人类细胞因子CCDC134在自身免疫性疾病中的应用

摘要

本发明公开了人类细胞因子CCDC134在自身免疫性疾病的应用，具体是以该细胞因子的基因或蛋白质作为检测标志物和/或治疗药物有效成分，制备CD4

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学及免疫学技术领域，细胞因子的新用途，具体涉及人类细胞因子CCDC134在制备CD4⁺T细胞功能异常介导的相关疾病中作为标志物和/或治疗药物方面的应用。

背景技术

人类细胞因子CCDC134（Coiled-CoilDomainContaining134）是本专利的发明人2008年在国际上首先报道的具有功能活性的新分子。在前期工作中，已证实CCDC134是一个经典分泌蛋白，在MAPK(Mitogen-ActivatedProteinKinase）信号通路的转录调节中发挥重要负向调控作用（HuangJ,etal.CellMolLifeSci.2008.65(2):338-349）；CCDC134又可作为一个核蛋白，与其相互作用蛋白hADA2a(humanTranscriptionalAdaptor2a)共同组成核蛋白复合物，发挥对p53基因转录活性的调节作用(HuangJ,etal.ChineseSciBμLl.February,2011.Vol.56.No.4-5:397–405)。该基因在哺乳动物中进化保守，与已知的人类基因或蛋白没有同源性，编码229个氨基酸，蛋白分子量为26kDa，具有糖基化修饰位点，人与小鼠氨基酸序列同源性为89%，而去掉信号肽的分泌形式，二者的氨基酸序列同源性更高达95%。

人类细胞因子CCDC134的基因在多种正常组织、胎儿组织、肿瘤组织都有表达，说明其为人体自身重要的一个分泌蛋白（HuangJ,etal.CellMolLifeSci.2008.65(2):338-349）。前期研究表明人类细胞因子CCDC134的或小干扰RNA可用于制备预防和/或治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫病等的药物，尤其是MAPK信号途径相关的肿瘤、炎症及神经系统疾病等。然而相关实验结果仅表明该细胞因子对淋巴细胞增殖有一定影响作用，并可能在T淋巴细胞发育和B淋巴细胞成熟过程中发挥一定的作用，促进T淋巴细胞活化，同时可能影响巨噬细胞抗细菌免疫的功能。

对于人类细胞因子CCDC134的研究虽然取得了一定进展，但其功能仍然未全面开发，例如在免疫学方面，目前的研究仅表明其对CD8⁺T细胞具有一定的促进活化、增殖和特异性杀伤作用，发挥抗肿瘤效应。

发明内容

为了进一步研究人类细胞因子CCDC134的生物学活性及作用机理，开发其临床应用价值，本发明通过更加深入的研究发现，其可以在某些CD4⁺T细胞亚群功能异常介导的自身免疫性疾病方面发挥特殊的作用。

以往的研究表明人类细胞因子CCDC134的重组蛋白作用于人外周血淋巴细胞或小鼠脾脏单细胞悬液，可以明显促进CD8⁺T细胞的活化和增殖；之后将小鼠CD4⁺T和CD8⁺T细胞分离纯化后直接用CCDC134重组蛋白作用，发现CCDC134蛋白可以直接作用于CD8⁺T细胞的活化，促进其增殖和增强抗原特异性杀伤活性；但对混合CD4⁺T细胞的活化和增殖没有明显效应。由于研究结果显示重组CCDC134蛋白直接作用于CD8⁺T细胞，发挥较强的免疫调节作用，以致认为其对于机体的免疫系统影响仅作用于CD8⁺T细胞。

而本研究发现，人类细胞因子CCDC134能够抑制na?veCD4⁺T细胞的增殖，也能促进na?veCD4⁺T细胞向Th1和/或Treg细胞分化，因此其可以应用于CD4⁺T细胞相关的自身免疫性疾病。

基于此研究成果，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了人类细胞因子CCDC134在自身免疫性疾病中的应用，是以该细胞因子的基因或蛋白质作为检测标志物，制备CD4⁺T细胞亚群功能异常介导的自身免疫性疾病的检测试剂。

人类细胞因子CCDC134的基因和蛋白质序列均为已知，其在NCBI中对应的mRNA和蛋白质的记录号分别为NM_024821和NP_079097，其基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

