测试者的临床信息见表2。用TaqMan探针Real-timePCR法对受试者精浆标本进行逐个检测，筛选出患者组与对照组之间表达差异显著的piRNA。结果发现，至少5种piRNA(piR-31068、piR-31925、piR-43771、piR-43773和piR-30198)在患者组中表达量与对照组相比有显著差异，它们在无精组中均显著降低，其中4种piRNA(piR-31068、piR-31925、piR-43771和piR-43773)在弱精组中明显降低(见表3)。

表2.复筛组和验证组所有受试者的临床信息^*

*数据以mean±SD表示.b以two-sidedχ²test表示；P1:正常vs弱精；P2:正常vs无精；P3:弱精vs无精.

表3.TaqMan探针Real-timePCR法确定特异性变化的piRNA(复筛组)*

*数据以mean±SE表示.P1:正常vs弱精；P2:正常vs无精；P3:弱精vs无精.

将复筛出的5种piRNA进一步用TaqMan探针Real-timePCR法在大批量临床标本中进行验证，筛选出稳定的、表达差异显著的piRNA。临床研究的受试者无精者52例，弱精者74例，以正常58例作对照(详细临床信息见表2)。验证结果证实，复筛出的5种piRNA在患者组中的变化趋势与复筛组一致(见表4)。将复筛组和验证组的数据做散点图见图2。综上，这5种piRNA有助于无精和弱精的诊断。

表4.TaqMan探针Real-timePCR法确定特异性变化的piRNA(验证组)*

*数据以mean±SE表示.P1:正常vs弱精；P2:正常vs无精；P3:弱精vs无精.

将复筛组和验证组精浆标本结合起来(正常n＝74，弱精n＝94，无精n＝72)，根据每份标本精浆piRNA的浓度绘制ROC曲线(图3)并计算曲线下面积(AUC)以评估筛选出的piRNA对弱精或无精诊断的准确性。结果发现这5种piRNA的AUC在0.796～1.000之间。很明显，这5种piRNA对无精或弱精诊断的准确性相当高，具有临床价值。

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