抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体及其应用

摘要

本发明公开了一种抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体。本发明还公开了诊断猪流行性腹泻病毒感染的试剂盒，其包含上述单克隆抗体。本发明还公开了该单克隆抗体的制备方法和应用。本发明抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体，与猪流行性腹泻病毒具有良好的反应性，适用于快速准确地诊断PEDV，同时为监测、预防PEDV提供重要的技术支撑，具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体 及其应用。

背景技术

猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea,PED)是由冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒 (porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)引起的一种急性、高度接触性猪肠道传染病，此病 以猪的呕吐、腹泻、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征。1978年，该病在比利时与英国 被首次报道。随后，在匈牙利、意大利、中国、日本、泰国、美国和韩国等国家也陆续发现 该病。自2010年底以来，PEDV变异体给中国养猪行业造成巨大的经济损失。2013年，美国 也爆发PEDV变异病毒。近年来，PEDV是引起中国和美国仔猪死亡的一个重要病原体。PEDV 基因组全长约为28kb，包含7个开放阅读框能够编码4个主要的结构蛋白：纤突蛋白(spike, S)、包膜蛋白(envelope,E)、膜糖蛋白(membrane,M)、核衣壳蛋白(nucleocapsid,N)和3 种非结构蛋白：复制酶1a和1b，ORF3。其中N蛋白在PEDV的结构蛋白中所占的比例较大， 具有较强的抗原性，不仅能够诱导宿主T细胞和B细胞免疫反应，而且在病毒感染早期，机 体内能够产生较高水平的抗N蛋白抗体(孙东波,冯力,时洪艳,等，2006)。N蛋白为螺旋 病毒粒子提供一个结构基础，是一个与基因组相关联的碱性磷蛋白。

猪感染PEDV后，如果仅依据临床症状、病理变化和流行病学很难做出正确的诊断，特 别是与传染性胃肠炎(TGE)不易区别，必须依靠实验室技术才能作出正确诊断。目前诊断 PEDV感染的方法有间接血凝试验(IHA)、免疫电镜(IEM)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、 免疫荧光(IF)、RT-PCR等，其中免疫荧光和酶联免疫吸附试验较为常见(邓祖丽颖，2013； 郑逢梅,赵军,霍金耀,等，2013)。但这些现有的诊断技术较为耗时、耗力，无法在临床上 广泛应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体，该单克 隆抗体可用于快速准确地诊断猪流行性腹泻病毒(PEDV)。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体。

优选的，所述猪流行性腹泻病毒N蛋白具有SEQIDNO.1所示氨基酸序列。

更优选的，所述抗体是由杂交瘤细胞株CCTCCNO.C2014136分泌的单克隆抗体。

在本发明的另一方面，还提供了一种重组载体，其包含编码SEQIDNO.1所示氨基酸序 列的核苷酸序列。

所述重组载体的空载体包括原核表达载体或真核表达载体。

在本发明中，原核表达载体优选pColdIDNA原核表达载体。

在本发明的另一方面，还提供了一种宿主细胞，其包含上述重组载体。

在本发明的另一方面，还提供了一种重组蛋白，该重组蛋白是由上述重组载体经表达而 制得。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

构建含猪流行性腹泻病毒N蛋白基因的重组表达载体；

将所述重组表达载体转化入宿主细胞进行诱导表达，得可溶性的猪流行性腹泻病毒重组 N蛋白；

将所述重组N蛋白纯化后免疫小鼠，取免疫后的小鼠脾脏细胞，与SP2/0瘤细胞融合， 筛选获得分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞；

将所述杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔，小鼠腹部胀大后，采集腹水，即得抗猪流行性腹泻 病毒N蛋白的单克隆抗体。

在本发明的另一方面，还提供了一种诊断猪流行性腹泻病毒感染的试剂盒，包含上述单 克隆抗体。

在本发明的另一方面，还提供了上述单克隆抗体在制备诊断猪流行性腹泻病毒感染的产 品中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了上述单克隆抗体在制备预防猪流行性腹泻病毒感染的产 品中的应用。

本发明抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的单克隆抗体，与猪流行性腹泻病毒具有良好的反应 性，适用于快速准确地诊断PEDV，同时为监测、预防PEDV提供重要的技术支撑，具有很 好的应用前景。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1的PEDVN基因PCR扩增(1A)及构建原核表达载体后PCR(1B)及 酶切鉴定(1C)结果图；

图2是本发明实施例1纯化的N蛋白表达产物SDS-PAGE(2A)和重组N蛋白的western blot(2B)结果图；

图3是本发明实施例3抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗ELISA效价鉴定结果图；

图4是本发明实施例4猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体特异性鉴定图；

图5是本发明实施例5抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗Westernblot分析结果图；

