一种基于SSR分子标记构建菜豆指纹图谱的方法及应用

摘要

本发明公开了一种基于SSR分子标记构建菜豆指纹图谱的方法及应用，属于指纹图谱构建技术领域。该方法是提取菜豆DNA，利用菜豆DNA和SSR核心引物进行PCR扩增反应，电泳检测后根据电泳结果构建菜豆特征指纹图谱；SSR核心引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-16所示。本发明方法与常规形态鉴定比较，本发明方法鉴定结果准确可靠、耗时短、不受环境影响、操作简单，可以同时鉴定多个品种，方便快捷。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于SSR分子标记构建菜豆指纹图谱的方法及应用，属于指纹图谱构建技术领域。

背景技术

菜豆(Phaseolusvulgaris)是最重要的食用豆类之一，占全球食用豆类产量的50％，我国菜豆种质丰富、品种繁多，经过长期选种培育，创造了不同类型的品种资源。目前菜豆品种的分类和命名标准不统一，单一的从形态学角度很难将不同的菜豆品种区分开。

DNA指纹图谱是指能够鉴别生物个体之间差异的DNA电泳图谱，它是建立在DNA分子标记基础之上的一种鉴定技术。DNA指纹图谱的构建对于保护育种者的权益不受损害有着举足轻重的作用，而SSR分子标记已被证实是一种高效的品种鉴定方法。SSR(Simplesequencerepeat)亦称微卫星DNA，是由短的串联重复序列组成，分布在真核生物基因组中，由于重复次数的不同使位点呈现多态性。在SSR座位两侧有一段相对保守的单拷贝序列，根据此序列设计一对特异性引物来扩增不同重复次数的SSR序列，经聚电泳后，比较扩增带的迁移距离，就可判断不同个体在某个SSR座位上的长度多态性。SSR为共显性分子标记，是目前遗传多样性和遗传结构研究最常用的标记之一，SSR标记具有稳定、多态性高等优点。菜豆中也有利用分子标记技术开展研究，但大都侧重于对某类菜豆资源材料的亲缘关系进行研究。目前还没有建立菜豆品种DNA指纹图谱从而鉴别品种的报道。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种基于SSR分子标记构建菜豆指纹图谱的方法，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种基于SSR分子标记构建菜豆指纹图谱的方法，该方法是提取菜豆DNA，利用菜豆DNA和SSR核心引物进行PCR扩增反应，电泳检测后根据电泳结果构建菜豆特征指纹图谱；所述SSR核心引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-16所示。

所述方法步骤如下：

1)提取菜豆DNA，获得菜豆DNA；

2)通过筛选获得SSR核心引物；所述SSR核心引物，每对SSR核心引物包括上游引物和下游引物，核苷酸序列如SEQIDNO.1-16所示；

3)利用步骤1)所得菜豆DNA和步骤2)所得SSR核心引物进行PCR扩增反应，然后对PCR产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，银染显色，根据电泳结果构建菜豆特征指纹图谱。

优选地，步骤1)所述菜豆品种为杂花豆1号、矮饭豆、兔子腿、花腰豆、窝郎豆、白花腰豆、紫白花豆、花芸豆、大马掌、奶花芸豆、红花芸豆、小黑芸豆、硬壳豆、宽边豆、肉角豆、长白南京、四十天花豆、早红豆、大红花腰子豆、大白花川豆、本地川豆、硬壳花川豆、小洋豆、大花洋豆、梅豆、桔黄梅豆、粉黄汾豆、大粒红金花、红刀豆、然豆、黑架豆、花梅豆、黑小红豆、红眉豆、白粒红豆或眉豆。

优选地，步骤1)所述提取菜豆DNA，方法为取菜豆幼叶，加入液氮研磨成粉末，采用试剂盒法提取DNA，检测总DNA的质量，然后将总DNA稀释成100ng/μL，储存于-20℃备用。

优选地，步骤2)所述筛选，方法为：

步骤一，初筛引物：筛选出在不同菜豆品种间具有多态性、带型清晰且能够稳定重复的SSR初筛引物；

步骤二，复筛引物：在步骤一获得的SSR初筛引物中筛选出在菜豆品种间多态性信息含量值最高且等位位点数最多的SSR引物作为菜豆品种指纹图谱库构建的核心引物，根据核心引物的等位位点个数划分类群，将处在同一位点的品种划分为同一类群；

步骤三，将其他引物在在步骤二划分的类群中划分亚类群，以此类推，直到把各类群分到只有一个品种为止。

优选地，步骤3)所述PCR反应体系包括DNA模板0.8μL，10pmol/L上游引物0.2μL，10pmol/L下游引物0.2μL，10×PCRbuffer2μL，25mmol/LMg²⁺1.2μL，10mmol/LdNTP0.5μL，5U/μLTaq酶0.2μL，ddH₂O14.4μL；所述PCRbuffer不含Mg²⁺。

