蜡梅脱腺苷酸酶基因CpCAF1及其编码的蛋白和应用

摘要

本发明公开了蜡梅脱腺苷酸酶基因CpCAF1及其编码的蛋白和应用。本发明提供的蜡梅脱腺苷酸酶，其为：1)由SEQ？ID？No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或2)在SEQ？ID？No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。本发明的蜡梅CpCAF1基因具有花器官优势表达特征和花发育延迟功能，在拟南芥中超量表达，可以延迟拟南芥开花，增加叶面积、角果数和分枝数，延迟衰老，表明本发明的蜡梅CpCAF1基因可促进植物生长发育。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及蜡梅脱腺苷酸酶基 因CpCAF1的克隆及其应用。

背景技术

蜡梅(Chimonanthuspraecox)，蜡梅科(Calycanthaceae)，蜡梅 属(Chimonanthus)，别名金梅、蜡花、蜡木、黄梅花。落叶灌木， 常丛生。花期11月至翌年3月。蜡梅是我国传统的名贵花木。蜡梅 原产我国，以鄂西、川东、陕南为分布中心。北京以南、衡阳以 北、上海以西、成都以东各地普遍栽培，而以南京、湖北保康、河 北鄢陵、重庆栽培较多。蜡梅花冬春冒寒怒放，风姿独特，芳香馥 郁，韵味奇异，园艺造型颇多，加之象征着幸福吉祥，不仅为历代 宫廷权贵所爱，也是诗人、画家的钟情之物。蜡梅园林用途和经济 用途十分广泛，不仅是理想的花灌木，还可做切花、桩景，其花可 泡茶、酿酒、入药、提取香精，根茎可作止咳、活血药用。尤其近 20年来在种质资源、形态分类、栽培繁殖、园林应用、基因文库等 方面取得了大量成果，人们对蜡梅的应用也愈加广泛。

CCR4/POP2，又名CCR4/CAF1(Tuckeretal.,2001)，POP2系 早期相关关研究使用的名称，现多用CAF1(CCR4-associatedfactor 1)。CCR4和CAF1单体也是脱腺苷酸酶，具备相应的活性位点和酶 切活性(MartineAetal.,2012)。CAF1是参与mRNA降解的主要脱 腺苷酸酶之一，在调控基因表达和影响生物学性状方面起着重要作 用(CuiYetal,2008；LiangWetal,2009；MartineAetal.,2012)。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种蜡梅脱腺苷酸酶及其应 用。

蜡梅脱腺苷酸酶为，1)由SEQIDNo.2所示氨基酸组成的蛋白 质；或2)在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一 个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明还提供编码上述蛋白的基因，核苷酸序列如SEQIDNo.1 所示。本发明提供的蜡梅脱腺苷酸酶基因是通过随机克隆测序的方法 从蜡梅花cDNA文库获得的，其开放阅读框序列807bp。蜡梅脱腺苷 酸酶基因编码蛋白与拟南芥(Arabidopsisthaliana)、梅(Prunusmume)、 葡萄(Vitisviifera)、可可(Theobromacacao)、油棕(Elaeisguineensis)、 荷花(Nelumbonucifera)、蓖麻(Ricinuscommunis)的脱腺苷酸酶基 因编码蛋白的相似度高达98％，与其他物种的同源性也在95％～97％ 之间，结构比较保守。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列， 在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基 酸，得到所述蛋白的突变序列。

因此，本发明的蜡梅脱腺苷酸酶还包括SEQIDNo.2所示氨基 酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，具有蜡梅脱腺苷酸 酶同等活性的由蜡梅脱腺苷酸酶衍生得到的蛋白质。本发明蜡梅脱 腺苷酸酶基因包括编码所述蛋白的核苷酸序列。此外，应理解，考 虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人 员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明还提供含有上述蜡梅脱腺苷酸酶基因或其片段的载体， 以及含有该载体的宿主细胞；所述载体为所述蜡梅脱腺苷酸酶基因 的克隆载体或各类表达载体。

本发明的蜡梅CpCAF1基因具有花器官优势表达特征和花发育延 迟功能，在拟南芥中超量表达，可以延迟拟南芥开花，增加叶面 积、角果数和分枝数，延迟衰老，表明本发明的蜡梅CpCAF1基因可 促进植物生长发育。