图6是本发明实施例5抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗IFA分析结果图。

本发明的单克隆抗体杂交瘤细胞系，已于2014年8月5日保藏于中国典型培养物保藏中 心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)，保藏号为CCTCC NO.C2014136，其分类命名为杂交瘤细胞株2B8。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实 验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北 京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

为了快速准确地诊断PEDV，本发明研制出了能够与猪流行性腹泻病毒N蛋白具有良好反 应性的单克隆抗体。具体通过如下过程获得特异性的单克隆抗体：

1、根据猪流行性腹泻病毒JS-2013株核苷酸序列信息，设计一对扩增N基因全长的引物。 提取病毒基因组RNA，反转录合成cDNA，用引物N-F、N-R扩增全长N基因，将其克隆到 Pcold-Ⅰ表达载体上，经酶切、测序鉴定正确后，将该质粒转入感受态细胞BL21(DE3)中， 利用IPTG诱导表达。用Ni-NTA柱对重组蛋白进行纯化，获得可溶性重组N蛋白，作为制 备后续单克隆抗体的免疫原。

2、将纯化后重组N蛋白作为免疫原，免疫6周龄雌性BABL/c小鼠。首次免疫使用完全 弗氏佐剂，二免选用不完全弗氏佐剂，重组N蛋白与弗氏佐剂1:1比例混合，首次免疫蛋白 量加倍。第三、四次直接免疫重组N蛋白。融合前3～4d，腹腔注射纯抗原加强免疫。取免疫 后的小鼠脾脏细胞，与SP2/0瘤细胞按5:1的比例融合，筛选阳性杂交瘤细胞，采用有限稀 释法经4次亚克隆选取分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞，按10⁶个细胞/只免疫8周龄 BABL/c小鼠，7天后采取小鼠腹水，获得单克隆抗体。

实施例1重组表达猪流行性腹泻病毒N蛋白

根据猪流行性腹泻病毒JS-2013株核苷酸序列信息，设计一对扩增N基因全长(1326bp， N基因全长序列如SEQIDNO.2所示)的引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。上 游引物序列为：N-F：5’-GCTCGGTACCCTCGAGATGGCTTCTGTCAGTTTTCAGGATC-3’ (SEQIDNO.3)；下游引物序列为N-R：5’-ATTCGGATCCCTCGAGTTAATTTCCTGTGTCG AAGATCTCG-3’(SEQIDNO.4)，酶切位点为XhoI。提取病毒基因组RNA，反转录合成cDNA， 用引物N-F、N-R扩增全长N基因，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测鉴定回收，通过 PCR扩增出大小约1300bp的N基因，与预期结果相符(图1A)。载体pColdIDNA用XhoI 酶切后与PCR产物各100ng，用5XIn-FusionHDEnzymePremix50℃连接15min后转化DE3 感受态细胞，均匀涂布于含氨苄抗性的LB琼脂平板上，37℃培养14h～16h挑取菌落摇菌， PCR和酶切鉴定重组表达质粒是否正确，PCR鉴定结果如图1B所示，扩增出了大小约1300 bp的N基因，酶切鉴定结果如图1C所示，获得了1300bp左右的N基因酶切片段。将PCR 鉴定正确的质粒送上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。测序结果表明载体构建成 功。经测序鉴定正确的阳性表达载体质粒命名为pColdI-N。

原核表达、纯化重组猪流行性腹泻病毒N蛋白程序如下：

将鉴定为阳性的pColdI-N/DE3细菌接种2×YT培养基，接种比例1：100，经37℃振荡 摇菌至菌液OD值达到0.6后，加入IPTG至终浓度为0.5mM，15℃继续诱导12h。离心收集 菌液并用PBS清洗2遍后，破菌缓冲液重悬后，超声至菌液澄清，离心去除超声沉淀，纯化 上清，按照His-Binding-Resin蛋白纯化试剂盒说明书纯化表达的N蛋白，并使用Bradford蛋 白质定量试剂盒对目的蛋白进行定量分析。将纯化的目的蛋白经SDS-PAGE电泳后转印到 PVDF膜上，与PEDV阳性猪血清进行反应，然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG和 ECL显色。SDA-PAGE与Weaternblot结果显示，原核表达纯化的重组蛋白大小约为52kDa， 与预期蛋白大小相符(图2)，猪流行性腹泻病毒N蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。 图2中，图2A为pColdIDNA原核表达载体表达猪流行性腹泻病毒重组N蛋白的SDS-PAGE 电泳结果图，其中M为蛋白质分子量标准；1为0.5mMIPTG诱导表达菌液超声沉淀；2为 0.5mMIPTG诱导表达菌液超声上清；3为纯化重组N蛋白；图2B为鼠抗His标签单克隆抗 体Westernblot鉴定重组蛋白结果图，其中M为蛋白质分子量标准；1为pColdIDNA空载体 诱导产物；2为纯化的重组N蛋白。