优选地，步骤3)所述PCR反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性15s，退火15s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存；所述各SSR核心引物的退火温度为：CD11和CD15的退火温度为50℃，CD16、CD17和CD18退火温度为52℃，CD12的退火温度为53℃，CD13和CD14的退火温度为55℃。

优选地，步骤3)所述构建菜豆特征指纹图谱，是根据标准DNA分子量和引物的迁移率记录电泳结果，每对引物迁移率最大的条带记为1，迁移率次之的记为2，依次类推，无条带记为0，不同引物之间用‘-’隔开，建立SSR基因型信息数据，按照引物顺序进行编码，得到的指纹代码即为该品种的特征指纹图谱。

所述方法具体步骤为：

1)取菜豆幼叶，加入液氮研磨成粉末，采用试剂盒法提取DNA，检测总DNA的质量，然后将总DNA稀释成100ng/μL，储存于-20℃备用，获得菜豆DNA；

2)通过筛选获得SSR核心引物；所述SSR核心引物，每对包括上游引物和下游引物，核苷酸序列如SEQIDNO.1-16所示；所述筛选，方法为：步骤一，初筛引物：筛选出在不同菜豆品种间具有多态性、带型清晰且能够稳定重复的SSR初筛引物；步骤二，复筛引物：在步骤一获得的SSR初筛引物中筛选出在菜豆品种间多态性信息含量值最高且等位位点数最多的SSR引物作为菜豆品种指纹图谱库构建的核心引物，根据核心引物的等位位点个数划分类群，将处在同一位点的品种划分为同一类群；步骤三，将其他引物在在步骤二划分的类群中划分亚类群，以此类推，直到把各类群分到只有一个品种为止；

3)利用步骤1)所得菜豆DNA和步骤2)所得SSR核心引物进行PCR扩增反应；然后对PCR产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，银染显色，根据标准DNA分子量和引物的迁移率记录电泳结果，每对引物迁移率最大的条带记为1，迁移率次之的记为2，依次类推，无条带记为0，不同引物之间用‘-’隔开，建立SSR基因型信息数据，按照引物顺序进行编码，得到的指纹代码即为该品种的特征指纹图谱；

所述PCR反应体系包括DNA模板0.8μL，10pmol/L上游引物0.2μL，10pmol/L下游引物0.2μL，10×PCRbuffer2μL，25mmol/LMg²⁺1.2μL，10mmol/LdNTP0.5μL，5U/μLTaq酶0.2μL，ddH₂O14.4μL；所述PCRbuffer不含Mg²⁺；所述PCR反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性15s，退火15s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存；

所述各SSR核心引物的退火温度为：CD11和CD15的退火温度为50℃，CD16、CD17和CD18退火温度为52℃，CD12的退火温度为53℃，CD13和CD14的退火温度为55℃

以上所述任一方法在构建菜豆指纹图谱及鉴别菜豆品种中的应用。

本发明有益效果：

1、本发明菜豆DNA指纹图谱的构建方法，利用了SSR引物对某一菜豆品种DNA进行扩增，得到一个特定的指纹，而一组SSR引物对该特定的品种进行DNA扩增就会使该品种将可能会得到一组特有的DNA指纹，于是本发明方法采用引物组合鉴别的方法对引物进行再次分析和筛选，使每一个品种都找到了它特有的DNA指纹。

2、与常规形态鉴定比较，本发明方法鉴定结果准确可靠、耗时短、不受环境影响、操作简单，可以同时鉴定多个品种，方便快捷。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1：

本实施例以36份菜豆品种作为样本材料，利用筛选出的SSR核心引物构建菜豆品种的指纹数据，以达到品种鉴定的目的。

36份供试菜豆品种信息如下表1所示。表1中种质编号来源于中国作物种质信息网。

表136份供试菜豆品种信息

菜豆品种标准DNA指纹图谱库的构建，按如下步骤进行：

1.菜豆各品种总DNA提取

将菜豆种植于土壤中，室温培养，长出12天后取菜豆幼叶在液氮冷冻后于-80℃保存备用。取各品种菜豆幼嫩的叶片0.2g于1.5mL离心管中，加入液氮研磨成粉末。采用试剂盒法提取DNA，操作实验步骤按照试剂盒说明书进行。用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测总DNA的质量，然后将总DNA稀释成100ng/μL，储存于-20℃备用。

