用于鉴定日本血蜱的靶序列、引物、鉴定方法及试剂盒

摘要

本发明提供了用于鉴定日本血蜱的靶序列、引物、鉴定方法及试剂盒，属于蜱虫检测与鉴定技术领域。所述靶序列如SEQ？ID？NO.1所示，是首次扩增出的日本血蜱COI全长序列的一段。本发明提供了可特异性扩增日本血蜱COI部分序列的引物对，分别如SEQ？ID？No.2-5所示，通过两次PCR反应可实现对日本血蜱快速、准确的鉴定。本发明克服了传统日本血蜱分类鉴定对标本完成性要求高、对鉴定者的专业分类水平要求高等诸多问题，提供的PCR引物及鉴定方法以及试剂盒操作方便，灵敏度高、特异性强、简单快速、成本低，能够满足日本血蜱快速、准确的物种分子鉴定需求，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及蜱虫检测与鉴定技术领域，具体地涉及用于鉴定日 本血蜱(Haemaphysalisjaponica)的靶序列、特异性引物对、鉴定 方法及试剂盒。

背景技术

日本血蜱(Haemaphysalisjaponica)属硬蜱科，血蜱属，广泛分 布于我国北方林区或山地地区(包括黑龙江、吉林、辽宁、河北、宁 夏、甘肃、青海和山西等)。其国外分布区域包括日本、朝鲜以及俄 罗斯远东地区。其成蜱寄生对象范围较广，包括马、山羊、牦牛、野 猪等大型哺乳动物，也侵袭人。其幼蜱和若蜱寄生于鸟类和啮齿类动 物。该蜱是一种重要的医学媒介，为森林脑炎的主要传播媒介。

目前，日本血蜱的物种鉴定主要依靠形态学特征，该鉴定方法对 鉴定者的专业知识和蜱虫样本完整性均要求较高，又由于蜱虫类易与 形态近似种混淆，造成日本血蜱的鉴定结果费时、费力且准确度和重 复性都不高。近年来，分子生物学技术已经被广泛应用于物种鉴定， 目前在日本血蜱的鉴定方面还没有相关报道，且Genbank数据库中也 没有日本血蜱的相关序列信息。

发明内容

本发明的第一个目的在于克服现有检测技术的不足，提供一种用 于鉴定日本血蜱的特异性靶序列。

本发明的第二个目的在于提供用于扩增特异性靶序列的引物对。

本发明的第三个目的在于提供鉴定日本血蜱的方法及试剂盒。

为实现上述目的，本发明首先利用本发明设计的蜱虫COI全长序 列扩增引物对日本血蜱的COI序列进行扩增。

COI-CF：5’-ATTTTACCGCGATGAATATTYTC-3’；(SEQID NO.6)

COI-CR：5’-TTATTTTAAAATAATRTT-3’(SEQIDNO.7)。

上述序列中，Y和R分别为兼并引物，Y＝C/T，R＝A/G。

COI-CF与COI-CR扩增出日本血蜱的COI全长序列，长1539bp， 其电泳图如图1所示。

本发明根据扩增引物COI-CF和COI-CR扩增的日本血蜱的COI全 长序列，通过MEGA软件中CLUSTALW程序，将该序列与Genbank数 据库中同属其他血蜱COI序列进行比对分析，共设计正向引物3条， 反向引物3条。经实际PCR扩增验证，确定正向引物HJ-F以及反向引 物HJ-R扩增效果良好。HJ-F/HJ-R引物设计BLAST比对结果如图2，3 所示。但是，HJ-F/HJ-R扩增特异性较差，如图4所示。除了日本血蜱， 长角血蜱COI序列也可被扩增，而调整退火温度，调整镁离子浓度都 不能消除非日本血蜱相关COI序列的扩增。为了特异性鉴定日本血 蜱，本发明设计了另一对扩增引物，用于扩增非日本血蜱相关COI序 列。本发明根据扩增引物COI-CF和COI-CR扩增的日本血蜱的COI全 长序列，通过MEGA软件中CLUSTALW程序，将该序列与Genbank数 据库中同属其他血蜱COI序列进行比对分析，设计出HL-F/HL-R扩增 引物对。经实际PCR扩增验证，确定HL-F/HL-R可有效扩增非日本血 蜱序列，而不能扩增日本血蜱序列，与HJ-F/HJ-R引物对配合，可特 异性鉴定日本血蜱。HL-F/HL-R引物设计BLAST比对结果如图4，图5 所示。

