用于检测肠细胞屏障机能障碍的方法和组合物

摘要

公开了检测患者的肠细胞屏障机能障碍的方法。在一种方法中，将患者肠上皮细胞(IEC)、口咽上皮细胞(OEC)或者口腔上皮细胞(BEC)用对半胱氨酸蛋白酶-1和半胱氨酸蛋白酶-3&7特异性的可检测的探针染色，并且观察细胞是否存在半胱氨酸蛋白酶-1的水平升高，通过半胱氨酸蛋白酶-1标记剂与半胱氨酸蛋白酶-3&7明显更高比率作为证据，其作为细胞屏障机能障碍的指示剂。在第二方法中，通过探针基共聚焦激光显微内镜(pCLE)获得患者的IEC、OEC或者BEC原位图像，并且通过图像分析细胞间隙密度。还公开的是用于检测肠细胞屏障机能障碍的一种探针组合物。

说明书

发明领域

本发明涉及用于检测与肠易激综合症(IBS)和炎症性肠病(IBD)有关的细胞屏障机能障碍的方法和组合物。

发明背景

肠易激综合症(IBS)是一种常见临床病况，特征在于肠频率、一致性的改变和腹部不适。使用RomeII标准的流行病学研究显示在北美洲IBS的流行从5％变化到12％，在亚洲从1％到22％和在欧洲从1％到8％。在大多数研究中观察到女性占优，特别是西方国家。IBS的主要驱动者之一可能是异常的肠上皮细胞(IEC)挤压。

炎症性肠病(IBD)是一组大肠和小肠的发炎病况。IBD的主要类型是克罗恩疾病和溃疡性结肠炎。IBS和IBD二者可以归因于或者由于异常的肠上皮细胞(IEC)挤压而恶化，从而导致了患者的细胞屏障机能障碍。

发明内容

在一种实施方案中，本发明包括一种检测患者的肠易激综合症(IBS)或者炎症性肠病(IBD)的方法，其在于：(a)用探针染色患者的肠、口咽或者口腔上皮细胞，该探针具有共轭到半胱氨酸蛋白酶(caspase)-1抑制剂上的可检测的标记剂，和(b)相对于分别来自正常人的类似染色的肠、口咽或者口腔上皮细胞，检查该染色的肠、口咽或者口腔上皮细胞的可检测的标记剂的升高水平的存在，作为与患者肠、口咽或者口腔上皮细胞有关的半胱氨酸蛋白酶-1超过正常水平的证据。

患者肠上皮细胞(IEC)，口咽上皮细胞(OEC)或者口腔上皮细胞(BEC)中半胱氨酸蛋白酶-1水平的升高是与患者的肠易激综合症(IBS)或者炎症性肠病(IBD)有关的细胞屏障机能障碍的指征。

在一种实施方案中，患者IEC获自来自于患者的肠内壁的活组织检查或者体腔吸出，用荧光标记剂体外染色，并且分析荧光水平。在另外一种实施方案中，患者OEC获自患者的口咽细胞的牙齿活组织检查或者体腔吸出，用荧光标记剂体外染色，并且分析荧光水平。在又一实施方案中，患者BEC是通过例如轻轻的药签擦拭面颊来获得的，用荧光标记剂体外染色，并且分析荧光水平。荧光检测可以通过荧光显微镜法，荧光板阅读器，流式细胞测量法或者适于检测和测量荧光水平的其他方法来进行。

在另一种通用实施方案中，OEC或者BEC中半胱氨酸蛋白酶-1水平升高可以诊断克罗恩疾病(IBD的一种主要类型)。

所述探针可以是半胱氨酸蛋白酶-1抑制剂例如四肽YVAD和荧光染料的共轭物。一种示例性的探针具有结构AlexaFluor488-GGGG-YVAD-FMK。

在一种示例性实施方案中，将细胞用下面的来染色：(a)第一探针，其包含共轭到半胱氨酸蛋白酶-1抑制剂上的第一可检测的标记剂，和(b)第二探针，其包含共轭到半胱氨酸蛋白酶-3&7抑制剂上的，不同于第一标记剂的第二可检测的标记剂。分析所述细胞来测定与半胱氨酸蛋白酶-1有关的标记剂相对于与半胱氨酸蛋白酶-3&7有关的标记剂的比率。健康受测试者的半胱氨酸蛋白酶-1与半胱氨酸蛋白酶-3&7标记剂之比相比于具有IBS或IBD的受测试者明显更低，例如低了至少40％。一种示例性第二探针是半胱氨酸蛋白酶-3/7抑制剂I和荧光染料的共轭物，它的峰值吸收和发射波长不同于第一探针荧光染料。

当IEC中的半胱氨酸蛋白酶-1的水平明显高于正常水平时，所述方法可以用于指征通过半胱氨酸蛋白酶-1抑制剂、抗炎药、益生菌剂或者这些试剂的组合的患者治疗。

在另一种通用实施方案中，IEC、OEC或BEC是原位染色的，并且通过探针基共聚焦激光显微内镜(pCLE)来观察。

在其他方面，本发明包括一种检测患者肠细胞屏障机能障碍的方法，其包括步骤：通过探针基共聚焦激光显微内镜(pCLE)获得患者的IEC的原位图像，和计算所述图像中的IEC，来确定成像的IEC中的间隙的数目。约每百细胞大于2的间隙密度是细胞屏障机能障碍的指征，并且可以用作患者通过例如益生菌剂治疗的指征。

还公开的是一种用于检测肠细胞屏障机能障碍的探针组合物。该组合物包括(a)第一探针，其包含共轭到半胱氨酸蛋白酶-1抑制剂上的第一可检测的标记剂，和(b)第二探针，其包含共轭到半胱氨酸蛋白酶-3&7抑制剂上的，不同于第一标记剂的第二可检测的标记剂。该第一探针可以是四肽YVAD和荧光染料的共轭物，例如探针具有结构AlexaFluor488-GGGG-YVAD-FMK。该第二探针可以是半胱氨酸蛋白酶-3/7抑制剂I和不同于第一探针的荧光染料的共轭物。