附图说明

图1所示为转基因拟南芥的GUS染色。A：野生型拟南芥；B： 转基因拟南芥。

图2所示为转基因拟南芥中CpCAF1基因的PCR检测。M： DNA分子量标准，DL2000；1：野生型拟南芥；2-9：转基因拟南 芥中CpCAF1基因的PCR检测；10：阴性对照(ddH₂O)

图3转CpCAF1基因拟南芥叶片中CpCAF1基因的相对表达分 析。1:野生型拟南芥；2,4,6,7,10：转CpCAF1基因拟南芥不同单株 系。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1蜡梅CpCAF1基因的分离

随机挑选蜡梅花cDNA文库克隆，提取质粒DNA，以5′pTripl Ex-Sequenceprimer为测序引物，进行正向序列测定得到EST序列， 然后运用DNAStar软件包的SeqMan进行EST聚类，对获得的EST 序列通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)BLAST程序的BlastN (Nucleotide-nucleotideBLAST)和BlastX(Translatedqueryvs.proteindatabase) 进行比对分析，获得目标克隆子，并初步确认其功能属性。

以SP5和T7为测序引物进行两次正反向序列测定，得到蜡梅 GTP结合蛋白基因CAF1的cDNA序列。根据获得的蜡梅CAF1基因 cDNA序列，用软件Primerprimer5.0设计1对跨最大ORF框的特异 引物进行PCR扩增，引物序列如下：

CpCAF1-F：5‘-GAATTCATGGGGAGTTTTCCCAAAGGTG-3’ SEQIDNo.3

CpCAF1-R：5‘- GGATCCTTACCACCGAGACCATTCCAAGACAC-3’SEQIDNo.4

分别以蜡梅文库质粒DNA和蜡梅cDNA为模板，扩增蜡梅 CpCAF1基因，PCR反应体系及反应条件如下：

将PCR产物回收后连接到T载体，转化大肠杆菌感受态细胞， 或者重组子，挑取重组子进行测序，蜡梅CAF1基因cDNA序列如 SEQIDNo.1所示。

在NCBI数据库进行Blastp对比，结果显示蜡梅CpCAF1基因编 码蛋白(SEQIDNo.2)与其他物种CAF1基因编码蛋白的相似性较 高，与拟南芥(Arabidopsisthaliana)、梅(Prunusmume)、葡萄(Vitis viifera)、可可(Theobromacacao)、油棕(Elaeisguineensis)、荷 花(Nelumbonucifera)、蓖麻(Ricinuscommunis)，相似度高达98％， 与其他物种的同源性也在95％～97％之间，结构比较保守。CpCAF1 蛋白属于DEDD核酸酶家族的DEDDh亚族，其活性区由3个天门冬 甘酸(D)、1个谷氨酸(E)以及邻近的组氨酸(h)组成。与拟南 芥比较，存在约50个氨基酸的位点变异。

实施例2蜡梅CpCAF1基因植物超表达载体的构建

结合CpCAF1基因ORF框序列自身限制性酶切位点的分布特点 及所用植物超表达载体pCAMBIA2301G的多克隆位点特征，设计一 对基因特异引物，并分别在引物上下游加入酶切位点BamHI和 EcoRI及相应的保护碱基，用于扩增携带适宜酶切位点的CpCAF1 基因编码区并将其克隆到植物表达载体的多克隆位点。引物名称及 序列如下：

CAF1-FGAATTCATGGGGAGTTTTCCCAAAGGTGSEQIDNo.5

CAF1-RGGATCCTTACCACCGAGACCATTCCAAGACACSEQIDNo.6

PCR扩增体系和反应程序如下：

取5μLPCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，连接 到克隆载体pMD19-T后转化到大肠杆菌感受态细胞TOP10中，涂布 在Amp的LB平板上37℃倒置过夜培养，挑取单克隆进行PCR鉴 定，鉴定为阳性的质粒送至华大基因测序。将测序正确的阳性质粒 命名为pT-CpCAF1。用BamHI和EcoRI分别酶切pT-CpCAF1质粒 和植物表达载体pCAMBIA2301G质粒，反应体系如下：

37℃恒温箱酶切2-3h，80℃灭活5min。琼脂糖凝胶电泳回收 酶切产物中pCAMBIA2301G载体大片段及CpCAF1小片段。将回收 的CpCAF1基因片段与表达载体pCAMBIA2301G片段按照 Fermentas公司T4连接酶说明书进行连接。22℃水浴过夜连接6h以 上。连接体系如下：