实施例2抗猪流行性腹泻病毒N蛋白鼠源单克隆抗体的制备

如实施例1中纯化制备的重组猪流行性腹泻病毒N蛋白作为免疫原，免疫小鼠，用于制 备单克隆抗体。选择6周龄BABL/c雌性小鼠，免疫表达纯化的N蛋白。首次免疫以纯化的 N蛋白作为免疫原，与弗氏完全佐剂1:1比例混合后，按50ug/只(200ul/只)的抗原量经腹 腔注射。两周后，再经腹腔注射，用弗氏不完全佐剂处理同一剂量抗原，每隔两周重复免疫 一次。每次免疫前，眼眶采血，ELISA鉴定抗体效价。第三次免疫开始，不加佐剂。融合前 3～4d，腹腔注射纯抗原加强免疫。取小鼠脾脏与SP2/0细胞融合，进行单克隆抗体制备。融 合两周后，间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，具体方法如下：

1、包被：纯化重组猪流行性腹泻病毒N蛋白与pColdIDNA表达载体His标签蛋白分别 包被ELISA酶标板，每孔包被量为200ng/100μL，4℃包被过夜。

2、洗涤：用含有5‰tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5分钟。

3、封闭：5％脱脂乳37℃孵育2小时，200μL/孔。

4、洗涤：用含有5‰Tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5分钟。

5、加细胞培养上清液：细胞培养上清分别加入包被重组N蛋白与His标签蛋白的酶标板， 每孔培养上清液50μL，脱脂乳50μL，混匀，37℃培养箱作用1小时。

6、洗涤：用含有5‰Tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5分钟。

7、加入二抗：用5％脱脂乳按1：10000倍稀释HRP羊抗鼠IgG后，每孔100μL加入酶 标板，37℃孵育1小时。

8、洗涤：用含有5‰Tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5分钟。

9、显色：每孔加入50μLTMB显色液，避光室温孵育10分钟。

10、终止：每孔加入50μL2MH₂SO₄。

11、OD值检测：酶标仪测定OD₄₅₀值。

经过重组猪流行性腹泻病毒N蛋白与pColdIDNA载体标签蛋白双重ELISA筛选后，选 取载体标签蛋白反应阴性、重组N蛋白反应阳性的克隆，扩大培养后进行4次亚克隆，每次 亚克隆后均进行双重ELISA筛选鉴定阳性克隆。4次亚克隆后，获得3株稳定分泌单克隆抗 体的杂交瘤细胞株。最后优选其中一株杂交瘤细胞株2B8于2014年8月5日保藏于中国典 型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)，保 藏号为CCTCCNO.C2014136，其分类命名为杂交瘤细胞株2B8。筛选的阳性杂交瘤细胞经扩 大培养，用于单抗腹水制备。

单抗腹水制备，具体步骤如下：选取8周龄BABL/c雌性小鼠，腹腔注射降植烷，200μL/ 只。免疫降植烷一周后，阳性杂交瘤细胞计数，基础DMEM培养基重悬，10⁶/只接种小鼠腹 腔。一周后观察小鼠腹部变化，若出现腹部胀大，即进行腹水采集，采集腹水4,000rpm/min 离心10min，上清分装-80℃保存。

实施例3抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体ELISA效价鉴定

如实施例2中制备的腹水，作为一抗，间接ELISA方法检测腹水的ELISA效价，具体方 法如下：

1、包被：纯化重组猪流行性腹泻病毒N蛋白与pColdIDNA表达载体His标签蛋白分别 包被ELISA酶标板，每孔包被量为200ng/100μL，4℃包被过夜。

2、洗涤：用含有5‰tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5分钟。

3、封闭：5％脱脂乳37℃孵育2小时，200μL/孔。

4、洗涤：用含有5‰Tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5分钟。

5、加入一抗：采用5％脱脂乳将采集的腹水按照1:10000稀释后，分别加入包被重组猪 流行性腹泻病毒N蛋白与His标签蛋白的酶标板，每孔100μL，37℃作用1小时。