当结合附图来阅读本发明下面的详细说明时，本发明的这些和其他目标和特征将变得显而易见。

附图说明

图1.在极化的T84单层中，IEC诱导的细胞挤压的半胱氨酸蛋白酶-1活化。(a)在尼日利亚菌素处理的(50μM)培养的T84细胞中，活化的半胱氨酸蛋白酶-1代表性FLICA1染色(绿色)。红色，ZO-1染色；蓝色，DAPI，绿色，FLICA1染色(比例尺，50μm)。(b)在尼日利亚菌素处理的(50μM)T84细胞中增加的活性半胱氨酸蛋白酶-1(p10)表达。(c)用尼日利亚菌素处理的T84细胞的TEM外观：染色质集中在核膜周围，细胞质中的致密体的小的和大的透明液泡，和增加的基质密度的完好的线粒体。A，顶部表面，B，基部表面，N，核(比例尺，2μm)。

图2.在半胱氨酸蛋白酶-1活化之后，极化的单层改变的渗透性。(a)用尼日利亚菌素处理的，用Ac-YVAD-CMK反转的T84单层的TER(±S.D.)中与剂量相关的降低(在尼日利亚菌素25μM时)。(b)TER的时间相关的降低，其是通过用尼日利亚菌素处理的，用Ac-YVAD-CMK反转的T84单层的ECIS来测量的(在尼日利亚菌素25μM时)。(c)YG微球和大肠杆菌TMW2.497沿着用尼日利亚菌素10μM处理一整夜的单层的移动。红色，ZO-1染色；中心图像绿色，1μm微球，右侧图像绿色，大肠杆菌TMW2.497(比例尺，50μm)。数据表示的是三个的独立实验。*P<0.05。

图3.在IL-10KO中与WT小鼠比较的增加的半胱氨酸蛋白酶-1活化。(a)通过免疫印迹分析的在IL-10KO中增加的活性半胱氨酸蛋白酶-1(p10)表达。(b)IL-10KO(N＝5)的肠组织中增加的活性IL-1β。(c)来自WT和IL-10KO小鼠的PCNA染色的肠区的代表性图像(比例尺，50μm)。(d)每个啮齿动物肠组织的腺窝的阳性PCNA染色细胞的数目。*P<0.05。

图4.IL-10KO小鼠中到内腔微粒和微生物的增加的渗透性。(a)口服的FITC-右旋糖苷向血液样品中的渗透(N＝4)。(b)口服的0.5μm微球在血液样品中的存在(N＝6)。(c)大肠杆菌TMW2.497向肝脏和脾脏的迁移(N＝4)。(d)进入小鼠肠的挤压区的大肠杆菌TMW2.497的代表性图像。*P<0.05，**P<0.01。

图5.半胱氨酸蛋白酶-1对于体内微球的IEC挤压和渗透的调节。(a)用Ac-YVAD-CMK10mg/kg在IL-10KO小鼠中对于IEC挤压的治疗，其是通过使用共聚焦显微内镜经时测量的上皮间隙密度来测定的(N＝5)。(b)口服的0.5μm微球在IL-10KO小鼠血液样品中的存在(N＝6)。(c)绿脓杆菌的IV类型菌毛0.33mg/kg口强饲法1天，对于WT小鼠的IEC挤压的影响(N＝3)，其是通过间隙密度来测定的。*P<0.05。

图6.患者的IEC的半胱氨酸蛋白酶-1和半胱氨酸蛋白酶-3&7活化。(a)黏膜活组织检查样品的代表性活化的半胱氨酸蛋白酶-1和半胱氨酸蛋白酶-3&7染色，白色箭头表示阳性染色的IEC(比例尺，50μm)。(b)在对照(N＝3)和IBD(N＝3)患者的黏膜活组织检查样品中，FLICA1或者3&7染色的细胞校正到上皮细胞总数(±S.D.)。(c)来自由IBD患者的肠道吸出物所制备的细胞团块的代表性上皮和免疫细胞(H&E染色，放大倍率400X)。(d)对照(N＝7)和IBD(N＝11)患者的内腔吸出物中，挤出的IEC(±S.D.)的数目。(e)在内腔吸出物中，活化的半胱氨酸蛋白酶-1与半胱氨酸蛋白酶-3&7的比例。*P<0.05。

图7.在无症状对照(N＝3)和IBD患者(N＝3)的黏膜组织中活化的半胱氨酸蛋白酶1和IL-1β表达。(a)与对照患者相比，通过ELISA所测量的在IBD中增加的活性IL-1β表达。(b)免疫印迹分析，其证实了活性IL-1β在IBD患者末端回肠中增加的表达。(c)通过免疫印迹分析，在IBD患者中增加的活性半胱氨酸蛋白酶-1(p10)表达。*P<0.05。

图8.来自患者的末端回肠的代表性pCLE图像，其被用于计数上皮细胞和间隙。在这个图像中未观察到间隙。白色箭头表示用于细胞计数的单个上皮细胞。

图9.患者末端回肠的pCLE图像。a)来自健康对照患者(左边)和具有IBS的患者(右边)的末端回肠的代表性图像。标记了绒毛的固有层和内腔。白色箭头表示两个相邻的上皮间隙，其作为上皮细胞壁的超致密区而出现。b)在对照患者分析中所用的三个连续的pCLE图像。C)在IBS患者分析中所用的三个连续的pCLE图像。比例尺：20μm。

图10.比较了对照患者和IBS患者的末端回肠中的上皮间隙密度(中值±四分差)。上皮间隙密度表达为上皮间隙数目/1000个计数的细胞。*表示p<0.001。

图11显示了在来自正常患者和克罗恩疾病患者的牙齿活组织检查的口咽上皮细胞中，半胱氨酸蛋白酶-1表达的水平，其是通过免疫印迹分析测定的。

具体实施方式

A.通过半胱氨酸蛋白酶-1染色检测细胞屏障机能障碍的方法

A1.半胱氨酸蛋白酶-1介导的IEC挤压导致在上皮单层中的破裂

为了调查半胱氨酸蛋白酶-1-诱导的IEC挤压的形态，我们将尼日利亚菌素(一种公知的Nlrp3-依赖的炎性体活化剂)施用到极化的T84单层上。使用FLICA1染色，我们观察到在3小时后处理时，在单层中增加的活化的半胱氨酸蛋白酶-1和细胞挤压(图1a)。尼日利亚菌素处理的T84细胞中活化半胱氨酸蛋白酶-1表达是通过免疫印迹分析来证实的(图1b)。通过透射电子显微镜法(TEM)，来自单层的挤出细胞的形态外观揭示了不同染色质聚集在核中，完好的线粒体和小或大的透明液泡处于细胞质中(图1c)。