作为优选方案，以上所述的应用中，所述CD4⁺T细胞亚群为Th1和/或Treg。

作为优选方案，以上所述的应用中，所述自身免疫性疾病为CD4⁺T细胞亚群Th1和Treg功能异常介导的多发性硬化症。

本发明还提供一种体外检测人类细胞因子CCDC134蛋白的试剂盒，包括以下试剂：

包被缓冲液：0.05M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6；

样品分析缓冲液：含有0.05%(v/v)吐温20的PBS；

标准品：纯化的重组CCDC134蛋白；

R1包被抗体：兔抗CCDC134多克隆抗体；

M1检测抗体：鼠抗CCDC134单克隆抗体；

HRP标记羊抗鼠二抗；

封闭液：含2%BSA(w/v)和0.05%(v/v)吐温20的PBS；

浓缩洗涤液：含1%(v/v)吐温-20的20×PBS；

TMB底物（TMB即3,3',5,5'-四甲基联苯胺）；

终止液：2N硫酸。

其中，TMB为3,3',5,5'-四甲基联苯胺；BSA为牛血清白蛋白；PBS为磷酸盐缓冲液。w/v表示质量体积比，v/v表示体积比。

0.05M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液配方：碳酸钠(Na₂CO₃),1.59g；碳酸氢钠(NaHCO3),2.93g；调pH9.6,定容1L。

PBS配方：氯化钠(NaCl)，8g；氯化钾(KCl)，0.2g；磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)，1.44g；磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，0.24g；调pH7.2,定容1L。本发明还提供了人类细胞因子CCDC134的另外一种应用，是以该细胞因子的基因或蛋白质作为药物有效成分，制备CD4⁺T细胞亚群功能异常介导的自身免疫性疾病的治疗药物；所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

作为优选方案，以上所述的应用中，所述药物用于促进na?veCD4⁺T细胞向Th1和/或Treg细胞分化。

作为优选方案，以上所述的应用中，所述药物用于抑制CD4⁺T细胞增殖。

作为优选方案，以上所述的作为药物有效成分应用时，所述自身免疫性疾病为多发性硬化症。

另外，本发明还提供了一种人类细胞因子CCDC134蛋白的真核表达载体，是将SEQIDNO:1所示的核苷酸序列5’端连接Igk信号肽的编码基因后插入表达载体pMH的多克隆位点形成的重组质粒；所述Igk信号肽的编码基因核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。

所述的表达载体pMH为市售商品，可以直接向商家例如Biovector公司购买。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

我们通过实验研究发现：在体外实验条件下，重组CCDC134蛋白在单独CD4⁺T细胞培养体系中，当抗CD3&CD28抗体联合刺激时，CCDC134显示出抑制CD4⁺Ｔ细胞增殖的作用；并能调节na?veCD4⁺T细胞的分化，促进Th1和Treg细胞的生成；动物体内实验提示：实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis,EAE)小鼠模型中，CCDC134血清含量增高，同时重组CCDC134蛋白处理或CCDC134转基因小鼠均能显著减轻小鼠EAE的发病，相比较同窝阴性对照小鼠，转基因小鼠中中枢神经系统CD4⁺T细胞和单核巨噬细胞的浸润明显减少。上述结果均表明CCDC134可以作为治疗CD4⁺T细胞亚群功能异常介导的自身免疫性疾病特别是临床多发性硬化症的药物，用于制备相关诊断试剂盒治疗药物，为该种疾病的诊断和治疗提供了新的途径。

附图说明

图1：pMH-CCDC134-his6表达质粒核苷酸测序结果。序列为起始密码子-IgK（人免疫球蛋白Kappa轻链信号肽）-去除自身信号肽的CCDC134编码基因-6个histag-终止密码子，左侧灰色区域为起始密码子后的信号肽，右侧灰色区域为组氨酸标签，下划线为CCDC134去除自身信号肽的编码序列。

图2：重组人CCDC134-his6真核蛋白质量控制指标检测结果。

图3：利用CFSE检测重组CCDC134蛋白对CD4⁺Ｔ细胞增殖的抑制效应。实验中抗CD3&CD28的浓度分别为3μg/mL，1μg/mL。rhCC表示重组CCDC134蛋白。

图4：CCDC134对Th1，Th2，Th17细胞分化的作用；rhCC表示重组CCDC134蛋白。

图5：CCDC134促进iTreg细胞分化。其中A显示重组CCDC134蛋白在人na?veCD4⁺T细胞向iTreg细胞分化中的作用。其中，VSTM1为本实验室报道的一个能促进Th17细胞分化的蛋白；B和C显示重组CCDC134蛋白在小鼠脾细胞诱导向iTreg细胞分化中的作用。