日本血蜱特异性引物并进行PCR扩增，获得300bp的DNA特异性 条带，对其进行测序、BLAST比对，确定该特异性DNA序列可作为 鉴定日本血蜱的特异性DNA序列，用于鉴定日本血蜱(Haemaphysalis japonica)。

本发明首先提供一种用于鉴定日本血蜱(Haemaphysalis japonica)的靶序列，其具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。

本发明提供了上述靶序列在鉴定日本血蜱中的应用。

用于上述靶序列的特异性引物对属于本发明的保护范围。

本发明提供了特异性扩增上述靶序列的特异性引物组合，包括 第1对正向引物HJ-F：5'-TACCTCCATCCTTATTCTTAC-3'(如SEQ IDNO.2)；

第1对反向引物HJ-R：5'-CACCTGCTAAAACAGGTAGA-3'(如 SEQIDNO.3)；

第2对正向引物HL-F：5'-TGCTTGAGCCGGAATGCTAGGTC-3' (如SEQIDNO.4)；

第2对反向引物HL-R：5'-TAGAACTGATCAAACAAATA-3'(如 SEQIDNO.5)

本发明提供了上述特异性引物组合在制备鉴定日本血蜱 (Haemaphysalisjaponica)试剂盒中的应用。

进一步，本发明提供鉴定日本血蜱(Haemaphysalisjaponica) 的方法，以待测昆虫样品总DNA为模板，以SEQIDNo.1所示的靶 序列为目标，分别进行2次PCR扩增，第1次PCR以SEQIDNO.2、 3为引物，第2次PCR以SEQIDNO.4、5为引物，根据两次扩增 产物电泳的目的条带判定结果。

更进一步地，若第1次PCR扩增产物电泳结果出现清晰且亮度 高的300bp大小的条带，并且第2次PCR扩增产物电泳结果不出现 清晰的499bp大小的条带，则待测昆虫样本为日本血蜱。

本发明的鉴定日本血蜱(Haemaphysalisjaponica)的方法中， 50μlPCR反应体系为：10×PCRbuffer5μl、10mM上、下游引物 各2μl、10mMdNTPs2μl、50U的Taq酶1μl，10～20ngDNA模 板2μl，加灭菌双蒸水至50μl；

PCR反应程序：预热94℃，5min；94℃30s，60℃30s，72℃ 30s，共36个循环；延伸72℃，7min，4℃保存。

本发明方法中的2次PCR反应体系和反应程序均相同。

本发明还提供一种用于鉴定日本血蜱(Haemaphysalisjaponica) 的试剂盒，含有2个特异性引物对，核苷酸序列分别如SEQIDNO.2、 3所示和如SEQIDNO.4、5所示。

本发明提供了该试剂盒在鉴定日本血蜱(Haemaphysalis japonica)中的用途。

本发明的优点在于，本发明填补了目前GenBank中没有日本血 蜱COI特异性DNA序列的空白，提供了用于鉴定日本血蜱的靶序 列。本发明还克服了传统日本血蜱鉴定对标本完整性要求高、需要 专业分类专家、鉴定成本高等问题，提供的鉴定日本血蜱的PCR引 物及鉴定方法弥补现有检测技术的不足，操作简便快捷，灵敏度高、 特异性强、简单快速、成本低，提高了日本血蜱鉴定的效率和准确 性，能够满足日本血蜱快速、准确的物种分子鉴定需求。适用于日 本血蜱分布调查，种群分析及相关蜱传疫病的控制等研究分析工作， 具有重要的理论意义和应用价值。

附图说明

图1本发明设计蜱虫COI全长序列扩增引物对COI-CF/COI-CR， 并用引物对扩增日本血蜱的COI全长序列。PCR扩增产物1％琼脂糖凝 胶电泳图；其中M：DL2000Marker；1：1#日本血蜱(Haemaphysalis japonica)

图2为本发明设计的日本血蜱第1对正向扩增引物HJ-F序列与 Genbank数据库以及本发明扩增的同属其他血蜱COI序列进行BLAST 比对分析的结果；其中1：HJ-F引物序列；2：本发明扩增的1#日本血 蜱(Haemaphysalisjaponica)COI序列；3：本发明扩增的2#日本血蜱 (Haemaphysalisjaponica)COI序列；4：本发明扩增的1#草原血蜱 (Haemaphysalisverticalis)COI序列；5：本发明扩增的1#嗜群血蜱 (Haemaphysalisconcinna)COI序列；6：本发明扩增的2#嗜群血蜱 (Haemaphysalisconcinna)COI序列；7：本发明扩增的1#长角血蜱 (Haemaphysalislongicornis)COI序列；8：Genbank数据库中的硕 鼠血蜱(Haemaphysalishumerosa)COI序列；9：Genbank数据库中的 长棘血蜱(Haemaphysalispunctata)COI序列；10：Genbank数据库 中的狐猴血蜱(Haemaphysalislemuris)COI序列；11：Genbank数据 库中的褐黄血蜱(Haemaphysalisflava)COI序列；