为了确定这种形式的细胞挤压是否导致了屏障功能的丧失，我们测量了透上皮电阻(TER)。在尼日利亚菌素曝露之后，形成了剂量相关的屏障机能障碍，其是通过用选择性的、有效的和不可逆的半胱氨酸蛋白酶-1抑制剂Ac-YVAD-CMK在3小时预处理(图2a)和一整夜处理之后(图2b)而消除的。给定T84单层中的破裂出现在TEM图像上1-2μm直径中，我们使用最低剂量的尼日利亚菌素处理评价了微粒(1μm微球)和微生物(大肠杆菌TMW2.497)的上皮完整性。观察了微球和大肠杆菌从Transwell上部室穿过单层到下部室的移动(图2c)。Fluoresbrite微球和大肠杆菌TMW2.497是在来自基底外层孔的介质中回收的。

A2.半胱氨酸蛋白酶-1在体内对于细胞挤压和上皮完整性的调节

为了理解半胱氨酸蛋白酶-1诱导的IEC挤压对于体内肠渗透性的作用，我们首先检查了在与129/SvEv(WT)小鼠相比的IL-10KO中所观察的增加的细胞挤压(通过增加的上皮间隙密度来测量)是否归因于增加的半胱氨酸蛋白酶-1活化。增加的活性半胱氨酸蛋白酶-1表达是在IL-10KO小鼠小肠中在免疫印迹分析上观察的(图3a)，并且用通过ELISA的增加的活性IL-1β表达来证实(图3b)。为了确定IL-10KO中降低的细胞增殖是否促成了所观察到的上皮间隙密度中的差异，我们用PCNA染色了来自两个小鼠品系的肠样品。与WT小鼠相比，IL-10KO的细胞增殖降低了38％(图3c和d)。

增加的IEC挤压对于肠渗透性的作用是用IL-10KO和WT小鼠中大分子(右旋糖苷)和微粒(微球)向血液中的渗透，和微生物(大肠杆菌TMW2.497)向肝脏和脾脏的迁移来研究的。增加的IEC挤压与右旋糖苷(图4a)和0.5μm微球(图4b)向血液增强的渗透，和大肠杆菌(图4c)的迁移有关，其是通过组织培养来测定的。对用GFP标记的大肠杆菌强饲的小鼠的回肠组织的共焦显微镜法揭示了存在着接近于IL-10KO肠挤压区的细菌(图4d)。

为了评价体内随着时间变化，半胱氨酸蛋白酶-1抑制对于IEC挤压的作用，我们用选择性半胱氨酸蛋白酶-1抑制剂Ac-YVAD-CMK(10mg/kg)，经由腹膜内注射处理IL-10KO小鼠4、7和10天(5倍于啮齿动物肠细胞的平均寿命⁴⁰)。对照IL-10KO组接收了10天的等体积的2％(v/v)DMSO。IEC挤压时间有关的降低，如通过上皮间隙密度降低所测量的，产生在(图5a)用YVAD处理的IL-10KO小鼠中。间隙密度的降低伴随着在第7天口强饲法的0.5μm惰性乳胶微球向血液中渗透的校正(图5b)。

半胱氨酸蛋白酶-1活化对于IEC挤压和上皮完整性的作用是通过服用绿脓杆菌IV类型菌毛(一种ICE-蛋白酶活化因子(IPAF)炎性体活化剂，其可以给定口服来诱导半胱氨酸蛋白酶-1活化)来检查的。我们选择了绿脓杆菌IV类型菌毛，因为尼日利亚菌素不能口服使用，并且与明显的全身毒性有关。在口服强饲了IV类型菌毛(0.33mg/kg)一天的WT小鼠中，与强饲了等体积盐水的对照小鼠相比，我们观察到IEC挤压的增加的趋势，这是通过较高的上皮间隙密度来测量的(图5c)。

A3.通过半胱氨酸蛋白酶-1活化介导的人类肠中非凋亡IEC挤压

为了探究IEC的半胱氨酸蛋白酶-1活化是否代表了人类细胞挤压中的主要机理，我们从IBD和无症状对照患者的正常表现的末端回肠收集了黏膜活组织检查和内腔吸出物。将黏膜活组织检查样品用FLICA-1和3&7染色，来确定IEC对于活化的半胱氨酸蛋白酶-1(炎症坏死)或者半胱氨酸蛋白酶-3&7(凋亡)染色的阳性作用(图6a)。对照中阳性染色的半胱氨酸蛋白酶-1与半胱氨酸蛋白酶-3&7细胞之比是1.16：1；其在IBD患者中增加到1.7：1(图6b)。对于内腔吸出物的分析，对照患者具有对于细胞团块制备来说不足的材料。在IBD患者中，在细胞团块上所看到的成核细胞的总数是12-155个细胞，并且IEC占细胞的41-100％(图6c)。我们量化了过滤器上收集的内腔吸出物中挤出的细胞的总数：与对照患者相比，在来自IBD患者的内腔吸出物中观察到明显更高的细胞数(图6d)。将该挤出的细胞和细胞碎片用FLICA染色，用于活化的半胱氨酸蛋白酶-1和3&7。FLICA染色的内腔吸出物的图像是基于存在于两个薄膜上的细胞和细胞碎片的半胱氨酸蛋白酶染色的强度来打分的，类似于用于组织学样品的等级标准。每个图像被赋予了0-4的分数，这取决于染色的强度和染色的细胞或者细胞碎片的数目。使用这种评分系统，对照患者中染色阳性的半胱氨酸蛋白酶-1与半胱氨酸蛋白酶-3&7细胞之比是大约1：1，其在IBD患者中增加到2：1(图6e)。