图6：CCDC134三株单克隆抗体的鉴定。其中A为Westernblotting鉴定结果。1.pcDB对照质粒转染的HEK293T细胞裂解液；2.pcDB-CCDC134质粒转染的HEK293T细胞裂解液；rabbitpAb为兔抗CCDC134的多克隆抗体，作为阳性对照。B为ELISA鉴定结果。1#，5#和13#分别为三株单克隆抗体编号。

图7：CCDC134在正常人、MS患者和肿瘤患者血清中的ELISA检测结果。ELISA检测用特异性兔抗CCDC134多克隆抗体（R1）包被，鼠抗CCDC134单克隆抗体（M1）检测。左侧为标准曲线。M1为5#单抗，M2为13#单抗。

图8：CCDC134在自身免疫性疾病和炎症性疾病中的血清含量分析。其中A显示正常鼠与EAE、鼻炎、皮炎小鼠模型血清中CCDC134蛋白含量的比较；B显示小鼠EAE病程中CCDC134蛋白在血清含量的变化情况。Normal表示正常对照小鼠，Exp表示实验组小鼠。

图9：利用重组CCDC134蛋白和CCDC134转基因小鼠模型检测CCDC134处理对EAE小鼠脾脏髓鞘抗原特异性免疫细胞分泌细胞因子的影响。A为重组CCDC134蛋白处理的结果。B为CCDC134转基因鼠F0&15的结果；F0&15为CCDC134转基因小鼠。

图10：对照鼠（WT）和CCDC134转基因鼠（F0&15）脊髓组织的HE染色结果。

图11：利用CCDC134转基因小鼠模型检测CCDC134对EAE小鼠脾脏、腹股沟引流淋巴结和中枢神经系统浸润的免疫细胞亚群比例的影响。该图显示的是其中一次实验的统计结果，negative代表对照组，transgenic代表CCDC134转基因小鼠组。

图12：利用CCDC134转基因小鼠模型检测CCDC134对EAE小鼠脾脏髓鞘抗原特异性免疫细胞分泌细胞因子的影响。F0&15为CCDC134转基因小鼠。

图13：实时定量PCR结果。利用CCDC134转基因小鼠模型检测CCDC134对EAE小鼠脾脏髓鞘抗原特异性免疫细胞分泌细胞因子mRNA的影响。F0&15为CCDC134转基因小鼠。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：重组人CCDC134蛋白的制备

1.1构建了pMH-CCDC134-his6融合蛋白表达质粒，用于表达CCDC134-his6融合蛋白

方法：将CCDC134编码序列（SEDIDNO:1）插入pMH表达载体（Biovector公司，根据说明书操作），构建pMH-CCDC134-his6表达质粒（SEQIDNO:4），其中SEQIDNO:4的序列为：起始密码子atg-IgK信号肽基因（人免疫球蛋白Kappa轻链信号肽）-去除自身信号肽的CCDC134编码基因-6个histag-终止密码子tag。

结果：经DNA测序编码区序列正确（图1）。

1.2进行SDS-PAGE和WB验证目的蛋白的表达和纯化

方法：测序验证质粒的正确性后，委托江苏太仓美诺恒康生物技术有限公司进行制备和纯化。利用Qiagen公司质粒大提试剂盒提取pMH-CCDC134-his6质粒后，瞬时转染到HEK293F细胞，无血清培养基HEKG培养48小时后，收获转染后的上清，用Ni^2＋柱纯化上述处理后的细胞培养上清，进行目的蛋白的表达验证和纯化。用BCA的方法进行定量，SDS-PAGE和SEC-HPLC检测蛋白纯度，并用兔抗CCDC134蛋白抗体进行Westernblot检测蛋白特异性。

