一种用于测定烟草特有亚硝胺含量的液相-气相二维色谱分析装置和分析方法

摘要

本发明涉及一种用于测定烟草特有亚硝胺含量的液相-气相二维色谱分析装置，其包括液相色谱分析装置(16)和位于其下游的气相色谱分析装置(8)；其中所述气相色谱分析装置(8)包括顺序连接的PTV进样装置(1)、中空衬管(2)、预分离色谱柱(3)和分离色谱柱(4)，在所述预分离色谱柱(3)和所述分离色谱柱(4)之间设有溶剂排出阀(6)；其中所述液相色谱分析装置(16)中采用的色谱柱为氧化铝柱(162)；其中所述PTV进样装置(1)与液相色谱分析装置(16)在线切割后的含待测组分的流出馏分的出口连通。本发明还涉及用于测定烟草特有亚硝胺含量的分析方法以及所述分析装置和分析方法在吸烟者尿液分析中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于化学分析仪器技术领域，具体涉及一种用于测定烟草特有亚硝胺含量的液相-气相二维色谱分析装置和分析方法以及它们在吸烟者尿液分析中的应用。

背景技术

烟草特有亚硝胺(TSNAs)是卷烟烟气中一类重要的有害成分，目前已报道的TSNAs有8种，其中对N-亚硝基降烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)和N-亚硝基假木贼碱(NAB)4种的研究较为深入。前人的研究表明：NNN、NNK具有1级致癌活性，NAB、NAT具有3级致癌活性。在卷烟抽吸过程中，TSNAs有可能会随卷烟烟气进入人体，从而对吸烟者的健康造成影响，因此准确测定吸烟者尿液中的烟草特有亚硝胺含量对于进一步深入了解吸烟与健康的关系具有重要意义。

目前商品化的气相色谱分析仪器在进样口后用于储存待测样品的通常是毛细管，其容量较小，从而限制了进入气相色谱中待测样品的体积。对于一些待测组分含量低的待测样品，往往需要经过浓缩、转移、定容等前处理步骤，样品处理人工操作环节繁琐且会导致测定结果的重现性较差。目前用气相色谱测定烟草特有亚硝胺时，样品前处理采用固相萃取或柱层析分离净化，这些方法净化样品需多次的浓缩、转移，不但操作繁琐，而且还会因在敞开环境中大量使用有机溶剂而污染环境，对实验操作人员的健康危害大。因此非常迫切地需要寻找更简便、快速的样品前处理方法。

在线液相-气相二维色谱是近几年来发展起来的新分析技术，在该技术中样品先经液相色谱分离净化，再将含待测组分的流出馏分在线切割进入气相色谱进行分析。液相色谱和气相色谱的在线联用能充分发挥两级色谱的互补性，一方面液相色谱的高柱效大大改善了样品的净化效果，能实现复杂基体中痕量待测成分与干扰物质的分离，另一方面二维色谱间在线切换还可减少样品前处理过程中的浓缩和转移，减少了人为分析误差，使分析结果的准确性、精密度大大提高。

本领域迫切需要一种用于测定烟草特有亚硝胺含量的液相-气相二维色谱分析装置和分析方法。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种用于测定烟草特有亚硝胺含量的液相-气相二维色谱分析装置和分析方法；第二目的在于提供上述分析装置和分析方法在吸烟者尿液分析中的应用。

本发明第一方面涉及一种液相-气相二维色谱分析装置，其包括液相色谱分析装置16和位于其下游的气相色谱分析装置8；

其中所述气相色谱分析装置8包括顺序连接的PTV进样装置1、用于储存待测样品的中空衬管2、预分离色谱柱3和分离色谱柱4，在所述预分离色谱柱3和所述分离色谱柱4之间设有溶剂排空管路，所述溶剂排空管路上具有溶剂排出阀6，所述溶剂排出阀6用于将所述预分离色谱柱3预分离出的待测样品中的溶剂排出，剩余待测组分随载气进入所述分离色谱柱4中分析检测；