黏膜活组织检查样品中活性IL-1β的表达是用ELISA测定的，并且在IBD患者中明显更高(图7a)。活性半胱氨酸蛋白酶-1和IL-1β在黏膜活组织检查样品中增加的表达是用免疫印迹分析来证实的(图7b和c)。一起考虑，这些结果表明了半胱氨酸蛋白酶-1活化代表了健康人类肠中IEC挤压的主要机理，并且看起来是造成所观察的IBD患者细胞挤压明显增加的原因。在这个研究中，我们描述了通过半胱氨酸蛋白酶-1活化介导的发炎性形式的IEC挤压，其导致了体外和体内上皮细胞中的破裂。这种形式的IEC挤压允许微粒和微生物沿着极化的单层移动。啮齿动物肠中的IEC挤压可以通过半胱氨酸蛋白酶-1酶的活化或抑制来调控。IL-10KO小鼠中增加的IEC挤压与大分子(右旋糖苷)，微粒增加的渗透和共生细菌的迁移有关。半胱氨酸蛋白酶-1活性体内调控导致了IEC挤压的改变，并且伴随着上皮完整性的改变，这是通过惰性乳胶微球的渗透来测定的。在患者中，可以在健康患者和IBD患者中观察到半胱氨酸蛋白酶-1介导的IEC脱落，并且IBD患者中明显增加。我们的实验结果为以前报告为危及了上皮完整性的IEC挤压基础机制提供了基础的新的视角。⁷

与十二指肠吸出物以前的形态分析的一致性表明了挤出的细胞具有炎症坏死和凋亡的特征，我们的内腔吸出物研究揭示了挤出的细胞中半胱氨酸蛋白酶-1和半胱氨酸蛋白酶-3&7二者的活化。我们的黏膜活组织检查分析发现与前面的研究是一致的，其中使用人类肠样品的活化的半胱氨酸蛋白酶-3染色发现，44％的脱落IEC凋亡。在这个研究中，我们观察到46％待挤出的IEC中的半胱氨酸蛋白酶-3&7活化。

我们的来自患者的挤出的细胞和活组织检查样品的分析结果是互补和一致的，并且与以前的挤出的IEC研究是一致的。该内腔吸出物分析会受限于这样的事实，即，挤出的IEC在脱落后会破裂成碎片，所以黏膜活组织检查分析结果对于确认半胱氨酸蛋白酶-1和3&7阳性细胞相对比率必不可少。因为半胱氨酸蛋白酶-1介导的细胞挤压区会是微生物可透过的，它在IBD患者中的明显增加可以导致在前面的研究中所观察的与载菌量有关的内黏膜和淋巴腺的增加。患者的屏障功能在目前的研究中没有检查。因为上皮缺陷看起来允许微粒和微生物进入，因此对患者适当的测试来检查上皮完整性将需要严格的确认研究。另外，我们尚未研究在半胱氨酸蛋白酶-1介导的细胞脱落后挤压区的封闭或者康复机理，这对于定义所观察的上皮完整性损失是关键的。在凋亡诱导的细胞挤压中，需要收缩周围细胞和重组紧密接头来防止屏障功能损失。未来的描绘炎症坏死中细胞脱落过程的生化事件的研究将促进我们对于紧密接头改变，挤压中所涉及的收缩性蛋白质和这种形式的细胞挤压的封闭机理作用的理解。会需要对于在半胱氨酸蛋白酶-1介导的细胞挤压后封闭机理的基本理解，来促进开发正确的测试来评价患者的上皮完整性。

通过透射电子显微镜法(TEM)的挤出细胞的形态外观是与炎症坏死细胞以前的报告一致的(图1c)，并且符合与人类损害的上皮完整性有关的IEC挤压形式的描述。TER研究结果表明通过这种形式的细胞挤压所诱导的上皮细胞壁破裂是与半胱氨酸蛋白酶-1依赖的。我们的数据进一步表明由半胱氨酸蛋白酶-1活化所形成的细胞挤压区可以提供内腔微生物和抗原的进入位置。在经历了代谢应力的上皮细胞和在肠细胞、单核细胞和树枝状细胞的3维共培养体系中观察到作为微生物进入位置的细胞内空间。其中，我们观察到在单独的IEC中用炎性体/半胱氨酸蛋白酶-1活化，在上皮细胞中形成了类似的屏障缺陷。

在啮齿动物模型中，半胱氨酸蛋白酶-1活性的调制改变了与上皮细胞壁完整性变化相关的IEC挤压。与凋亡介导的细胞挤压(其中保存了上皮细胞的屏障功能)相比，我们发现炎症坏死介导的IEC挤压引起了上皮细胞破裂，其有利于微生物和微粒进入黏膜。用绿脓杆菌IV类型菌毛处理一整夜引起的炎症坏死产生了更高的IEC挤压，并且伴随着微球在WT小鼠中渗透的增加。相反，抑制IL-10KO小鼠的半胱氨酸蛋白酶-1活性产生了IEC挤压与时间有关的减少，这是通过上皮间隙密度来测定的。基于这些观察，我们估计对于IL-10KO小鼠，对于大肠炎来说，实现稳态药理学活性的时间(半衰期的5倍)是大约35天。所以，我们选择使用口强饲法的乳胶微球的渗透，作为上皮完整性评估的替代终点，来研究降低的细胞挤压的生理效果，而非通常的临床终点-大肠炎改善的得分。在我们的研究中，强饲微球的渗透的标准化是在处理了7天后实现的。

在IL-1β上游，Nlrp3表达在免疫和上皮细胞二者中，并且表现出在肠动态平衡中起到了重要作用。Nlrp3-/-小鼠更易于通过DSS，2，4，6-三硝基苯磺酸盐(TNBS)，或者柠檬酸菌属感染而诱导的实验大肠炎。与以前的研究一致，我们的结果表明半胱氨酸蛋白酶-1活化诱导的IEC挤压(经由Nlrp3或其他路径介导)会是健康人的肠动态平衡所必需的。在一些报告中，已显示由半胱氨酸蛋白酶-1活化所产生的IL-1β和IL-18导致了肠炎，而更新的研究表明半胱氨酸蛋白酶-1提供了抗大肠炎和大肠炎相关的癌症的保护。实验结果的差异可以部分归因于遗传背景的差异，所用动物的性别，或者动物样品的微生物菌丛的变化。

总之，我们的研究结果表明IEC的半胱氨酸蛋白酶-1活化会诱导细胞挤压，其导致在肠上皮细胞中形成了屏障机能障碍，其会促进微生物进入黏膜中。这种形式的细胞挤压看起来是造成以前观察的引起上皮细胞壁破裂的脱落事件的机理。