将连接产物转化大肠杆菌TOP10，涂布在含50mg/LKan的LB 平板上37℃倒置过夜培养，挑取单克隆进行PCR检测，将电泳检 测为阳性的菌液活化后提取质粒进行双酶切验证。将PCR鉴定和双 酶切验证均正确的阳性质粒进行测序，确定无碱基突变后，命名为 pCAMBIA2301G-CpCAF1，即为CpCAF1基因植物超表达重组载 体。

将重组质粒pCAMBIA2301G-CpCAF1冻融法转化农杆菌 EHA105感受态细胞，挑取单菌落，置于650ul含有 YEB+Kan+Chl无菌的1.5mL离心管中(50mg/LKan和34mg/L Chl)中，28℃振荡培养36-48h，以菌液为模板进行PCR检测。 并进一步提取农杆菌转化子质粒，反转入大肠杆菌感受态细胞 TOP10中，涂布在含Kan的LB平板上37℃倒置过夜培养，挑取 单克隆进行PCR检测，将检测为阳性的菌液再提取质粒进行双 酶切鉴定。验证正确的农杆菌菌液即为含有植物表达载体 pCAMBIA2301G-CpCAF1重组质粒的工程菌。

实施例3蜡梅CpCAF1转化拟南芥

花序侵染法转化拟南芥

(1)拟南芥的培养

将适量拟南芥种子收集于1.5mL离心管中，加入浓度为17％的 次氯酸钠(NaClO)充分振荡消毒10min，然后用无菌水冲洗5-6次 后用移液枪均匀列播或散播在MS培养基平板上，于4℃冰箱春化 2-3d后将培养平板置于光照16h/黑暗8h的光周期、2000Lux照 明条件和22℃、70％湿度的环境下培养，约2周后移栽至培养基质 中(蚯蚓土：蛭石＝1:1)。在培养过程中剪掉最初的顶生花序以促进 侧枝的生长。在基质中培养3周左右，至花葶长度5cm左右时，对 拟南芥花序进行农杆菌侵染。

(2)花序侵染法转化拟南芥

在含有抗生素(Chl：34mg/L,Kan：50mg/L)的YEB固体培养基 上划单线活化含有植物表达载体pCAMBIA2301G-CpCAF1重组质 粒的农杆菌EHA105，28℃暗培养36-48h；

用无菌牙签挑取单菌落，接种至650ul含有抗生素(Chl： 34mg/L,Kan：50mg/L)的YEB液体培养基中，28℃，200rpm振荡 培养36-48h；

对培养的农杆菌菌液用特异引物进行PCR鉴定，验证正确后取 500ul上述菌液接种于25mL无抗的YEB液体培养基中，28℃，200 rpm摇菌至OD₆₀₀在1-1.2之间备用；

用10mL的无菌离心管收集上述菌液，28℃，5000rpm离心 15min，弃上清液，收集沉淀，沉淀用现配侵染液(无菌水+5％蔗糖 +0.5‰L-77)重悬，稀释至OD₆₀₀≈0.8

初次侵染剪去拟南芥花葶上已开放的花朵，仅保留刚露白的花 蕾，并提前一天浇水保持基质湿润。侵染前用喷水壶将纸箱内壁喷 湿以作暗培养备用，将花葶头浸入侵染液(0.5cm)，3-5秒后取出放 入纸箱中，纸箱外面外蒙上黑布(遮光)，置于22℃温度条件下培 养24h后取出，保持在光线较暗的环境中过夜，再转到正常的生长 环境中。

拟南芥侵染1周后根据拟南芥的生长状态可再次侵染以提高转 化效率。

转基因拟南芥的筛选鉴定

(1)转基因拟南芥的Kan抗性筛选

转化约1个月后，收集成熟、开裂的果荚，即为T₀代种子。将 种子在37℃恒温烘箱中烘干后再放在低温干燥的环境1周以上播 种，进行抗生素筛选。

T₀代转基因种子用前述方法消毒后播种于含50mg/LKan的MS 培养基平板上进行筛选，转化成功的拟南芥能在含有Kan抗生素的 培养基上正常生长。

得到若干不同株系，对各株系的T₁、T₂代种子继续进行Kan抗 性筛选，直至所有株系收获的种子播种后全为绿色抗性苗，一般得 到的T₃代种子即为转基因纯合株系。

(2)转基因拟南芥GUS组织化学染色检测

将抗性筛选所得的T4代转基因拟南芥株系播种，取2周左右大 小的植株进行GUS染色鉴定，以野生型拟南芥作为对照。结果表 明，筛选获得的8个转基因拟南芥株系均能被染成蓝色，而野生型 拟南芥则不能被染成蓝色(图1)。