结果：成功表达和纯化获得人CCDC134-his6重组蛋白（图2）。

实施例2：重组人CCDC134蛋白对分离纯化CD4⁺T淋巴细胞增殖的影响

2.1人CD4⁺T淋巴细胞的获得

方法：从北京血液中心获得2U的浓缩白细胞血样，首先应用淋巴细胞分离液从正常人外周血中分离得到正常人外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC），然后从中用CD4⁺T细胞阳性分选磁珠（参照产品说明书）纯化得到CD4⁺T淋巴细胞；再从磁珠分选得到的CD4⁺T淋巴细胞中加入小鼠抗人CD45RO抗体和大鼠抗小鼠IgG2a分选磁珠去除CD45RO⁺细胞，余下的细胞即为CD45RA⁺的na?veT淋巴细胞。从中取出一部分（5×10⁵个），用FACS检测其纯度，步骤如下：加入200μL预冷的封闭液（5%FBS/PBS,v/v），4℃封闭30min，1800rpm离心5min，随后加入抗人CD45RA、CD45RO和CD4抗体鉴定所分选的CD4⁺na?veT淋巴细胞的纯度（抗体用量参照说明书）。（注：CD45RA和CD45RO是CD45（白细胞共同抗原）的两种异型，均属I型跨膜蛋白，广泛存在于白细胞表面。CD45RA⁺T细胞被称为“原始”T淋巴细胞，即未致敏T细胞，具有抑制免疫的作用；而CD45RO⁺T细胞被称为“记忆”T细胞，具有辅助诱导作用。），4℃避光孵育30min；使用相应IgG作为同型对照。最后用PBS洗涤两次后，通过流式细胞仪收集细胞，使用Cellquest软件对结果进行分析，纯度达90%以上。

2.2CD4⁺T淋巴细胞的体外活化

方法：将上述磁珠分选得到的na?veCD4⁺T淋巴细胞培养于用抗人CD3抗体（3μg/mL）和抗人CD28抗体（1μg/mL）包被的细胞培养板中（注：抗人CD3抗体和抗人CD28抗体用于刺激T淋巴细胞的体外激活，模拟体内环境），密度为2×10⁶个细胞/mL，培养基为RPMI1640，含10%补体灭活的FBS，37℃，5%CO₂条件下培养。

2.3CD4⁺T淋巴细胞增殖情况检测

方法：将分离纯化的na?veCD4⁺T细胞用5%FBS/PBS洗一遍，0.5~50×10⁶细胞内用1mL5%FBS/PBS重悬置于EP管中，在管盖上加入110μLPBS，在其中加入0.55μLCFSE使其终浓度为2.5μM，迅速盖上管盖，颠倒混匀几次并涡旋混匀，避光染色3到5分钟，然后用10倍体积5%FBS/PBS洗三遍，用5%FBS/RPMI1640重悬，稀释至细胞浓度为5×10⁵/mL进行铺板。于0hr时，在上述活化培养体系中加入不同终浓度（0.1/1/10/100ng/mL）的人重组CCDC134蛋白和等体积PBS，继续培养，于铺板后48小时、72小时和96小时收集细胞，用FACS进行检测。

结果：如图3所示，重组人CCDC134蛋白抑制人CD4⁺T的增殖。与T细胞的经典刺激剂IL-2同样也出现抑制CD4⁺Ｔ细胞增殖的作用。在抗原刺激强度下，低剂量IL-2能微弱促进CD4⁺T细胞的增殖，但浓度增高后产生抑制作用。主要是由于IL-2既能促进抗原活化的CD4⁺T细胞的反应，也是Treg细胞生成所必需的，而Treg细胞反过来会抑制反应性CD4⁺T细胞的应答。

实施例3：重组人CCDC134蛋白对na?veCD4⁺T淋巴细胞分化过程的影响

3.1分离人CD4⁺na?veT细胞和体外诱导分化Th1、Th2和Th17细胞，检测重组人CCDC134蛋白在其分化过程中的作用

方法：首先，利用磁珠分选得到na?veT淋巴细胞；为了体外诱导na?veT细胞的分化，我们将其培养于包被了抗CD3（1μg/mL；cloneOKT3）和抗CD28（2μg/mL；clone15E8）抗体的细胞培养板中，刺激其活化和增殖。如果诱导Th1细胞，则在培养体系中加入重组人IL-12（2.5ng/mL）、重组人IL-2（10ng/mL）和抗IL-4的抗体(5μg/mL)；如果诱导Th2细胞，则在培养体系中加入重组人IL-4(12.5ng/mL)、重组人IL-2（10ng/mL）、抗人IFN-γ(5μg/mL；cloneB-B)和抗人IL-10(5μg/mL)抗体；如果诱导Th17细胞，则在培养体系中加入重组人IL-1β（50ng/mL）、重组人IL-6（50ng/mL）、重组人IL-23（50ng/mL）、重组人TNF-α（10ng/mL）、重组人TGF-β1（5ng/mL）、抗人IL-4的抗体(5μg/mL)和抗人IFN-γ(5μg/mL)的抗体。同时我们在分化培养体系中，同时加入不同浓度的CCDC134重组蛋白或者对照，四天后，更换新鲜培养基，去除抗CD3和抗CD28抗体，其余细胞因子和抗体不变，继续培养三天，其中Th17细胞分化中加入重组人IL-2（5ng/mL）。Th1和Th2诱导培养14天，7天一个周期。Th17诱导培养7天即可。利用FACS检测Th1、Th2、Th17和iTreg细胞的特征性细胞因子（IFN-γ，IL-4，IL-17A）表达情况。

