蜡梅脱腺苷酸酶基因CpCAF1的克隆及功能分析

摘要

蜡梅[Chimonanthus praecox（L.）Link]为蜡梅科蜡梅属的落叶乔灌木植物，是我国特产的传统名花，具有较高的经济价值和观赏价值。CAF1是一种脱腺苷酸酶，在mRNA降解中起着重要作用，脱腺苷酸化作用是大多数真核细胞mRNA降解的第一步。mRNA降解可以对过时的mRNA进行及时清除，同时对发生突变有害的mRNA进行降解，能够保证细胞正常的生命活动，也可以引起基因表达变化、改变生物学性状，作为基因表达转录后调控的关键步骤之一，对生物转录组重建起重要作用。目前仅有拟南芥、辣椒和水稻CAF1基因功能的研究报导，其结果表明该基因在植物的生长发育及生物和非生物胁迫的应答过程中发挥重要作用。
　　1.CpCAF1基因的结构特征和编码蛋白特征
　　在以构建的蜡梅花cDNA文库基础上，通过随机测序的方法获得CpCAF1基因的cDNA序列。DNAstar软件分析发现，获得的cDNA序列包含一个807bp的完整开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）；ProtParam软件在线预测结果表明：蜡梅CpCAF1基因编码269个氨基酸，预测分子式为C1371H2087N349O410S11；分子量为30.37KD，等电点pI是4.70；不稳定系数（instability index）为25.90，是一个稳定蛋白；SignalP在线软件预测显示，CpCAF1蛋白不具信号肽序列；PSORT软件进行亚细胞定位预测，表明该蛋白定位在细胞核内。
　　利用DNAstar软件5.0软件进行多重序列比对，结果显示蜡梅CpCAF1基因编码蛋白与其他物种CAF1基因编码蛋白的相似性较高，与拟南芥（Arabidopsis thaliana）、梅(Prunus mume)、葡萄（Vitis viifera）、可可（Theobroma cacao）、油棕（Elaeis guineensis）、荷花（Nelumbo nucifera）、蓖麻（Ricinus communis），相似度高达98％，结构比较保守。CpCAF1蛋白属于DEDD核酸酶家族的DEDDh亚族，其活性区由3个天门冬甘酸（D）、1个谷氨酸（E）以及邻近的组氨酸（h）组成。
　　2.CpCAF1基因在蜡梅中的表达特征分析
　　利用实时荧光定量PCR对CpCAF1基因在不同组织、不同开花时期以及不同激素处理蜡梅切花进行表达特征分析。结果表明，CpCAF1基因在根、茎、叶、花各种组织中均有不同程度表达，其中在老叶中表达量最高，在根中表达量最低；在不同开花阶段，CpCAF1基因在各个时期都有所表达，在衰败期表达量最高，在花蕾期表达量最低；不同激素处理蜡梅切花，SA激素诱导CpCAF1基因的表达，在12h时达到最高；ABA和GA3处理都不同程度的抑制CpCAF1基因的表达，推测CpCAF1基因参与SA、ABA和GA3信号传导途径。
　　3.CpCAF1基因转拟南芥的遗传研究
　　将构建好的植物表达载体pCAMBIA2301G-CpCAF1转入农杆EHA105中，利用花序侵染法转化拟南芥，通过Kan抗性筛选、GUS染色、DNA鉴定，最终获得了7个T4代转基因拟南芥株系。利用实时荧光定量PCR对CpCAF1基因在转基因拟南芥中的表达情况进行检测，选择高表达株系CpCAF1-5、低表达株系CpCAF1-3进行表型观察和相关实验处理。
　　转基因拟南芥株系和野生型植株表型观察结果表明：转基因拟南芥株系的抽薹时间、莲座叶侧枝、和茎生叶侧枝形成时间、第一个花序、第一朵花和第一个果荚出现时间都早于野生型植株。转基因株系的根生长、侧枝生长、莲座叶生长和果荚生长状态均与基因的表达量呈正相关。
　　将转基因拟南芥和野生型拟南芥放在4℃的低温下分别处理0h，24h，48h，记录其脯氨酸、丙二醛和SOD变化，实验结果表明转基因拟南芥的耐寒性要强于野生型拟南芥。
　　利用非损伤微测技术，测量转基因拟南芥在低钾情况下的钾离子的流速情况。结果显示，在缺钾条件下，三种幼苗的钾离子的内流都受到了不同程度的诱导。

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第1章 文献综述

1.1 蜡梅研究进展

1.2 mRNA降解的研究进展

1.3 脱腺苷酸化酶的研究进展

1.4 CAF1基因的研究进展

第2章 引言

2.1 研究背景

2.2 研究目的、内容和意义

2.3 研究技术路线

第3章 蜡梅脱腺苷酸化酶基因CpCAF1的克隆和分子特征分析

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

第4章 蜡梅CpCAF1基因的表达特性分析

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

第5章 蜡梅CpCAF1基因表达载体的构建及拟南芥遗传转化研究

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论

第6章 总结

6.1 主要结果

6.2 下一步计划

参考文献

致谢