A4.在OEC和BEC中升高的半胱氨酸蛋白酶-1水平可以诊断克罗恩疾病。

为了确定OEC的半胱氨酸蛋白酶-1活化是否是可以诊断克罗恩疾病，我们使用标准程序获得了正常人和克罗恩疾病个体的口咽区的牙齿活组织检查。将该活组织检查的上皮细胞用半胱氨酸蛋白酶-1标记剂体外染色，如上所述，并且通过荧光显微镜法检查来确定半胱氨酸蛋白酶-1水平。从图11的条状图可以看出，克罗恩患者的半胱氨酸蛋白酶-1水平相比于正常水平升高了大约2倍。

该数据证实了通过体外检测染色的OEC来检测人类的半胱氨酸蛋白酶-1水平，提供了一种检测克罗恩疾病的简单方法。该包括OEC的诊断方法可以用BEC来进行，例如通过轻轻的颊拭子获得的BEC，并且也可以用于其他的IBD和IBS病况，和可以通过体内染色OEC或BEC，随后例如使用荧光工具来测定口腔中染色的细胞荧光水平来原位检测而进行。

B.通过pCLE检测细胞-屏障机能障碍的方法

将总共35个患者(17个IBS和18个对照)招募到该研究中，一个被认为具有IBS的患者从将来的分析中被排除，这归因于大肠活组织检查上微观大肠炎的存在。基准患者特征显示在表1中。16个IBS患者的平均年龄是42.8+18.5岁。有7位女性和9位男性患者。对照患者(n＝18)的平均年龄是47.4+10.1岁，有10位女性和8位男性患者。对照患者的结肠镜检查的指征是结肠直肠癌筛查(n＝9)和直肠出血或者阳性粪便潜血测试(n＝9)。IBS组包括12个腹泻为主的IBS患者和4个便秘为主的IBS患者。为了评价他们的症状的其他原因，我们对全部患者的病史进行了详细了解，来排除乳糖/果糖不耐受性。全部中一位腹泻为主的IBS患者具有血清抗体(抗-tTG或者抗肌内膜抗体)或者EGD，并且进行活组织检查来排除腹腔疾病。这一位患者(他没有进行血清测试或者EGD)处于腹腔疾病的低风险组中。除了两位患者全部患者进行了血清TSH检查来排除作为他们的症状的原因的甲状腺机能障碍。在IBS和对照患者二者中，正常的结肠镜检查是最普遍的内窥镜结果。其他结果是息肉(n＝8)，憩室病(n＝4)和痔疮(n＝8)。在全部IBS患者和对照患者中进行的末端回肠和大肠的随机活组织检查都处于正常限度内。对照患者和IBS患者的代表性pCLE图像显示在图2中，具有在计数中所用的三个连续的视图。

IBS患者具有与对照患者相比明显更高的间隙密度(图3)：IBS患者的中值间隙密度是32(17-42)个间隙/1000个细胞，对照患者是6(0-13)个间隙/1000个细胞(p<0.001)。因为间隙密度值不是正态分布的(p＝0.005，Shapiro-Wilk测试)，所以我们使用了中值回归分析来量化组间的差异。所评估的IBS和对照患者之间的间隙密度中值差异是26(95％CI：12，39)个间隙/1000个细胞。控制年龄和性别，IBS组相对于对照组的中值间隙密度值明显更高(p<0.001)，并且所估计的中值差是25(95％CI：18，32)个间隙/1000个细胞。

我们检查了IBS的上皮间隙密度在性别、年龄和IBS亚型之间的关系。在对照患者中，我们注意到上皮间隙密度和年龄之间负相关的趋势，并且Spearman相关系数(rho)是-0.43(p＝0.07)。另外，我们发现女性相比于男性的具有更高的中值间隙密度的趋势(11个间隙相比于0个间隙/1000个细胞，p＝0.07)。在IBS患者中没有观察到这些趋势。关于IBS的亚型，腹泻为主的IBS患者(n＝12)的中值间隙密度类似于便秘为主的IBS患者s(n＝4)：分别是32个比38个间隙/1000个细胞。

来自健康对照组的所估计的第90百分点的间隙密度值是30个间隙/1000个细胞。使用30个间隙/1000个细胞作为异常的间隙密度的分界点，间隙密度对于IBS的诊断灵敏度是62％，特异性是89％，具有83％的正预测值和73％的负预测值。间隙密度对于IBS的诊断精确度显示在表2中。

在这个研究中，我们发现IBS患者在末端回肠中具有比健康对照患者明显更高上皮间隙密度，其是通过pCLE测量的。这个结果表明IBS患者肠中升高的上皮间隙，小肠中增加的上皮细胞挤压的替代标记剂，会导致以前在IBS中所报告的屏障机能障碍和低等级的黏膜炎症。虽然我们的结果是基于少数患者，但是它确实提供了对于疾病发病机理的潜在的新视角。

有日益增加的证据表明IBS中增加的肠渗透性与上皮紧密接头中的变化和细胞因子轮廓的变化有关。已经在IBS患者中报道了紧密接头蛋白质改变的表达和细胞分布，包括claudin-1和occludin。细胞因子谱的变化进一步支持了IBS患者中增强的肠渗透性这种观点。我们的研究结果表明增加的上皮细胞挤压会是用于在IBS患者中所观察的屏障机能障碍和黏膜发炎的潜在机理。

在我们的次级分析中，我们发现女性对照患者具有比男性更高的间隙密度的趋势。这个结果可以对女性IBS更多提供潜在解释。具有更高的上皮间隙基准，女性更易于罹患所述疾病。此外，我们观察到健康对照组中间隙密度与年龄的负相关性，这在以前尚未报道。这些结果应当在更大规模的研究中进一步调查。我们没有观察到腹泻为主或者便秘为主的IBS之间在上皮间隙密度中的差异。但是，这个研究中仅仅包括了四个便秘为主IBS患者。腹泻为主IBS患者的肠渗透性中的明显变化以前有过报道，而便秘为主IBS患者没有报道。

目前为止，没有专门的内窥镜结果能够区分IBS与健康患者。目前高到50％的IBS患者在他们的评估期间进行了结肠镜检查，并且用于IBS相关症状的25％的结肠镜检查是在美国进行的。大部分结肠镜检查是进行来排除其他腹泻病因的，例如微观大肠炎。在我们的研究中，在常规的结肠镜检查中使用pCLE来定位和量化IBS和健康对照患者的小肠中的上皮间隙，我们能够证实IBS患者具有明显更高的上皮间隙密度。我们的小肠中增加的上皮间隙的结果不仅提供了IBS发病机理的潜在机理，而且也提供了用于疾病诊断的一种可能的内窥镜标准。在这个研究中，升高的间隙密度对于IBS诊断的灵敏度是62％和特异性是89％。随着我们对于IBS发病机理理解的发展，pCLE会是另外一种诊断测试，其可以进一步定义这种复杂的疾病组。虽然在我们目前的研究中，IBS患者的间隙密度明显高于对照组，但是相比于我们以前的报告中的IBD患者，该间隙密度的增加是远远更低的。对照患者、IBS和IBD患者中的间隙密度的比较显示在附图1中。