结果：重组人CCDC134蛋白能明显促进Th1细胞的分化，而不影响Th2和Th17细胞的分化（图4）。

3.2分离人CD4⁺na?veT细胞和体外诱导分化iTreg细胞，检测重组人CCDC134在其分化过程中的作用

方法：为了体外诱导na?veT细胞的分化为iTreg细胞，我们将其培养于包被了抗CD3（1μg/mL；cloneOKT3）和抗CD28（2μg/mL；clone15E8）抗体的细胞培养板中，刺激其活化和增殖。同时加入重组人TGF-β1（50ng/mL）和重组人IL-2（5ng/mL）。并加入不同浓度的CCDC134重组蛋白或者对照，四天后，更换新鲜培养基，去除抗CD3和抗CD28抗体，其余细胞因子不变，继续培养三天，iTreg诱导培养7天即可诱导分化。诱导分化后用PMA(100ng/mL)和ionomycin(1μM)刺激细胞6小时，收获细胞提取RNA，通过Real-timePCR检测相应细胞特异的细胞因子和转录因子mRNA水平的变化。

结果：如图5A所示，重组人CCDC134蛋白能明显上调Foxp3的转录水平，表明人类细胞因子CCDC134的蛋白能促进iTreg细胞的分化（同样，在Th17分化体系下，CCDC134不影响IL-17A以及其转录因子Rorc的转录水平）。

3.3重组人CCDC134蛋白促进小鼠iTreg细胞的分化

方法：制备小鼠脾单细胞悬液，用na?veCD4⁺Tcell分选磁珠获得纯化na?veCD4⁺T细胞，同样在培养体系加入抗CD3和抗CD28抗体，以及TGF-β，IL-2诱导分化成iTreg细胞，同时加入不同浓度CCDC134或者对照，72小时后，收集细胞检测其中iTreg细胞的比例。

结果：与不加入TGF-β的未极化体系相比，TGF-β分化体系能诱导低水平iTreg细胞的分化。并且重组人CCDC134蛋白能促进iTreg细胞的分化，在较低浓度范围内（0.1~1ng/mL），重组人CCDC134蛋白促分化的作用呈现剂量依赖性，以1ng/mL浓度作用最强，之后作用减弱，达到50ng/mL时，作用消失（图5B和5C）。

实施例4：小鼠抗人CCDC134单克隆抗体的制备、鉴定和纯化

方法：委托华大基因公司用纯化的CCDC134-GST原核蛋白免疫3只小鼠制备单克隆抗体。三次免疫后进行鉴定，效价达10⁵以上进行杂交瘤细胞融合，挑选克隆，获得多株小鼠单克隆抗体，利用Westernblotting方法鉴定。最终获得三株小鼠单克隆抗体，并进一步利用ELISA和Westernblotting方法鉴定后，之后用proteinG进行纯化备用。

结果：所获得的三株小鼠单克隆抗体均能特异性结合CCDC134蛋白（图6）。

实施例5：内源性人和小鼠CCDC134蛋白含量测定

5.1CCDC134蛋白的ELISA检测方法的建立

构建基于ELISA方法的体外检测人类细胞因子CCDC134蛋白的试剂盒，包括以下试剂：

试剂成分包被缓冲液0.05M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH 9.6，25mL×1样品分析缓冲液含有0.05%(v/v)吐温20的PBS。PBS为磷酸盐缓冲液，含有磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠和氯化钾，pH7.2，25mL×1标准品纯化的重组CCDC134蛋白，1ng/mL, 0.1mL×2R1包被抗体兔抗CCDC134蛋白多克隆抗体，0.1mL×1M1检测抗体鼠抗CCDC134蛋白单克隆抗体，0.1mL×1HRP标记羊抗鼠二抗中杉金桥公司购买，0.1mL×1封闭液含有2%(w/v)BSA和0.05%(v/v)吐温20的PBS浓缩洗涤液 20×含1%(v/v)吐温-20的20×PBS，规格 50mL×1。使用时用水稀释，稀释后为1×。TMB底物15mL×1终止液2N硫酸，15mL×1