6、洗涤：用含有5‰Tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5分钟。

7、加入二抗：用5％脱脂乳按1：10000倍稀释后，每孔100μL加入酶标板，37℃孵育1 小时。

8、洗涤：用含有5‰Tween-20的PBST洗涤3次，200μL/孔。每次5分钟。

9、显色：每孔加入50μLTMB显色液，避光室温孵育10分钟。

10、终止：每孔加入50μL2MH₂SO₄。

11、OD值检测：酶标仪测定OD₄₅₀值。

结果如图3所示，腹水效价OD450结果显示为1.491。图3中，MAb为抗猪流行性腹泻 病毒N蛋白单克隆抗体；阳性血清为纯化重组N蛋白免疫4次后BABL/c小鼠血清；阴性血 清为未免疫BABL/c小鼠血清；His标签蛋白为pColdIDNA空载体诱导纯化后获得的标签蛋 白。

实施例4抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体特异性鉴定

如实施例2中制备的腹水，作为一抗，检测抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的特 异反应性。具体操作如下：

收取细胞样品：从中国农业科学院上海兽医研究所猪病实验室，获得猪瘟病毒(CSFV)， 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)，猪伪狂犬病毒(PRV)，乙型脑炎病毒(JEV)感染的细 胞样品，与猪流行性腹泻病毒JS-2013感染的Vero细胞样品。按照4:1体积比混合5×样品缓 冲液，煮沸10min后，-20℃保存备用。

Westernblotting：10μL等量总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后，采用伯乐半 干转膜仪，电压15V，转印50min，将蛋白转印至硝酸纤维膜(NC膜)上。转印完毕后进行 后续实验具体操作如下：

1、封闭：用5％脱脂乳室温封闭NC膜1小时。

2、洗涤：用含有1‰Tween-20的TBST洗涤NC膜3次，每次10分钟。

3、加入一抗：实施例2中制备的腹水，用含有5％BSA的TBST缓冲溶液按照1:500-1000 的比例稀释一抗，室温作用1小时或4℃孵育过夜。

4、洗涤：用含有1‰Tween-20的TBST洗涤NC膜3次，每次10分钟。

5、加入二抗：中杉金桥公司HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体，用TBST按1：6000倍稀 释后加入，室温作用1h。

6、洗涤：用含有1‰Tween-20的TBST洗涤NC膜3次，每次10分钟。

7、显影：采用Thermo公司ECL发光试剂盒进行曝光显影。

结果如图4所示，实施例2制备的抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的特异性好。 图4中，PEDV为猪流行性腹泻病毒；PRRS为猪繁殖与呼吸综合征病毒；JEV为乙型脑炎病 毒；CSFV为猪瘟病毒；PRV为猪伪狂犬病毒。

实施例5用间接免疫荧光法和Westernblotting分别检测抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单 克隆抗体的特异性

如实施例2中制备的腹水，作为一抗，分别用间接免疫荧光法(IFA)和Westernblotting 检测腹水的特异性反应性，IFA的具体步骤如下：

1、细胞感染PEDV：6孔细胞培养板中铺满vero细胞，用PEDV感染vero细胞，12h后， 用冰甲醛于-20℃固定10min；

2、洗涤：用PBS洗涤4次，700μL/孔，每次5分钟；

3、封闭：含有5％BSA的PBS缓冲溶液37℃孵育1小时；

4、洗涤：用PBS洗涤4次，700μL/孔，每次5分钟；

5、加入一抗：实施例2中制备的腹水，用PBS缓冲溶液按照1:1000-4000的比例稀释一 抗，SP2/0细胞培养上清液做阴性对照，37℃孵育1小时；

6、洗涤：用PBS洗涤4次，700μL/孔，每次5分钟；

7、加入二抗：FITC羊抗鼠IgG购自Sigma公司，用PBS按1：1000倍稀释后加入六孔 板，避光37℃孵育1小时；

8、洗涤：用PBS洗涤4次，700μL/孔，每次5分钟；

9、荧光显微镜观察。

Westernblotting实验步骤同实施例4。

Westernblot结果如图5所示，图5中，1为SP2/0细胞培养上清液对感染PEDV的vero 细胞进行Westernblot结果；2为抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体MAb2B8对感染 PEDV的vero细胞进行Westernblot结果。

IFA结果如图6所示，图6中，5A为MAb2B8对感染PEDV的vero细胞进行间接免疫 荧光染色结果，细胞胞浆及胞膜呈闪亮绿色荧光反应；5B为SP2/0细胞培养上清液对感染 PEDV的vero细胞进行间接免疫荧光染色结果，细胞未见有亮绿色荧光染色。

由以上实验结果可知，本发明的抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体特异性很好，适 用于早期快速诊断PEDV。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而 理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。