其中所述液相色谱分析装置16中采用的色谱柱为氧化铝柱162；

其中所述PTV进样装置1与液相色谱分析装置16在线切割后的含待测组分的流出馏分的出口连通。

在本发明的分析装置中，载气的输送路径与待测组分相同，即依次经过所述中空衬管2、预分离色谱柱3和分离色谱柱4。

在本发明优选的实施方案中，所述液相色谱分析装置16与气相色谱分析装置8之间设有数控六通阀9，其第一接口供所述液相色谱分析装置16的流出馏分流入，第五接口供用于将含待测组分的流出馏分带入所述气相色谱分析装置8中的第二流动相18流入，第二和第四接口分别连接至捕集盘管7的两端，用该捕集盘管7对第一接口流入的待测组分进行捕集，第三接口连接至所述气相色谱分析装置8的PTV进样装置1，第六接口为废液排出口15。

在本发明优选的实施方案中，所述中空衬管2为石英中空衬管，其容积为0.5-2mL。

在本发明优选的实施方案中，所述氧化铝柱162为球形氧化铝色谱柱，该柱由3～5μm的球形氧化铝装填而成。其中，柱的内直径和长度可以根据需要进行设定，例如柱的内直径为3.5mm，长度为150mm。

在本发明优选的实施方案中，该分析装置下游连接质谱仪。

本发明第二方面涉及一种使用根据本发明第一方面所述的液相-气相二维色谱分析装置的分析方法，其包括以下步骤：

a.将待测样品通过所述液相色谱分析装置16经所述氧化铝柱162进行分离，并经在线切割得到含待测组分的流出馏分；

b.将上述含待测组分的流出馏分通过所述PTV进样装置1进样到所述气相色谱分析装置8中，在所述中空衬管2中储存；

c.所述含待测组分的流出馏分经过所述预分离柱3，将所述含待测组分的流出馏分中的溶剂和待测组分进行初步分离；

d.初步分离后的所述溶剂通过所述溶剂排出阀6排出，剩余含待测组分的流出馏分随载气进入所述分离柱4中分析检测，采用内标法得到待测组分的含量。

在本发明优选的实施方案中，在步骤a中，所述在线切割如下进行：使用数控六通阀9对所述液相色谱分析装置16的流出物按照保留时间进行馏分切割，以将具有特定保留时间的含待测组分的流出馏分捕集在所述捕集盘管7中。

在本发明优选的实施方案中，当所述待测样品为吸烟者的尿液时，其还包括以下前处理步骤：将吸烟者尿液样品用含待测组分相应内标物的二氯甲烷或氯仿溶液萃取；静置分层后取有机层过滤，得到待测样品。所述萃取可以采用现有技术中各种已知的萃取方法，优选地采用漩涡萃取。所述过滤可以采用现有技术中各种已知的过滤方法，优选地采用针头过滤器过滤。

本发明第三方面涉及根据本发明第一方面所述的液相-气相二维色谱分析装置用于测定烟草特有亚硝胺含量的用途。

本发明第四方面涉及根据本发明第二方面所述的分析方法用于测定烟草特有亚硝胺含量的用途。

本发明第五方面涉及根据本发明第一方面所述的液相-气相二维色谱分析装置用于测定吸烟者尿液中烟草特有亚硝胺含量的用途。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：

1、本发明二维色谱分析装置中的液相色谱分析装置中，采用3～5μm球形碱性氧化铝自主装填了高效柱，并采用该高效柱对待测样品进行净化，替代了现有仪器中通常使用的凝胶柱，和标准方法(GB/T23228-2008或CORESTAN°63)相比，样品净化的效果大大提高，改进后的装置和方法可满足吸烟者尿液中超低含量烟草特有亚硝胺的分析要求。

2、本发明二维色谱分析装置中改进的气相色谱分析装置，由于中空衬管和溶剂排出阀的存在，每次分析进样可达200μL，与常规气相色谱最大进样量2.0μL相比，进样量扩大了100倍以上，分析灵敏度得到了大幅度的提高。并且由于进样量的大幅提高，可将经液相色谱净化后的大体积馏分切割后直接进入本发明的气相色谱分析装置。

3、本发明的二维色谱分析装置及分析方法避免了样品前处理过程中的浓缩、转移、定容等前处理步骤，减少了实验误差，由于样品处理人工操作环节大大减少，方法的重现性也得到明显提高。