我们的研究有诸多局限。这是一种在单个三级转诊中心中使用共聚焦激光显微内镜专业的34个患者的小研究，并且在上皮间隙中进行了量化。我们的研究中的IBS患者代表了不同组的患者。我们没有将研究的受测试者限定为腹泻为主或者便秘为主的IBS患者。该研究的目标是确定IBS和对照患者之间的间隙密度中的任何差异。在使用pCLE图像量化上皮间隙和细胞中会存在误差。但是，因为评价者对于所述程序的指征是不知晓的，因此这些误差应当在在IBS和对照患者之间均匀分布。需要未来的大的多中心研究来确认我们目前研究的初步结果。在这个研究中，我们仅仅用pCLE对小肠绘图，来量化上皮间隙密度。我们以前进行了确认研究，使用啮齿动物模型来表征末端回肠的上皮间隙密度的观察者之间和观察者内的变化。对于对大肠CLE图像我们没有意识到这样的确认研究。

总之，我们已经发现在结肠镜检查过程中通过pCLE所确定的末端回肠的上皮间隙密度，对于IBS患者来说明显高于健康对照组。这个结果表明通过上皮间隙密度所测定的增加的上皮细胞挤压可以代表在IBS患者中所观察的改变的肠渗透性的潜在机理。

C1.实验：半胱氨酸蛋白酶-1方法

小鼠

将在我们的动物设备中繁殖了至少10代的24-28周大的IL-10KO小鼠(JacksonLaboratories，BarHarbor，缅因州)和背景129/SvEv小鼠(TaconicFarmsInc.CambridgeCity，印第安纳州)用于全部的实验。将小鼠安置在具有明暗周期的常规饲养设施中。动物协议是由Alberta大学的保健科学动物护理和使用委员会批准的。

患者样品

研究协议是由Alberta大学的人类道德研究评审部进行评审和批准的，并且该研究是在ClinicalTrial.Gov(NCT00988273)注册的。进行了结肠镜检查的患者提供了书面通知，同意参加该研究。在进行了结肠镜检查的IBD(N＝11，6个克罗恩疾病，5个溃疡性结肠炎)和无症状对照(N＝8)患者中，在用0.9％NaCl溶液轻轻清洗了肠表面之后，使用前述方法⁷收集了来自正常外观的末端回肠的内腔吸出物，并且立即分析(<15分钟)。细胞团块是由在盐水清洗后收集的25mL内腔吸出物来制备的，并且用苏木精和曙红染色，来用于上皮或者免疫细胞的形态鉴别。对于FLICA染色，如下将来自5mL的吸出物流体的细胞固定到25mm聚碳酸酯Membra-filNucleopore薄膜中，其具有5.0uM孔尺寸(Whatman，GEHealthcareLifeSciences，皮斯卡塔韦，新泽西)：使用真空过滤和通过加入20mL的含有0.5％(w/v)BSA的PBS(pH7.4)过滤清洗。使用荧光活性位置引导的不可逆的抑制剂特异性活化的半胱氨酸蛋白酶-1和半胱氨酸蛋白酶-3&7(CarboxyfluoresceinFLICAApoptosisDetectionKit；ImmunochemistryTechnologiesLLC，布卢明顿，明尼苏达州)来直接在Nucleopore薄膜上染色吸出的细胞。将该具有固定的吸出细胞的薄膜切成一半，并且用1：700稀释的FAM-YVAD-FMK(FLICA-1)染色剂染色来检测活化的半胱氨酸蛋白酶-1，或者用FAM-DEVD-FMK(FLICA3&7)染色剂染色来检测活化的半胱氨酸蛋白酶-3&7。获得了来自正常外观的末端回肠的四个黏膜活组织检查样品用于分析(对照N＝3，IBDN＝3)，将两个活组织检查样品置于液氮中，并且存储在-80℃，直到用于细胞因子检测。将两个活组织检查样品植入OCT(Tissue-Tek，Torrence，CA)中，置于液氮中，并且存储在-80℃，直到制备区域。

试剂

购买了尼日利亚菌素(Invitrogen，Burlington，ON)，Ac-YVAD-CMK(AlexisBiochemicals，Farmingdale，NY)，不同直径(0.5-6μm)的Fluoresbrite^TM黄绿色羧酸酯微球(PolysciencesInc，Warrington，PA)。IV类型菌毛是由绿脓杆菌菌株K，用前述方法制备的，特征在于经由SDS-PAGE的纯度，结合到asialo-GM1而非GM1上的能力，和结合到不锈钢上的能力。该菌毛制品包含低量的绿脓杆菌血清型05LPS，其不能在银染色的SDS-PAGE凝胶上检测。埃希氏大肠杆菌TMW2.497是一种大肠杆菌JM109衍生物，其在质粒pQBI-63上带有用于绿色荧光蛋白质(GFP)的基因编码，其是Dr.M.Gantzle的惯例。

细胞培养和体外渗透性的测量

将T84人类大肠癌上皮细胞保持在Dulbecco的最小基本介质(DMEM)/F-12，10％(v/v)热失活的小牛血清(FBS)，1％(w/v)青霉素-链霉素中的组织培养板(10cm)中。将该细胞置于Transwells(2×10⁵个细胞/孔，6.5mm直径；0.4μm孔尺寸；CorningLifeSciences，Tewksbury，MA)中，并且培养直到形成用于研究的顶部连接复合物(如经上皮电阻>2000Ω·cm²来指征)。对于半胱氨酸蛋白酶-1抑制实验，在尼日利亚菌素处理之前，除去组织培养介质，并且引入具有50M半胱氨酸蛋白酶-1抑制剂(Ac-YVAD-CMK)的新介质。将尼日利亚菌素(10，25，50M)加入到Transwell的顶点和基底外层方面二者中。经上皮电阻(TER)是在尼日利亚菌素处理之前和3h后，使用Millicell-ERS伏特计和chopstick电极(Millipore，Bedford，MA)来测量的。对于微球和大肠杆菌实验，在用尼日利亚菌素培养一整夜之后，将10⁷/ml的1μm微球或者10⁹/ml的大肠杆菌TMW2.497加入到Transwell的顶点面。在用微球或者大肠杆菌培养一小时后，将该细胞在冷甲醇中固定5分钟。然后将细胞在0.2％(v/v)TritonX-100中渗透15min，并且在PBS中用0.2％(v/v)山羊血清和1％(w/v)BSA封闭1小时。

