B27添加剂及其类似物在利用无血清培养基培养淋巴细胞中的应用

摘要

本发明提供了B27添加剂及其类似物在利用无血清培养基培养淋巴细胞中的应用，解决了现有淋巴细胞无血清培养基在没有任何血清替代添加剂的情况下，淋巴细胞的体外扩增缓慢、难以满足临床细胞治疗所需要的细胞数量的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，更具体地涉及B27添加剂及其类似物在 利用无血清培养基培养淋巴细胞中的应用。

背景技术

近年来，随着免疫治疗技术的飞速发展，以淋巴细胞为基础的各 类细胞免疫治疗已经成为人们日益关注的焦点。以淋巴细胞技术以及 经过基因工程技术修饰的各类淋巴细胞为载体的免疫治疗技术已经成 为抗肿瘤治疗强有效的手段，在针对难治复发白血病病人的临床治疗 试验中显示出突出的疗效。然而淋巴细胞免疫治疗作用的发挥依赖于 足够数量的淋巴细胞，这使得淋巴细胞的体外有效扩增成为所有细胞 免疫治疗的技术关键。

由体内提取出的淋巴细胞需要通过一定的方式使其激活和在特定 的细胞因子作用下转化成具有活性、增殖和特异性杀伤能力的淋巴细 胞。目前淋巴细胞都是在添加人源或动物源血清的条件下进行体外培 养和增殖。血清作为传统淋巴细胞扩增的主要添加剂之一，对淋巴细 胞扩增的质量至关重要。然而，无论人源血清还是动物源血清都具一 定的安全疑虑，例如，病源、排斥或过敏，从而不适合临床应用。同 时这也增加了体外扩增自体淋巴细胞的质量检测和监控的难度。正是 由于上述缺点，无血清或化学限定的培养基已逐渐成为细胞生产和临 床应用细胞体外培养的必须培养基。化学成分明确的培养基是由一系 列高质量、高纯度的有机化合物和无机化合物共同组成的培养基。无 血清培养基和化学成分明确的培养基的应用对细胞体外生产的工艺及 终点细胞产品质量控制至关重要。

目前市场上多家厂商都相继开发出了适用于淋巴细胞体外培养的 无血清培养基，如Gibco公司的AIM-V、Sigma公司的Stemline、Takara 公司的GT-T551H3、Miltenyi公司的TexMACS等。虽然这些淋巴细胞培 养基标注为无血清培养基或者化学成分明确的无血清培养基，但是在 没有任何血清替代添加剂的情况下，淋巴细胞的增殖仍然缓慢，难以 满足临床细胞治疗所需要的细胞数量。Lonza公司的X-VIVO15是研制 开发用于淋巴细胞体外扩增的无血清培养基。该培养基在不添加其他 血清及替代添加剂的培养条件下，淋巴细胞体外增殖的效果优于其他 品牌的无血清培养基。但是，与添加血清的培养条件相比，增殖效果 仍然差距较大。

市售的B-27添加剂(也简称B27)作为无血清添加剂，目前已知用 于海马神经元和其他中枢神经系统(CNS)神经元的生长和保持其短期 或长期活性，其使用浓度为2％，在低于2％浓度时培养细胞的效果不佳。 目前，对于B-27添加剂是否适用于其他细胞系、是否可以使用更低浓 度培养细胞均未见报道。

本发明以市售胎牛血清为参比物，在各种市售的淋巴细胞无血清 培养基中添加不同比例的细胞培养添加剂B27添加剂进行体外增殖的 对比研究，并考察不同的激活方式对细胞增殖的影响以筛选出能够替 代血清用于体外有效扩增淋巴细胞的市售细胞培养添加剂，并寻找其 更低的使用浓度以降低成本，用于淋巴细胞的体外增殖生产工艺的开 发，以促进细胞免疫治疗的产业化。

发明内容

鉴于现有淋巴细胞无血清培养基在没有任何血清替代添加剂的情 况下，淋巴细胞的体外扩增缓慢，难以满足临床细胞治疗所需要的细 胞数量，本发明的目的在于提供B27添加剂及其类似物在利用无血清培 养基培养淋巴细胞中的新应用。

本发明的B27添加剂及其类似物在利用无血清培养基培养淋巴细 胞中的应用以提高现有淋巴细胞无血清培养基的体外扩增效率的同 时，保持淋巴细胞活性，并由此提供了适用于人类细胞治疗应用的无 血清的淋巴细胞体外扩增培养基。