4、本发明的二维色谱分析装置及分析方法对于挥发、半挥发性组分不受限制，均可以实现本发明。

5、本发明的二维色谱分析装置中液相色谱中采用球形碱性氧化铝柱，相对于现有技术中已有的层析净化的方式而言，可大大节约有机流动相。

附图说明

图1为本发明的在线液相-气相二维色谱分析装置结构示意图；其中箭头方向代表物料输送方向。

图2为本发明的在线液相-气相二维色谱分析装置中的气相色谱分析装置结构示意图。

图3为液相色谱氧化铝柱结构示意图。

图4为氧化铝柱中填充的球形氧化铝扫描电镜图片。

图5为烟草特有亚硝胺液相色谱分离色谱图。

图6为四种烟草特有亚硝胺质谱图。

图7为四种烟草特有亚硝胺选择离子色谱图。

图8为本发明的分析方法流程示意图。

其中各附图标记具有以下含义：

1-PTV进样装置；2-中空衬管；3-预分离柱；4-分离柱；5-柱连接件；6-溶剂排出阀；7-捕集盘管；8-气相色谱分析装置；9-数控六通阀；10-第二阀门B；11-第一泵；12-第二泵；13-第一脱气装置；14-第二脱气装置；15-废液排出口；16-液相色谱分析装置；161-柱温箱；162-氧化铝柱163-紫外检测器；164-进样器；17-第一流动相；18-第二流动相。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1

如图1所示的液相-气相二维色谱分析装置，其包括液相色谱分析装置16和位于其下游的气相色谱分析装置8；

如图2所示，其中所述气相色谱分析装置8包括顺序连接的PTV进样装置1、用于储存待测样品的中空衬管2、预分离色谱柱3和分离色谱柱4，在所述预分离色谱柱3和所述分离色谱柱4之间设有溶剂排空管路，所述溶剂排空管路上具有溶剂排出阀6，所述溶剂排出阀6用于将所述预分离色谱柱3预分离出的待测样品中的溶剂排出，剩余待测组分随载气进入所述分离色谱柱4中分析检测；

其中所述液相色谱分析装置16中采用的色谱柱为氧化铝柱162；由于烟草特有亚硝胺和尿液中的主要共存物(酚类、烟碱类似物、烃类等)极性差异比较大，采用本发明的碱性氧化铝柱能分离大部分的干扰组分，从而实现样品的净化。

其中所述PTV进样装置1与液相色谱分析装置16在线切割后的含待测组分的流出馏分的出口连通。该分析装置下游连接质谱仪。所述中空衬管2为石英中空衬管，其容积为1.2mL。如图3和图4所示，所述氧化铝柱162为球形氧化铝色谱柱，该柱由3～5μm的球形氧化铝装填而成，柱的内直径为3.5mm，长度为150mm。

所述液相色谱分析装置16与气相色谱分析装置8之间设有数控六通阀9，其第一接口供所述液相色谱分析装置16的流出馏分流入，第五接口供用于将含待测组分的流出馏分带入所述气相色谱分析装置8中的第二流动相18流入，第二和第四接口分别连接至捕集盘管7的两端，用该捕集盘管7对第一接口流入的待测组分进行捕集，第三接口连接至所述气相色谱分析装置8的PTV进样装置1，第六接口为废液排出口15

该装置的工作原理如下：首先启动第一泵11，使第一流动相17经由第一脱气装置13进入液相色谱分析装置16中；待测样品经进样器164进入液相色谱分析装置16中，并经氧化铝柱162进行分离；来自所述液相色谱分析装置16的流出馏分经第一接口进入数控六通阀9中，含待测组分的流出馏分经数控六通阀转入捕集盘管7中；转移完后，切换数控六通阀，让第一泵11流动相废液和不含待测组分的流出馏分经废液排出口15排出。启动第二泵12，使第二流动相18经由第二脱气装置14进入数控六通阀9中；第二流动相18将捕集盘管7中捕集的含待测组分的流出馏分经所述数控六通阀9的第三接口排出经第二阀门10(普通阀门即可)输送到气相色谱分析装置8的所述中空衬管2中，含待测组分的流出馏分经过所述预分离柱3，将所述含待测组分的流出馏分中的溶剂和待测组分进行初步分离；初步分离后的所述溶剂通过所述溶剂排出阀6排出，浓缩后的含待测组分的流出馏分进入所述分离柱4中分析检测，经分离柱4分离后再通过质谱仪检测。