方法：用R1包被抗体包被待检样品，包被终浓度4μg/mL，50μL体积，4℃过夜；300μL洗涤液(含0.05wt%吐温20的PBS)洗板，洗五遍，用300μL的体积浓度为3%的封闭液封闭，37℃，2小时；300μL洗涤液洗板，洗五遍，加入不同浓度标准品（1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL），37℃孵育2小时；300μL洗涤液洗板，洗五遍，加入M1检测抗体（可以使用上述实施例4的鼠抗CCDC134单克隆抗体，5#或13#，检测结果一致），终浓度2μg/mL，50μL体积，37℃孵育2小时；300mL洗涤液洗板，洗五遍，加入50mLHRP标记羊抗鼠二抗(1:5000)稀释，37℃孵育1小时；300μL洗涤液洗板，洗五遍，加入50μLTMB显色10~20分钟，加入50μL终止液终止，酶标仪读取OD490-570。其中，所有抗体均用0.3%BSA/PBST(v/v)稀释。每个样本设立三个复孔。

结果：本发明试剂盒能特异性识别重组人CCDC134蛋白，其最低浓度范围可至1ng/mL（图7）。

5.2ELISA测定人血清中CCDC134水平

方法：从临床获得正常人、MS患者和肿瘤患者血清，用PBS稀释3倍后使用上述试剂盒检测其中CCDC134蛋白的含量（图7）。

结果：利用该试剂盒可以识别人血清中CCDC134蛋白，且MS患者中CCDC134蛋白含量稍高于正常人水平。

5.3ELISA测定小鼠血清中CCDC134水平

方法：小鼠内眦取血，4℃静置过夜后，440g离心30min后取上清，25000g离心15min后获得血清，用PBS稀释3倍后使用上述试剂盒检测其中CCDC134蛋白的含量。用ELISA分析了小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）以及鼻炎（rhinitis）和皮炎（dermitis）模型中CCDC134蛋白的血清水平。

结果：利用该试剂盒可以识别小鼠血清中CCDC134蛋白；并且在EAE以及鼻炎和皮炎发生过程中，CCDC134蛋白的血清水平明显增高；其血清水平在EAE整个病程进展中均明显高于正常对照小鼠（图8）。

实施例6：利用小鼠EAE模型探讨CCDC134在自身免疫性疾病中的作用

6.1建立小鼠EAE模型

方法：将抗原MOG_35-55（髓鞘少突胶质细胞糖蛋白片段）用生理盐水稀释成5mg/mL，并按1∶1等体积加入CFA（弗氏佐剂），加入结核杆菌H37Ra使其终浓度为1.5mg/mL，充分混合乳化。乳化后按每只0.2mL于C57BL/6小鼠脊柱两侧分五点皮下注射，第0及第48小时小鼠尾静脉注射0.2mLPTX（200ng/只）。免疫当天起采用国际通用的5分制法对实验小鼠进行神经功能评估，依据Kerlero等提出的标准对其进行神经功能评分，具体评分标准如下：0分无症状；1分尾部失去张力；2分后肢力弱；3分后肢瘫痪；4分后肢及前肢瘫痪；5分濒临死亡或死亡。当临床症状介于两个评分之间时以较低分数加0.5分表示。

结果：成功建立小鼠EAE模型

6.2利用重组CCDC134蛋白和CCDC134转基因小鼠探讨其在EAE发病过程中的作用

方法：将C57BL/6小鼠被随机分成数目相同的两组（每组5-7只小鼠）。我们用mMOG_35-55多肽诱导C57BL/6小鼠发病，建立EAE小鼠模型，在免疫后第一天开始给予重组CCDC134蛋白或PBS（溶解重组蛋白所用的灭菌盐溶液）对照，持续至15天。每日观察小鼠并进行神经功能评分。

利用相同的方法在CCDC134转基因小鼠或同窝阴性鼠建立了EAE模型，对两组小鼠的临床症状进行评分。

结果：重组CCDC134蛋白处理可以明显减轻EAE的病情，撤除重组CCDC134蛋白，其抑制EAE发病的作用在后期消失。与同窝阴性鼠相比，CCDC134转基因小鼠发病时间较晚，病情较轻（图9）。