本发明的一个方面提供了B27添加剂及其类似物在利用无血清培 养基培养淋巴细胞中的应用。

其中，所述B27添加剂的体积浓度为0.20-4％，优选地为0.25-1.75 ％，更优选地为0.25-1.5％。

在本发明的一个实施例中，所述B27添加剂及其类似物包括生物 素、维生素A(醋酸)、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、皮质酮、乙 醇胺盐酸、谷胱甘肽(还原)、左旋肉碱盐酸、孕酮、腐胺二盐酸盐 和三碘甲状腺原氨酸或其组合。在本发明的另一个实施例中，所述B27 添加剂及其类似物还进一步包括DL-α-醋酸生育酚、DL-α-生育酚、牛 血清蛋白、重组人胰岛素、人转铁蛋白、D-半乳糖、亚硒酸钠、磷脂 酞胆碱、胆固醇、卵磷脂、亚油酸、亚麻酸或其组合。

本发明中，所述淋巴细胞为人淋巴细胞，优选地为人外周血单个 核细胞中的淋巴细胞。

在本发明中，所述B27添加剂添加到淋巴细胞培养基中，所述淋 巴细胞培养基包括X-VIVO15(购自Lonza公司，货号为04-418Q)、 AIM-V(购自Gibco公司，货号为12055-091)和1640(购自Gibco公 司，货号为22400-089)、Stemline(购自Sigma公司，货号为S1694-1L)、 GT-T551H3(购自Takara公司，货号为WK593S)和的TexMACS(购 自Miltenyi公司，货号为170-076-309)。

本发明的另一方面还提供了B27添加剂及其类似物在利用培养基 培养淋巴细胞中的应用。

本发明的有益效果

本发明提供了B27添加剂在淋巴细胞无血清培养液中替代人源或 动物源血清增殖淋巴细胞的新用途，这有利于各类淋巴细胞体外增殖 工艺的稳定可控及淋巴细胞治疗产品的规模化和产业化，也有利于提 高经体外扩增的细胞治疗产品在临床病人回输治疗过程中的免疫安全 性。

具体地说，将B27添加剂应用到淋巴细胞的培养中，具有如下有益 效果：

(1)淋巴细胞激活后，将B27添加剂加入到所测试的所有市售培 养基中，淋巴细胞增殖倍数在7天内超过200倍，14天内超过400倍，这 种增殖效果超过或至少等同于胎牛血清的效果。

(2)淋巴细胞激活后，将B27添加剂加入到所测试的所有市售培 养基中增殖，增殖终点CD3阳性淋巴细胞比率超过90％。

(3)增殖过程中及增殖终点，淋巴细胞亚群分布与添加胎牛血清 以及未添加任何添加剂增殖的淋巴细胞亚群分布基本一致。

(4)采用基因工程技术对细胞进行改造时，转导效率与添加胎牛 血清以及未添加任何添加剂增殖条件效果一致。

(5)采用基因工程技术修饰后的淋巴细胞，在添加了B27添加剂 的市售培养基中，增殖倍数与未修饰的淋巴细胞基本一致。

(6)采用基因工程技术修饰后的淋巴细胞增殖过程中和终点细胞 的亚群分布与未修饰的淋巴细胞一致。

(7)本发明对所测试的所有淋巴细胞激活方法激活的淋巴细胞都 有相似的扩增效果。

(8)B27培养淋巴细胞时的用量更少，更适于体外大规模培养， 并且工艺流程简单易控，扩增效果更佳。

附图说明

图1是示出B27在PBMC增殖上表现出类似或更优的效果的图。

图2是示出B27在培养PBMC上表现出类似的表型分析图形的图。

图3是示出B27在维持PBMC的增殖上呈剂量依赖关系的图。

图4是示出B27不影响PBMC转导的图。

图5是示出B27不影响转导的PBMC的细胞毒性活性的图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式及实验数据对本发明作进一步的说明。尽 管为了清楚的目的，在下文中使用了专用术语，但这些术语并不意味 着定义或限制本发明的范围。

在本发明中，术语“培养基”即细胞培养基，指营养物的水溶液， 其可以用来支持细胞生长和扩增。通常，细胞培养基包含以下成分： 能量来源，其通常将是糖类化合物，优选葡萄糖；氨基酸，优选碱性 组的氨基酸，包括所有必需和非必需氨基酸；维生素和/或以低浓度需 要的其他有机化合物；游离脂肪酸；无机化合物，包括痕量元素，无 机盐；缓冲化合物；及核苷和碱基。