图3为本发明设计的日本血蜱第1对反向扩增引物HJ-R序列与 Genbank数据库以及本发明扩增的同属其他血蜱COI序列进行BLAST 比对分析的结果；其中1：HJ-R引物序列；2：本发明扩增的1#日本血 蜱(Haemaphysalisjaponica)COI序列；3：本发明扩增的2#日本血蜱 (Haemaphysalisjaponica)COI序列；4：本发明扩增的1#长角血蜱 (Haemaphysalislongicornis)COI序列；5：本发明扩增的1#草原血 蜱(Haemaphysalisverticalis)COI序列；6：本发明扩增的1#嗜群血 蜱(Haemaphysalisconcinna)COI序列；7：Genbank数据库中的硕 鼠血蜱(Haemaphysalishumerosa)COI序列；8：Genbank数据库中的 褐黄血蜱(Haemaphysalisflava)COI序列；9：Genbank数据库中的 长棘血蜱(Haemaphysalispunctata)COI序列；10：Genbank数据库 中的狐猴血蜱(Haemaphysalislemuris)COI序列；

图4为本发明设计的日本血蜱第2对正向扩增引物HL-F序列与 Genbank数据库以及本发明扩增的同属其他血蜱COI序列进行BLAST 比对分析的结果；其中1：HL-F引物序列；2：本发明扩增的1#长角 血蜱(Haemaphysalislongicornis)COI序列；3：本发明扩增的1#日 本血蜱(Haemaphysalisjaponica)COI序列；4：本发明扩增的1#嗜群 血蜱(Haemaphysalisconcinna)COI序列；5：本发明扩增的1#草原 血蜱(Haemaphysalisverticalis)COI序列；6：Genbank数据库中的褐 黄血蜱(Haemaphysalisflava)COI序列；7：Genbank数据库中的硕 鼠血蜱(Haemaphysalishumerosa)COI序列；8：Genbank数据库中的 狐猴血蜱(Haemaphysalislemuris)COI序列；9：Genbank数据库中 的长棘血蜱(Haemaphysalispunctata)COI序列；

图5为本发明设计的日本血蜱第2对反向扩增引物HL-R序列与 Genbank数据库以及本发明扩增的同属其他血蜱COI序列进行BLAST 比对分析的结果；其中1：HL-R引物序列；2：本发明扩增的1#长角 血蜱(Haemaphysalislongicornis)COI序列；3：本发明扩增的1#日 本血蜱(Haemaphysalisjaponica)COI序列；4：本发明扩增的1#嗜群 血蜱(Haemaphysalisconcinna)COI序列；5：本发明扩增的1#草原 血蜱(Haemaphysalisverticalis)COI序列；6：Genbank数据库中的褐 黄血蜱(Haemaphysalisflava)COI序列；7：Genbank数据库中的硕 鼠血蜱(Haemaphysalishumerosa)COI序列；8：Genbank数据库中的 狐猴血蜱(Haemaphysalislemuris)COI序列；9：Genbank数据库中 的长棘血蜱(Haemaphysalispunctata)COI序列；

图6为用本发明设计的第1对特异性PCR引物HJ-F和HJ-R对蜱 虫DNA样本进行PCR检测的1％琼脂糖凝胶电泳图；其中M： DL2000Marker；1：1#长角血蜱(Haemaphysalislongicornis)；2:2# 长角血蜱(Haemaphysalislongicornis)；3：3#长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)；4：1#日本血蜱(Haemaphysalisjaponica)；5：2#日本 血蜱(Haemaphysalisjaponica)；6:1#亚洲璃眼蜱(Hyalomma asiaticum)；7:2#亚洲璃眼蜱(Hyalommaasiaticum)；8：1#草原血 蜱(Haemaphysalisverticalis)；9:2#草原血蜱(Haemaphysalis verticalis)；10：草原革蜱(Dermacentornuttalli)；11：1#嗜群血蜱 (Haemaphysalisconcinna)；12：2#嗜群血蜱(Haemaphysalis concinna)。