实施例2

采用如实施例1所述的液相-气相二维色谱分析装置对吸烟者尿液进行分析以测定其中烟草特有亚硝酸含量的方法，其包括以下步骤：

a.取吸烟者的尿液样品50mL于100mL的试管中，向其中加入含内标物氘代亚硝酸(浓度为50ng/L)的二氯甲烷溶液10mL萃取；用高速匀浆机20000转/min漩涡震荡5min，静置分层后取下层的二氯甲烷层清液1.0mL，经0.25μm滤头过滤，得到待测样品；将待测样品通过所述液相色谱分析装置16经所述氧化铝柱162进行分离，并经在线切割得到含待测组分的流出馏分。试验比较了振荡萃取、超声萃取和高速匀浆漩涡震荡萃取的方法提取样品中的烟草特有亚硝胺，结果表明高速匀浆漩涡震荡的方法具有最高的效率，以20000转/min漩涡震荡5min可让样品充分混匀并使烟草特有亚硝胺全转移到二氯甲烷相中，延长时间对烟草特有亚硝胺的回收率没有明显的影响，所以本实验选择20000转/min漩涡震荡5min提取样品。

b.将上述含待测组分的流出馏分通过所述PTV进样装置1进样到所述气相色谱分析装置8中，在所述中空衬管2中储存；

c.所述含待测组分的流出馏分经过所述预分离柱3，将所述含待测组分的流出馏分中的溶剂和待测组分进行初步分离；

d.初步分离后的所述溶剂通过所述溶剂排出阀6排出，剩余含待测组分的流出馏分随载气进入所述分离柱4中分析检测，采用内标法得到待测组分的含量。

在步骤a中，所述在线切割如下进行：使用数控六通阀9对所述液相色谱分析装置16的流出物按照保留时间进行馏分切割，以将具有特定保留时间的含待测组分的流出馏分捕集在所述捕集盘管7中。

其中液相色谱馏分切割进入气相色谱的中空衬管后，需完全排除溶剂后才能启动气相色谱法分析。液相色谱最好采用易挥发的流动相，在本实施例中选择的液相色谱流动相为二氯甲烷和丙酮，均为易挥发溶剂，当二氯甲烷和丙酮的比例为(9:1)时四种烟草特有亚硝胺具有较好的净化效果，因此实验选用该流动相。实验结果表明，气相色谱柱箱升温到50℃，从溶剂排出口抽真空6.0min可让溶剂完全排出。为了确保每次分析溶剂排出完全，本实验中排出溶剂时间延长2.0min，选择为排出时间为8.0min。

在上述分析方法中，具体条件如下：

液相色谱分离条件：液相色谱带紫外检测器，检测波长为254nm；液相色谱分离柱为球形氧化铝柱(该柱由3～5μm的球形氧化铝装填而成，柱的内直径为2.5mm，长度为150mm)，通过柱温箱控制柱温30℃恒温。液相色谱流动相为二氯甲烷-丙酮(90/10，v/v)，流速0.30mL/min；双泵系统，第一泵11用于控制液相色谱柱流量，第二泵12用于控制液相色谱(HPLC)与气相色谱(GC)之间的切换。液相色谱进样体积为200μL。在该条件下烟草特有亚硝胺的出峰在6.0–8.4min之间(图5)，为了使样品中的待测组分尽可能完全收集，避免保留时间波动而导致损失，本发明中把5.8–8.6min流出馏分转入捕集盘管中，由于流速为0.30mL/min，液相色谱切割进入气相色谱的体积为0.84mL。

对气相色谱和质谱条件分别进行了优化，气相色谱条件主要对色谱柱和升温程序进行了优化，比较了不同色谱柱和升温程序的分离效果，以四种烟草特有亚硝胺完全分离并尽可能缩短分析时间为目标。并且，以四种烟草特有亚硝胺达到最高响应为目标，对质谱条件进行了优化。

气相色谱分析条件：样品完全进入气相色谱后，关闭液相色谱通道，通过气相色谱中溶剂排出阀除去石英中空衬管中的溶剂。溶剂完全排除后关闭溶剂排出口，启动气相色谱升温进行气相色谱分析。柱头带可排除溶剂的石英衬管的气相色谱仪(见图2)，石英中空衬管的体积为1.2mL，预分离柱规格为5m×0.25mmi.d×0.25μmdf，DB-5ms(J&W)；分离柱规格为：AgilentDB-35MSUI毛细管色谱柱(30m×250μm×0.25μm)；载气为氦气，采用恒流模式；流速为1.2mL/min；进样口温度：290℃；色谱柱升温程序：初始温度50℃(保持1.0min)，以30℃/min速率升至170℃，然后以5℃/min速率升至230℃，再以30℃/min速率升至290℃。