在本发明中，“添加剂”是指可被添加到培养基中的任何物质。

在本发明中，术语“B27添加剂”是指B27添加剂及其同类产品， 还包括B27添加剂的后续改进或替代产品。所述B27添加剂等可以是 由赛默飞世尔公司(ThermoFisher)或英格恩生物公司(Engreen BiosystemCo.,Ltd.)出售的产品，也可以是其他公司出售的同类产品， 这类产品多用于神经细胞、海马神经元或CNS神经元的培养。本发明 的实施例中，采用的是由赛默飞世尔公司出售的B27添加剂。

在本发明中，术语“类似物”是指替换B27添加剂中的一种或多 种成分且具有与其类似的细胞培养效果的添加剂。

在本发明中，淋巴细胞可来自外周血淋巴细胞。待扩增的淋巴细 胞也可以是生物学样品中存在的淋巴细胞，例如上皮淋巴细胞、肿瘤 内浸润淋巴细胞、癌性腹水或胸水中的浸润淋巴细胞等。由于外周血 中的淋巴细胞分离简便、分离后淋巴细胞生存率高等原因，因此优选 地使用分离自新鲜外周血的淋巴细胞。更优选地，淋巴细胞是指分离 的外周血单个核细胞(PBMC)中的淋巴细胞。

实施例1PBMC的培养和激活

本发明中如无特殊说明，外周血提取的以及采用基因工程技术修 饰的PBMC，采用植物凝集素(PHA)、或抗CD3/CD28抗体(或抗 体偶联磁珠)激活后，在添加不同浓度比例的B27(从ThermoFisher 购得，货号为17504044)或胎牛血清的市售培养基中，添加白细胞介 素-2(IL-2)(100U/mL)在37℃和5％CO₂的条件下进行培养，每间 隔2天进行换液，并补加白细胞介素-2，体外扩增10-20天。

实施例2B27在PBMC增殖上表现出类似或更优的效果

在4种不同的不含有任何添加剂的市售培养基AIM-V(货号为 12055-091，培养基A)、X-VIVO(货号为04-418Q，培养基B)、TexMACS (货号为170-076-309，培养基C)和GT-T551H3(货号为WK593S， 培养基D)中，分别加入10％胎牛血清或4％B27，按如实施例1所述 的方法培养原代PBMC15天。累计细胞扩增倍数通过计数总细胞来测 量。

如图1所示，当用无任何添加的市售培养基培养PBMC时，基本 上很难维持PBMC的增殖。当在培养基A或B中培养PBMC时，B27 和胎牛血清在PBMC增殖上表现出类似的效果，比如淋巴细胞增殖倍 数在7天内超过200倍，14天内超过400倍；而当在培养基C和D中 培养PBMC时，胎牛血清不能维持PBMC的增殖，B27具有远远好于 胎牛血清的效果。因此，B27在PBMC增殖上表现出类似或更优的效 果。

实施例3B27在培养PBMC上表现出类似的表型分析图形

在4种不同的不含有任何添加剂的市售培养基AIM-V(货号为 12055-091，培养基A)、X-VIVO15(货号为04-418Q，培养基B)、 TexMACS(货号为170-076-309，培养基C)和GT-T551H3(货号为 WK593S，培养基D)中，分别加入10％胎牛血清或4％B27(从 ThermoFisher购得，货号为17504044)，按如实施例1所述的方法培 养原代PBMC15天。不同时间点的培养细胞样品取样后用PBS (Hyclone:SH30028.02B)离心洗涤，吸去上清，细胞沉淀用300μLPBS 重悬混匀，混匀后的细胞悬液平均分成三管(编号(1)、(2)和(3)) 每管100μL细胞悬液：

(1)作为阴性对照，不加任何检测抗体。

(2)CD3/4/8检测管，依次向该管中加入荧光标记的检测抗体各 2μL：

AntiHumanCD3FITC(TonboBiosciences:35-0037-T100)

AntiHumanCD4PE(TonboBiosciences:50-0048-T100)

AntiHumanCD8PreCP(TonboBiosciences:65-0088-T100)

(3)CD19/56检测管，依次向该管中加入荧光标记的检测抗体各 2μL：

PE-MouseantiHumanCD56(BDBiosciences:561903)