图7为用本发明设计的第2对特异性PCR引物HL-F和HL-R对蜱 虫DNA样本进行PCR检测的1％琼脂糖凝胶电泳图；泳道编号对应 的检测对象同图1。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明 的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步 骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

本发明的长角血蜱采自北京，嗜群血蜱、草原血蜱、日本血蜱 采自黑龙江，亚洲璃眼蜱采自内蒙古，草原革蜱采自新疆。目前所 有样品均保存于中国检验检疫科学研究院。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所 熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。

实施例1日本血蜱特异性靶序列的确定与扩增其的引物设计

利用发明者设计的蜱虫COI全长序列扩增引物COI-CF/COI-CR对 日本血蜱(Haemaphysalisjaponica)COI的全长序列进行PCR扩增并 测序，首次扩增出日本血蜱的COI序列中的一段，长1539bp，其电泳 图如图1所示。

COI-CF：5’-ATTTTACCGCGATGAATATTYTC-3’；(SEQID NO.4)

COI-CR：5’-TTATTTTAAAATAATRTT-3’(SEQIDNO.5)。

本发明根据COI-CF/COI-CR扩增的草原血蜱的COI序列，通过 MEGA软件中CLUSTALW程序，将该序列与Genbank数据库中同属其 他血蜱COI序列进行比对分析，确定日本血蜱COI高度保守序列。设 计日本血蜱特异性引物，共设计正向引物3条，反向引物3条。经实际 PCR扩增验证，确定正向引物HJ-F以及反向引物HJ-R扩增效果良好。 HJ-F/HJ-R引物设计BLAST比对结果如图2，图3所示。

本发明经过反复筛选获得的特异性扩增该靶序列的特异性引物 对，第1对正向引物序列HJ-F：5'-TACCTCCATCCTTATTCTTAC-3' (如SEQIDNO.2所示)

第1对反向引物序列HJ-R：5'-CACCTGCTAAAACAGGTAGA-3' (如SEQIDNO.3所示)

第2对正向引物HL-F：5'-TGCTTGAGCCGGAATGCTAGGTC-3' (如SEQIDNO.6所示)

第2对反向引物HL-R：5'-TAGAACTGATCAAACAAATA-3'(如 SEQIDNO.7所示)

设计的另外4条引物序列如下：

HJ-F1：5’-TCCATCCTTATTCTTAC-3’

HJ-R1：5’-TGCTAAAACAGGTAG-3’

HJ-F2：5’-CTGACTTTTACCTCCATCC-3’

HJ-R2：5’-GTATAAAATTGGATCCCCG-3’

上述四条引物，经实际PCR扩增验证，其相比HJ-F/HJ-R，其扩 增特异性更差，甚至革蜱与璃眼蜱属样品也有相应大小扩增条带出 现，因此本发明选择HJ-F/HJ-R作为日本血蜱的特异性扩增引物。

采用HJ-F/HJ-R为引物对，并进行PCR扩增，获得300bp的DNA 特异性条带，对其进行测序、BLAST比对，确定该特异性DNA序列 可作为鉴定日本血蜱的特异性DNA序列(SEQIDNo.1所示)，用于鉴 定日本血蜱(Haemaphysalisjaponica)。

实施例2鉴定日本血蜱的PCR方法的建立

1、样品处理及DNA基因组提取

将1#长角血蜱Haemaphysalislongicornis；2#长角血蜱 Haemaphysalislongicornis；3#长角血蜱Haemaphysalislongicornis；1# 日本血蜱Haemaphysalisjaponica；2#日本血蜱Haemaphysalis japonica；1#亚洲璃眼蜱Hyalommaasiaticum；2#亚洲璃眼蜱Hyalomma asiaticum；1#草原血蜱Haemaphysalisverticalis；2#草原血蜱 Haemaphysalisverticalis；草原革蜱Dermacentornuttalli；1#嗜群血蜱 Haemaphysalisconcinna；2#嗜群血蜱Haemaphysalisconcinna；样本用 蒸馏水洗净，分别置于1.5ml离心管中，加入200μl裂解缓冲液(10 mmol/LTris-HClpH8.0；50mmol/LNaCl；0.45％Tween20；0.45％ NP-40)，用研磨棒将样品研碎，涡旋混匀，再加入10μl蛋白酶K(100 μg/ml)，56℃消化过夜。然后95℃处理5分钟，12000rpm离心5分钟， 转移上清至新的离心管中，得到基因组DNA，可用于PCR扩增。