质谱分析条件：电离方式：EI源；电离能量：30eV；离子源的温度：250℃；四级杆温度：120℃；扫描模式：选择离子检测(SIM)模式，，传输线温度250℃，扫描质量范围50-300amu，扫描间隔0.5s。根据其质谱图(图6)，采用从总离子流图提取单离子的方法进行定量，NNK、NNN、NAT、NAB的定量离子分别为m/z177、178、190、192；其四种同位素内标的定量离子分别为m/z191、182、194、196；在选定条件下，四种烟草特有亚硝胺的选择离子色谱图见图7。

实施例3-测定方法工作曲线、检出限和定量限

标准溶液的配制：

标准储备液制备：分别称取0.1g的NNN，NNK，NAT，NAB(精确至0.1mg)于100mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解并定容，配制成各组分浓度为1.0mg/mL混合标准储备液，密封避光贮存于-20℃条件下。

内标溶液储备：分别称取100mg的d4-NNN，d4-NNK，d4-NAT，d4-NAB(精确至0.1mg)于100mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解并定容至刻度，配制成各组分浓度为0.1mg/mL混合内标储备液，密封避光贮存于-20℃条件下。

标准工作溶液：用氯仿逐级稀释标准储备液得6级标准工作溶液，对应各待测组分的浓度分别为0.01ng/mL，0.05ng/mL，0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、5.0ng/mL，内标物的浓度为0.05ng/mL。

样品萃取溶液：用内标储备液配制成含0.05ng/mL内标物的二氯甲烷溶液。

配制一系列不同TSNAs(包括NNN、NNK、NAT和NAB)浓度的标准溶液(内标物浓度均为0.05ng/mL，按实施例2中选定仪器条件进行分析，以标样峰面积(A)和浓度(C)进行线性回归，得到线性回归方程；结果见表1。将最低浓度的标准溶液连续进样10次，测定其标准偏差，以3倍标准偏差作为检出限，以10倍标准偏差作为定量限；具体结果见表1。

表1：测定方法工作曲线、相关系数、检出限及定量限

测定仪器的灵敏度以其检测限(LOD)和定量限(LOQ)来衡量，其中所述检出限指的是能可靠地被检出的分析信号所需要的某元素的最少浓度或含量；其中所述定量限指的是样品中被测物能被定量测定的最低量。

已知检测限的值为3倍标准偏差，定量限的值为10倍标准偏差。

表1中的结果表明本发明的分析装置的灵敏度较高。

实施例4-方法回收率和重复性

日内精密度为：同一吸烟者尿液在相同条件下同一天内测定7次，并计算7次平行测定结果的相对标准偏差(RSD)，可得四种TSNAs的RSD在4.6％-5.2％范围内；说明方法精密度良好。

日间精密度为：将每天吸烟数量频率保持一致的吸烟者尿液在相同条件下每天测定1次，共7天，并计算7次测定结果的相对标准偏差(RSD)，可得四种TSNAs的RSD在5.3％-5.8％范围内；说明在不同时间内测定，方法精密度仍然良好。

测定时每样TSNAs(包括NNN、NNK、NAT和NAB)各称取相同样品4份，其中1份不加标准品，另3份分别加入已知量的TSNAs，添加量分别为0.03、0.06、0.09ng；样品按实施例2中选定的样品前处理条件处理，并按选定仪器条件进样分析，通过加标样品测出量减去未加标样品测出量(本底),再除以标准加入量计算回收率。得TSNAs的回收率在76.3％～83.2％之间，说明方法回收率很高。

实施例5-测定吸烟者尿液中的烟草特有亚硝胺含量

采用实施例2中的方法对吸烟者尿液中的烟草特有亚硝胺进行测定，结果见表2。从分析结果可看出，尽管采用了超高灵敏的分析装置和分析方法，但只有混合型卷烟吸烟者尿液中的烟草特有亚硝胺浓度在分析方法的定量限以上，烤烟型卷烟抽吸者尿液中的烟草特有亚硝胺含量大部分仍然在定量限以下。无论是混合型卷烟抽吸者还是烤烟型卷烟抽吸者，其尿液中的烟草特有亚硝胺含量均远低于对人体产生危害的浓度水平。

表2代表性样品中TSNAs含量测定结果(ng/L)

备注：“-”表示含量低于定量限。