蛋白质提取

将人类活组织检查样品和啮齿动物回肠组织在冰上的裂解缓冲液(0.01M的PBS，0.5％(v/v)Tween20，和Halt蛋白酶抑制剂(包含二甲基亚砜和4-(2-氨乙基)-苯磺酰氟，ThermoScientific，Pittsburgh，PA)中均化，用于蛋白质提取。将含蛋白质的上清液通过13,000g和4℃离心分离30min来分离，并且存储在-70℃，直到分析。

细胞因子表达检测

来自人类样品的活性IL-1β的浓度是用人类IL-1βUltra-SensitiveKit(MesoScaleDiscovery，Gaithersburg，MD)来测量的。小鼠肠组织中的活性IL-1β表达是用MouseProInflammatory7-PlexUltra-SensitiveKit(MesoScaleDiscovery，Gaithersburg，MD)来测量的。将所形成的细胞因子规格化，用于每个单个样品的总蛋白质含量，其是通过二喹啉甲酸检测(Pierce，Rockford，IL)来测定的。

免疫印迹分析

人类活组织检查组织，小鼠回肠黏膜碎屑和T84细胞是在含有蛋白酶抑制剂的M-PERMammalianProteinExtractionReagent(ThermoScientific，Pittsburgh，PA)中消解的。将全部的细胞溶解物(规格化用于样品的50μg蛋白质)加载在15％的SDS–PAGE凝胶中，并且进行随后的蛋白质电泳转移到硝基纤维素薄膜上。将薄膜在室温(RT)用ODYSSEY封闭缓冲液(InfraredImagingSystem，Marysville，OH)封闭1小时，并且在4℃用IL-1β抗体(CellSignalingTechnology，Danvers，MA)或者半胱氨酸蛋白酶-1抗体(Abcam，Cambridge，MA)探针化一整夜，具有β-肌动蛋白抗体充当负载对照物(CellSignalingTechnology，Danvers，MA)。在清洗后，将薄膜用荧光次级抗体在室温培养1小时，并且通过LI-COROdyssey*(InfraredImagingSystem，Marysville，OH)分析。

细胞培养和肠样品的免疫荧光分析

将来自半胱氨酸蛋白酶-1活化和渗透性实验的细胞培养样品在冷甲醇中固定5分钟，用初级兔子抗-ZO-1抗体(Invitrogen，Burlington，ON)在4℃培养一整夜。清洗后，将该细胞用1：150稀释的用于半胱氨酸蛋白酶-1活化的FLICA-1染色培养或者用山羊抗兔子IgGAlex546抗体(Invitrogen，Burlington，ON)培养，并且用DAPI复染。然后将支持单层的薄膜切离，并且安装到载玻片(DakoCy-mationMountingMedium，Carpentaria，CA)上。在用1：50稀释的用于活化的半胱氨酸蛋白酶-1的FLICA-1染色，和1：50稀释的用于活化的半胱氨酸蛋白酶-3&7的FLICA3&7染色(ImmunochemistryTechnologiesLLC，Bloomington，MN)之前，将冷冻的人类活组织检查样品分段成5μm，空气干燥，和丙酮固定。分段然后用4％仲甲醛在室温后固定15min，并且用用于F-肌动蛋白的若丹明-鬼笔环肽(Invitrogen，Burlington，ON)和用于核的DAPI染色。

啮齿动物肠冻结组织块是使用低温箱在5μm分段的，在室温放置30分钟，在4％的在PBS中新制备的仲甲醛固定30分钟。将载玻片用PBS清洗10min，用2％的山羊血清和1％的在PBS中的BSA在室温封闭1小时，在0.2％的Triton-X100在2％山羊血清和1％的在PBS中的BSA渗透化30min。载玻片是如下来染色的：用在PBS中1：40稀释的Alexa568偶联的鬼笔环肽培养1小时，多余的荧光染料用50mlPBS进行3X15min冲洗来除去，用DAPI复染。使用FluorSavereagent(Calbiochem)作为封固剂，安装载玻片用于显微镜法检查。

增殖细胞核抗原(PCNA)染色

使用以前公开的方法，将小鼠末端回肠组织用兔子抗-PCNA抗体(Abcam，Cambridge，MA)染色。在用PCNA染色之后，将所述段用DAPI染色，并且用Zeiss倒置显微镜(Zeiss，Toronto，Ontario)成像。PCNA-阳性细胞是由两个盲评师计数的，最小5个绒毛/动物。

体内渗透性检测

体内渗透性是用FITC-右旋糖苷渗透，荧光微球和细菌迁移研究来评价的。对于右旋糖苷研究，在禁食，并且可以自由取水一整夜之后，将小鼠用0.6μg/kgFITC-右旋糖苷(FD-4，4kD；SigmaAldrich，St.Louis，MO)强饲。在强心剂穿刺后4小时收集血液样品，将血清在1,957xg在4℃离心20分钟。在TyphoonVariableMode成像仪(GEHealthcare，Piscataway，NJ)上使用488nm激光器测量上清液的荧光发射。

对于微球研究，如前所述，在禁食一整夜之后，给小鼠强饲这样的混合物，其含有在200μl溶液中的10⁷YG微球(直径为0.5，1.0，2.0，3.0和6.0μm)。在所述珠子给药4小时之后收集血液样品。在进行流式细胞测量法分析之前，全血混合物然后在1250Xg在预先肝素化的管中室温离心分离10min，将该样品的血浆部分除去，并且在1250Xg离心分离5min。将样品其余的淡黄色覆层和分血器用5mL消解缓冲液(4.15gNH₄Cl，0.84gNaHCO₃，1ml0.5mMEDTA，pH8，和500mL的ddH₂O)在室温消解，在1,250Xg混合和离心分离5min，其在4℃进行3次。将上清液废弃。将WBC小粒和小牛白蛋白重新悬浮在400μl的0.03％PBS中。将血浆和WBC小粒样品用流式细胞测量法分析，来测定微球计数。