2.引物的筛选

a.SSR引物合成：引物合成的纯度要求为PAGE纯化，并分装成1OD/管，把上、下游引物的浓度均稀释成10pmol·L^-1。

b.SSR引物对序列的筛选方法：

步骤一，初筛引物：筛选出在不同菜豆品种间具有多态性、带型清晰且能够稳定重复的SSR初筛引物；步骤二，复筛引物：在步骤一获得的SSR初筛引物中找出一对在菜豆品种间多态性信息含量值最高且等位位点数最多的SSR引物作为菜豆品种指纹图谱库构建的核心引物，根据其等位位点个数划分类群，即处在同一位点的品种划分类群；步骤三，以核心引物的区分结果为基准，再用另一对引物在各类群检测，在每个类群中同样在同一位点的划分亚类群，以此类推，这样将其划分为更多的类群，直到把各类群分到只有一个品种为止。

通过筛选获得以下8对SSR核心引物，引物名称如表2所示。

表2引物名称

c.SSR引物对序列的筛选步骤：

以所述菜豆品种为材料，利用所述合成的SSR引物分别对各菜豆品种的DNA进行PCR扩增，PCR反应试验中采用的PCR反应体系为20μL体系：DNA模板0.8μL，F-primer(10pmol·L^-1)0.2μL，R-primer(10pmol·L^-1)0.2μL，10×PCRbuffer(不含Mg²⁺)2μL，Mg²⁺(25mmol·L^-1)1.2μL，dNTP(10mmol·L^-1)0.5μL，Taq酶(5U·μL^-1)0.2μL，ddH₂O14.4μL，总计20.0μL。

PCR反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性15s，退火温度(不同引物退火温度见表2)退火15s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

d.凝胶电泳及银染显色

扩增产物采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳在Sequi-GenGT核酸电泳系统(Bio-Rad，USA)中进行。

银染显色：利用固定液(含50％乙醇和2％的醋酸)固定3min；倒掉固定液，蒸馏水洗1次，时间30s，加入染色液(0.2％的硝酸银)染色5min；倒掉染色液，蒸馏水洗2次，每次时间30s，加入显色液(3％NaOH和0.5％甲醛)，至谱带清晰为止；照相记录。

3.菜豆DNA特征指纹图谱的构建

利用所述筛选得到的SSR引物对序列，分别对所述各菜豆品种DNA进行PCR扩增，用GeneMapper4.0软件与人工结合的方式读取条带，根据DNA标准分子量和引物的迁移率记录结果，忽略杂带弱带，每对引物迁移率最大的条带记为1，迁移率次之的记为2，依次类推，无条带记为0，不同引物之间用‘-’隔开，建立供试材料SSR基因型信息数据，按照引物顺序进行编码，即按照CD11，CD12，CD13，CD14，CD15，CD16，CD17，CD18引物的顺序进行，得到的指纹代码即为该品种的指纹图谱(表3)。

表336份材料指纹代码

品种名称 指纹代码 品种名称 指纹代码 杂化豆1号 2-2-5-2-3-5-3-4 大红花腰子豆 2-1-5-3-2-5-14-7 矮饭豆 3-4-5-5-3-5-3-7 大白花川豆 3-2-3-4-4-4-2-6 兔子腿 1-2-4-5-1-3-4-7 本地川豆 1-3-5-4-2-2-3-6 花腰豆 2-1-4-1-3-5-2-3 硬壳花川豆 1-4-3-3-3-3-2-2 窝郎豆 1-2-1-1-1-1-1-1 小洋豆 1-2-2-2-1-5-2-2 白花腰豆 1-4-5-1-4-1-5-4 大花洋豆 0-1-2-5-1-2-2-2 紫白花豆 3-2-5-4-3-5-4-7 梅豆 1-3-2-4-1-2-2-2 花芸豆 1-3-2-2-2-5-3-5 桔黄梅豆 0-3-2-2-1-1-1-1 大马掌 2-2-2-4-2-5-2-2 粉黄汾豆 4-3-2-4-1-2-2-7 奶花芸豆 1-1-2-3-1-5-1-4 大粒红金花 1-4-2-2-1-1-1-0 红花芸豆 4-4-1-5-2-5-0-4 红刀豆 1-3-2-2-1-1-2-2 小黑芸豆 1-4-0-1-2-3-2-3 然豆 1-4-3-1-1-2-2-3 硬壳豆 1-4-2-3-1-4-2-3 黑架豆 4-2-3-4-3-5-4-6 宽边豆 0-4-3-5-3-3-2-2 花梅豆 1-4-3-3-2-3-4-2 肉角豆 2-4-5-3-1-5-14-3 黑小红豆 1-4-3-3-2-2-4-3 长白南京 2-2-1-1-2-1-2-1 红眉豆 1-5-4-0-2-3-4-2 四十天花豆 1-4-3-3-1-3-2-2 白粒红豆 2-4-3-0-1-2-4-2 早红豆 1-4-3-3-3-2-2-2 眉豆 1-4-3-2-2-4-3-3