(3)转基因拟南芥的PCR检测

提取8个转基因拟南芥株系和野生型拟南芥植株的叶片基因组 DNA，用CpCAF1基因的特异引物进行PCR鉴定，所用引物对为 CpCAF1-F和CpCAF1-R。结果表明，所得的转基因拟南芥株系均能 扩增出与阳性对照大小一致的目的条带，而野生型拟南芥未扩增出 目的条带，表明目的基因CpCAF1已成功插入到拟南芥基因组中(图 2)。

实施例4转基因拟南芥的实时荧光定量PCR检测

为进一步验证CpCAF1基因在转基因拟南芥中的表达情况，提 取转基因拟南芥和野生型拟南芥幼嫩叶片的总RNA，以反转录后的 cDNA第一链为模板，拟南芥Actin基因作为内参基因，对转基因拟 南芥中CpCAF1基因进行荧光定量PCR分析表达情况，所用引物如 下表1所示，结果如图3所示。

表1转基因植株RT-PCR所用引物

在检测的6个转基因拟南芥株系中，CpCAF1基因的表达差异较 大(图3)。在后期对转基因拟南芥进行分析时，根据实时荧光定量 结果，选取表达量最高和表达量稍低株系代表转基因不同表达量的 株系进行表型观察和相关处理。

实施例5转基因拟南芥表型观察

对鉴定为阳性的T4代转基因拟南芥株系进行表达量分析，选取 2个转基因株系(1个强表达+1个稍弱表达)，并以野生型拟南芥(WT) 为对照，每个转基因株系和WT各选择5-10株为表型观察记录植 株，每天定时观察比较从苗期到抽葶结实期再到衰败时期的表型， 并进行相关数据统计。

对T4代转基因拟南芥株系和野生型拟南芥进行表型观察及相关 指标测定，结果发现，转基因拟南芥株系的抽薹时间、莲座叶侧 枝、和茎生叶侧枝形成时间、第一个花序、第一朵花和第一个果荚 出现时间都稍晚于野生型植株(表2)，在生长30天时，转基因拟 南芥株系CpCAF1-3、CpCAF1-5的高度分别为野生型植株的1.08 倍、1.19倍，转基因拟南芥株系CpCAF1-3、CpCAF1-5的莲座叶叶 面积分别为野生型植株的1.02倍、1.46倍。在60天时，转基因拟南 芥株系CpCAF1-3、CpCAF1-5的莲座叶侧枝数分别为野生型植株的 1.33倍、1.75倍；茎生叶数分别为野生型植株的1.32倍、1.79倍； 荚果数分别为野生型植株的1.28倍、1.83倍。另外转基因拟南芥株 系CpCAF1-3、CpCAF1-5的第一片黄叶出现时间明显晚于野生型植 株，在55天时叶片黄化程度没有野生型严重，在65天时转基因株系 仍能大部分保持绿色，而野生型植株出现大面积的黄化干枯。说 明，CpCAF1基因的过表达能调控转基因拟南芥的生长发育，使开 花推迟，促进生长发育，延迟衰老。

表2T4代转CpCAF1基因拟南芥株系相关指标观察

观察的指标/株系 WT CpCAF1-3 CpCAF1-5 出现第一莲座叶侧枝(d) 38.00±1.58^a39.00±1.61^a34.33±1.15^a出现第一茎生叶侧枝(d) 32.67±0.58^b35.67±0.68^bc33.00±1.00^b第一个花序出现(d) 28.00±0.50^c29.00±0.10^c29.00±0.30^c第一朵花开放(d) 33.33±2.31^bc36.00±1.00^c33.00±1.73^bc第一个荚果出现(d) 36.00±2.00^b37.00±1.20^c35.67±1.15^b第一片黄叶(d) 36.67±2.08^ab40.00±1.00^c38.67±1.53^bc

每组数为平均值±标准差；a、b、c、d表示P<0.05水平上差异显著

该发明专利受到国家自然科学基金(脱腺苷酸酶基因CpCAF1 对蜡梅花发育和非生物胁迫响应的调控，项目号：31370698)资助。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领 域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以 做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。