对于细菌迁移研究，给小鼠强饲1x10¹⁰CFU的GFP标记的大肠杆菌，其悬浮在0.17mL的LB营养液中。20小时后，在消毒的外科条件下收集脾脏和肝脏样品。将该器官悬浮在具有LB营养液的预先称重的管中，用消毒的无RNA酶的塑料钵均化5-10分钟。将均化物离心，并且将上清液以不同的稀释比置于四个板中，用于培养。

共聚焦激光显微内镜和共焦显微镜法

用前述方法，进行了小鼠回肠的共聚焦激光显微内镜和全套小鼠肠组织的共焦显微镜测定，来测定上皮间隙密度。细胞培养，人类和小鼠肠载玻片是使用旋转盘共焦显微镜(QuorumTechnologiesInc，Guelph，ON)，用前述方法来成像的。

电子显微镜法

将对照的和尼日利亚菌素处理的T84细胞用2％(v/v)戊二醛在4℃固定一整夜，所述戊二醛是用0.1M甲次砷酸盐-HCl在pH7.4缓冲的。在固定之后，将它们在甲次砷酸盐缓冲液中清洗，并且在1％(w/v)四氧化锇中后固定2小时，然后在甲次砷酸盐缓冲液中重新清洗。在分级系列的乙醇浓度中脱水之后，将样品置于环氧丙烷的几个清洗中，随后植入环氧树脂(EPON12)中。超薄段是用乙酸铀酰和柠檬酸铅对比的，并且用Hitashi7650透射电子显微镜在60kV的加速电压进行检查。记录视野，并且以1000-4800的最终放大倍率印刷，借助于碳栅复制进行校正。

统计分析

使用通过GraphPad计算的Wilcoxon级和测试(LaJolla，CA)Prism4来比较所述样品。小于0.05的两侧P值被认为是有意义的。对于多个比较，进行了Bonferroni调整。

C2.实验：IEC间隙方法

方法

这是在ClinicalTrial.Gov(NCT00988273)注册的一种前瞻性群组研究。研究协议是由Alberta大学的人类道德研究评审部进行评审和批准的。研究组由具有基于RomeIII标准与IBS一致的症状的患者组成。对照组是由这样的患者组成，其进行了结肠镜检查来用于没有IBS症状的其他指征，大部分通常的结肠直肠癌筛查和阳性粪便渗血测试。研究所包括的标准是：患者年龄超过18岁和能够给出知情同意书。排除的标准包括：对于荧光素或甲壳动物已知的敏感症，肾功能受损(血清肌酸酐超过1.5mg/dL)，和怀孕或者育儿患者。全部患者给出了同意参加所述研究的知情同意书。患者人口统计，病史，体检结果和内窥镜结果被记录在透视数据库中。

我们进行了常规的结肠镜检查，在全部患者中对末端回肠进行了插管。患者进行了常规的心肺监控和接受了用咪达唑仑和芬太尼的静脉内镇静。根据需要使用止痉挛试剂(胰高血糖素)来减少蠕动和移动人为现象。在末端回肠插管之后，静脉内给药5mL的10％荧光素溶液。末端回肠的共焦图像是用超高清晰度探针基共聚焦激光显微内镜(pCLE)探针(UHDColoflex，MaunaKeaTechnologies，法国巴黎)，依照以前报告的协议来获得的。收集了回肠瓣附近大约10cm处末端回肠的逐帧共焦图像，并且数字存储用于分析。使用pCLE对末端回肠中最少5个不同的位置进行了成像。该pCLE成像通常在回盲肠瓣的10cm处开始，随后在初始成像位置相邻5-10cm处从肠表面取样5-10个位置。在全部患者中连续记录pCLE图像视频大约10分钟，并且每个患者记录超过4000个图像。虽然进行pCLE的内窥镜医生对于患者的情况不是不知晓的，但是pCLE图像的评审师对于患者的情况和结肠镜检查的信息是不知晓的，来使得偏见最小。

pCLE图像的评审和分析是以前述的事后方式来进行的。充分成像的绒毛被定义为超过75％的表面积在pCLE图像中可见的绒毛，并且选择最少三个连续的绒毛观察图来分析上皮细胞和间隙。在这些绒毛图像中，计数了任何单个患者的绒毛中的上皮细胞和间隙，其在所观察的间隙中具有最高的频率(范围：3-10个绒毛/患者)。所计数的绒毛代表性图像显示在图1中。绒毛中上皮细胞和间隙是手工计数的，并且使用任何单个患者的最高频率的上皮间隙来测定间隙密度(范围：3-10个绒毛/所评价的每个患者)。间隙密度是作为在充分成像的绒毛中所计数的上皮间隙数/1000个上皮细胞来计算的。

初级研究端点是上皮间隙密度的群组比较，其是通过IBS和对照患者中的pCLE来确定的。我们还进行了探测分析来检查上皮间隙密度和性别、年龄以及IBS亚型(IBS-腹泻为主的与IBS-便秘为主的相比)之间的关系。

统计分析

样品尺寸计算：

样品尺寸计算是基于来自我们以前的研究的无症状和IBS患者的上皮间隙密度数据来进行的。²⁴假定了10个间隙/1000个细胞的平均间隙密度和10个间隙/1000个细胞的标准偏差中的差异，总共32个患者(16个/组)将需要实现80％的功效，并且类型I的误差(α)是0.05。因为打算使用非参数方法，因此对于总共35个患者，患者登记增加了大约10％。

研究的初级端点是上皮间隙密度，使用Wilcoxon级和测试进行了对照患者和IBS患者之间的比较。正态分布的连续变量表达为平均值±标准偏差，而非正态分布的连续变量表达为中值(四分差范围)。使用Shapiro-Wilk测试来评价了上皮间隙密度分布的正态性。另外的分析使用了非参数方法，包括Wilcoxon级和测试，Spearman相关法和中值回归。对于该初级分析，小于0.05的两侧P值被认为是有意义的。全部分析是使用STATA数据分析和统计软件(StataCorpLP，CollegeStation，Texas)来进行的。

虽然已经在具体的方面、实施方案和应用方面描述了本发明，但是将理解可以进行不同的改变和变化，而不脱离所要求保护的本发明。