2、特异性PCR扩增第1对引物反应体系为50μl，加入10×PCR buffer5μl、PCR引物对(10mM)各2μl、dNTPs(10mM)2μl、Taq 酶(50U)1μl以及10～20ngDNA模板2μl，加灭菌双蒸水至50μl。 以灭菌双蒸水为阴性对照。PCR反应程序：预热94℃，5min； 94℃30s，60℃30s，72℃30s，共36个循环；末次延伸72℃，7min， 4℃保存。

第2对引物反应体系为50μl，加入10×PCRbuffer5μl、PCR引物 对(10mM)各2μl、dNTPs(10mM)2μl、Taq酶(50U)1μl以及 10～20ngDNA模板2μl，加灭菌双蒸水至50μl。以灭菌双蒸水为阴 性对照。PCR反应程序：预热94℃，5min；94℃30s，60℃30s，72℃ 30s，共36个循环；末次延伸72℃，7min，4℃保存。

取5μlPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示，日 本血蜱样品的第1对引物扩增体系电泳结果出现清晰且亮度较高的 300bp大小的条带，同时，如图7所示，日本血蜱样品的第2对引物扩 增体系电泳结果没有499bp大小的清晰条带；反之，其他蜱虫或非蜱 虫样本的第1对引物扩增体系无300bp条带出现或出现拖尾、引物二 聚体等非特异性扩增，或出现300bp条带而其第2对引物扩增体系电泳 也出现499bp扩增条带。说明本发明的方法特异性好，准确度高。

实施例3鉴定日本血蜱的试剂盒及应用

1、试剂盒的构成：裂解缓冲液(10mmol/LTris-HClpH8.0； 50mmol/LNaCl；0.45％Tween20；0.45％NP-40)；蛋白酶K (100μg/ml)；

第1对正向引物HJ-F：5'-TACCTCCATCCTTATTCTTAC-3' (10mmol/L)；

第1对反向引物HJ-R：5'-CACCTGCTAAAACAGGTAGA-3' (10mmol/L)；

第2对正向引物HL-F：5'-TGCTTGAGCCGGAATGCTAGGTC-3'；

第2对反向引物HL-R：5'-TAGAACTGATCAAACAAATA-3'；

Taq酶(50U/μl)；10×PCRbuffer；dNTPs(10mM)；日本血蜱鉴 定操作说明书。

2、具体操作步骤：

(1)取疑似日本血蜱样品，用剪刀剖开其几丁质外壳，镊子取 出其内部肌肉组织0.1～0.2g，放入1.5mlEP管中，加入500μl裂解缓 冲液用研磨棒将样品研碎；再加入500μl裂解缓冲液、10μl蛋白酶K， 涡旋混匀；56℃消化过夜；然后95℃处理5分钟；12000rpm离心5 分钟；将上清的DNA样品至新的离心管中备用。

(2)配制第1对引物PCR反应体系：

试剂 体积(μl) 10×PCR buffer 5 HJ-F 2 HJ-R 2 dNTPs 2 Taq酶 1 DNA模板 2 双蒸水 补足至50μl

(3)第1对引物PCR反应程序设置：预热94℃，5min；94℃30s， 60℃30s，72℃30s，共36个循环；末次延伸72℃，7min，4℃保存。 (4)配置第2对引物PCR反应体系：

试剂 体积(μl) 10×PCR buffer 5

HL-F 2 HL-R 2 dNTPs 2 Taq酶 1 DNA模板 2 双蒸水 补足至50μl

(5)第2对引物PCR反应程序设置：预热94℃，5min；94℃30s， 60℃30s，72℃40s，共36个循环；末次延伸72℃，7min，4℃保存。

(6)1.0～1.5％琼脂糖电泳检测，PCR产物及DNAMarker各取出 6μl上样，120V电泳30min。

(7)紫外照相。第1对引物PCR扩增体系电泳结果出现清晰且亮 度较高的300bp大小的条带，同时第2对引物PCR扩增体系电泳结果不 出现清晰的499bp大小的条带，样本为日本血蜱；反之，如第1对引 物扩增体系无300bp条带出现或出现拖尾、引物二聚体等非特异性扩 增，则为其他蜱虫或非蜱虫样本。

本发明的试剂盒可用于对日本血蜱进行快速鉴定，具有特异性 强、准确率高、低成本的特点，操作简便，适用于日本血蜱分布调 查，种群分析及相关蜱传疫病的控制等研究分析工作。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了 详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这 对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。