PreCP-antiHumanCD19(TonboBiosciences:65-0199-T100)

各样品管振荡混匀后，4℃避光孵育30分钟。取出样品管，每管 加入1mLPBS离心洗涤，去除上清，细胞沉淀分别用200μLPBS重 悬混匀。上述三管细胞样品为一组，分别转移至96孔圆底板，并于 CD3/4/8检测孔与CD19/56检测孔之间加入一孔PBS(200μL)。多个 细胞样品按照上述操作进行染色和样品准备。细胞样品于预先校验通 过的GuavaMillipore进行流式检测。

分析T淋巴细胞(CD3+)、CD4+T淋巴细胞(CD3+CD4+)、 CD8+T淋巴细胞(CD3+CD8+)、B细胞(CD19+)和NK细胞(CD56 +)的百分比。

如图2所示，添加B27的培养基中，增殖终点CD3阳性淋巴细胞比 率超过90％，增殖终点CD4或CD8阳性淋巴细胞比率也与胎牛血清非常 接近。即，用胎牛血清和B27培养PBMC，在表型分析中表现出类似的 图形。因此，在增殖过程中及增殖终点，淋巴细胞亚群分布与添加胎 牛血清以及未添加任何添加剂增殖的淋巴细胞亚群分布基本一致。

实施例4B27在维持PBMC的增殖上呈剂量依赖关系

将PBMC分别在X-VIVO15(货号为04-418Q，培养基B)和 TexMACS(货号为170-076-309，培养基C)中，按实施例1所述的方 法，以不同浓度的B27培养PBMC12天，每隔3天测量累计细胞扩增 倍数。累计细胞扩增倍数通过计数总细胞来测量。

如图3所示，在培养基B中较高浓度的B27(如2％和4％)引起 超过1600倍的PBMC的增殖，而低浓度的B27(例如0.25％、0.5％、 1％、1.25％、1.5％和1.75％)也足以维持PBMC增殖(>800倍扩增)。 类似地，在培养基C中较高浓度的B27(如2％和4％)引起超过650 倍的PBMC的增殖，而低浓度的B27(例如0.25％、0.5％、1％、1.25％、 1.5％和1.75％)也足以维持PBMC增殖(>350倍扩增)。因此，B27 在维持PBMC的增殖上呈剂量依赖性，并且与神经细胞的常规使用浓 度2％相比，在淋巴细胞中只需要0.25％B27即可维持PBMC正常增殖， 从而最小化添加剂对细胞的可能的不利影响。

此外，在培养基B中，10％胎牛血清只有900倍左右的PBMC的 增殖，而在培养基C中仅有100倍左右的PBMC的增殖。也就是说， 低浓度的B27(例如0.25％、0.5％、1％、1.25％、1.5％和1.75％)的增 殖效果优于10％胎牛血清的增殖效果。

实施例5B27不影响PBMC转导

在不含有任何添加剂的培养基B中，加入10％胎牛血清或4％B27， 如实施例1所述的方法培养激活的原代PBMC，并用含有嵌合抗原受 体(CAR)和GFP报告基因的慢病毒载体转导。通过在转导后3天、6 天和10天时GFP阳性细胞的百分比来量化转导效率。此外，累计细胞 扩增倍数通过计数总细胞来测量。

如图4a所示，在含有胎牛血清和B27的培养基中PBMC的转导 效率是类似的。此外，如图4b所示，转导后的PBMC与用胎牛血清培 养的PBMC相比，扩增速度也是类似的。因此，B27不影响PBMC的 转导效率和转导后的扩增速度。

实施例6B27不影响转导的PBMC的细胞毒性活性

用含有嵌合抗原受体(CAR)和GFP报告基因的慢病毒载体转导 激活的PBMC。转导6天后，PBMC与人肿瘤细胞系共培养，进行细 胞毒性测定。

在图5中，UT表示未转导PBMC，TT表示CAR转导的PBMC。 如图5a所示，CAR转导的PBMC表现出对肿瘤细胞的特异性细胞毒 性活性。如图5b和5c所示，用hIFNg和hIL2的浓度的增加表明T细 胞的刺激和增殖程度。由此可见，B27不影响转导的PBMC的细胞毒 性活性。

以上，基于本发明的实施方式进行了说明，但本发明不限定于此， 本领域的技术人员应该明白，在本发明的主旨的范围内能够以进行变 形和变更的方式实施，这样的变形和变更的方式，理应属于本发明的 保护范围。