由表3可得出结论，任意两个品种的DNA指纹图谱都不相同，差异引物数均在1个以上，可判断出36份供试菜豆品种是不同的品种，且所对应的指纹代码是该品种所特有的指纹。4.数据统计及分析

利用Popgene3.2软件计算引物位点的等位基因数(Na)、香农多样性指数、多态性信息量(PIC)。在36份材料中，8个SSR标记共检测出40个等位基因，每个位点检测出的等位基因数为4-7个，平均每个位点5个；引物多态性信息量(PIC)变化范围是0.5350～0.7737，平均为0.6690，所有引物PIC值均在0.5以上，表明这些引物能检测到丰富的遗传变异(表4)。

表4遗传多样性指数

引物名称 等位基因数 有效等位基因数 香农指数 多态性信息含量 CD11 4 2.3810 1.0889 0.535 CD12 5 3.1984 1.3216 0.6385 CD13 5 3.9690 1.462 0.7013 CD14 4 3.6636 1.3377 0.6764 CD15 4 3.4286 1.2861 0.6519 CD16 6 4.6957 1.6261 0.7538 CD17 5 2.9673 1.2993 0.6217 CD18 7 4.9846 1.7537 0.7737

结果表明，8对引物组合可用于植物基因型的鉴定之中，以使对那些没有准确系谱记载的材料进行遗传分类。能应用于鉴定菜豆品种的遗传特征，保护这些品种权免受侵犯。

实施例2引物多态性验证

将除核心引物外的40对引物对36份菜豆供试材料进行PCR扩增，构建菜豆指纹图谱。统计引物多态性信息，以下列出其中8对非核心引物对其中6个品种指纹图谱构建的结果，8对非核心引物信息如表6所示，5个供试品种指纹代码如表7所示，指纹代码引物顺序CD98、CD1、CD67、CD85、CD97、CD20、CD5、CG1

表5部分非核心引物序列

表6非核心引物信息

引物名称 等位基因数 PIC CD98 1 0 CD1 2 0.0912 CD67 2 0.121 CD85 1 0 CD97 1 0 CD20 1 0 CD5 1 0 CG1 2 0.151

表75个品种指纹代码

品种名称 指纹代码 杂花豆1号 1-1-2-1-1-1-1-2 矮饭豆 1-1-1-1-1-1-1-2 兔子腿 1-2-2-1-1-1-1-1 花腰豆 1-1-2-1-1-1-1-2 窝郎豆 1-2-2-1-1-1-1-1

由表5和表6可知引物CD98、引物CD67、引物CD20及引物CD5的等位基因数为1，没有多态性，不能将品种区分；引物CD1、引物CD67、引物CG1多态性含量值低，只能将部分品种区分开，花腰豆与杂花豆1号指纹相同，不能将其分开。经过试验，利用其他非核心引物不能鉴定品种，因此，仅实施例1所筛选的引物具有较好的鉴定效果，其他引物均不能够鉴定。

实施例3

取10个菜豆品种(与实施例1中产地不同)作为验证材料如表8所示，利用筛选的核心引物对10个菜豆进行扩增，采用实施例1的方法对匿名样品构建指纹图谱，指纹代码如表8所示。

表810个验证菜豆品种

表910个品种指纹代码

编号 品种名称 指纹代码 1 黄芸豆 4-3-3-2-2-2-3-1 2 花腰豆 2-1-4-1-3-5-2-3 3 花芸豆 2-3-4-2-3-2-2-1 4 花芸豆 1-4-1-2-3-2-3-1 5 梅豆 1-4-3-2-2-4-3-3 6 大马掌 2-2-2-4-2-5-2-2 7 硬壳豆 2-3-1-1-2-4-1-1 8 花脸豆 1-2-5-4-3-4-2-4 9 奶花芸豆 1-1-2-3-1-5-1-4 10 花脸豆 1-4-4-3-1-1-1-1

由表8和表3可知，梅豆与实施例1中眉豆产地不同名称均不相同，但指纹却相同，说明二者是相同品种；同样奶花芸豆与实施例1中的奶花芸豆、大马掌与实施例1中的大马掌产地不同而指纹均相同，说明彼此是相同的品种。来自不同产地的花芸豆(包括实施例1)经比对后发现彼此的指纹不相同，说明三者是不相同的品种；同样不同产地的黄芸豆(包括实施例1)、花脸豆的指纹也各自不同，虽然同名，但却是不相同的品种。

由此说明，经筛选的8对核心引物构建出的36份菜豆指纹图谱能够用于品种鉴定，并且实施例1的方法也适用于对其他菜豆品种的鉴定。

本发明利用上述技术体系和筛选出的8对菜豆SSR多态性引物，构建了36个菜豆DNA指纹图谱，可把36个菜豆品种区分开，将为菜豆的鉴定和品种权保护提供技术支撑。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。