目前主要是用实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis,EAE)小鼠模型来模拟MS发病过程。EAE主要由Th1细胞介导的，Th2细胞对EAE有保护作用，EAE动物体内存在着Th1/Th2的失衡,并且Th1细胞>Th2细胞。此外在EAE研究中，将诱导分化的特异性Th细胞包括Th1、Th2、Th17和Th9过继到正常小鼠体内，结果发现除Th2细胞外，Th1、Th17和Th9都能够诱发EAE。Th1细胞分化的转录因子STAT4和T-bet对诱导EAE的发生也是必需的。在疾病恶化期，Th1细胞效应明显，产生典型的Th1炎症反应。

以往认为Th1/Th2失衡是导致多发性硬化的发病因素，而现在越来越多的证据表明Th17/Treg的失衡更能解释多发性硬化的发病。在MS病人的血和脑脊液中，存在着一种或多种自身抗体与反应性T淋巴细胞；其外周血CD4⁺CD25⁺细胞的Foxp3mRNA与蛋白水平均显著降低；与正常对照相比，在一定浓度的anti-CD3抗体刺激下，来自MS的CD4⁺CD25⁺T细胞抑制抗原特异性T细胞的增殖反应与免疫应答的能力均显著降低，Treg功能下降与Foxp3表达降低密切相关。MS来源的CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞的抑制功能异常与疾病病程相关，推测Treg可能参与疾病。此外，Treg可分泌一些抑制性细胞因子调节来间接发挥免疫抑制作用，如IL-10和TGF-β均是天然Treg分泌的抑制性细胞因子之一，可以抑制T细胞的增殖和抑制T细胞产生细胞因子。本实验进一步提示人类细胞因子CCDC134基因或蛋白是通过上调Foxp3的转录水平，促进iTreg细胞的分化来抑制CD4⁺T细胞的增殖，进而抑制EAE疾病的发展。

实施例7：利用EAE小鼠模型从分子和细胞水平探讨CCDC134在EAE发生发展中的免疫学机制

7.1形态学方法观察EAE发病模型中CCDC134转基因和正常对照小鼠的差别

方法：在EAE发病高峰期（第17~20天）处死小鼠，每组各取3只小鼠，经水合氯醛麻醉后，取脊髓腰骶段石蜡包埋,5μm连续切片，进行HE染色分析。蒸馏水冲洗，95%酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片保存。

结果：如图10所示，与阴性对照鼠相比，转基因小鼠的脊髓浸润免疫细胞明显减少，提示其发病较轻。

7.2脾脏、引流淋巴结和中枢神经系统中浸润免疫细胞分析

方法：在EAE发病高峰期（第17~20天）处死小鼠，每组各取5~7只CCDC134转基因和阴性对照小鼠，进而分离小鼠脾脏免疫细胞、腹股沟引流淋巴结和中枢神经系统浸润的免疫细胞，对于脾脏和腹股沟引流淋巴结，直接研磨，过150目筛网得到单细胞悬液并计数即可置于冰上备用；而对于中枢神经系统浸润的免疫细胞分离，获得全部的脊髓，研磨过150目筛网得到单细胞悬液并计数。之后采用percoll密度梯度离心的经典方法从该悬液中分离免疫细胞，用3mL40%的percoll重悬，轻轻铺于3mL60%的percoll之上；400g无刹车离心30分钟，吸净淋巴细胞层的细胞，计数该层总细胞数，用PBS洗两遍置于冰上备用。

细胞膜分子检测：加入200μL预冷的封闭液（5%FBS/PBS,v/v），4℃封闭30min，1800rpm离心5min，随后加入直标的抗体（抗体用量参照说明书），4℃避光孵育30min；使用相应IgG作为同型对照。最后用PBS洗涤两次后，通过流式细胞仪收集细胞，使用Cellquest软件对结果进行分析。

细胞内分子检测：利用引流淋巴结单细胞悬液用PMA(100ng/mL)和ionomycin(1μM)刺激细胞6小时，提前两小时加入BFA（终浓度：10μg/mL）抑制细胞因子的分泌，之后收获细胞，用冷的PBS洗涤两次，首先用4%多聚甲醛冰上固定30min；然后用打孔封闭液室温孵育10min，1800rpm离心5min，弃上清，随后加入不同标记的抗体，4℃避光孵育40min；使用相应IgG作为同型对照。最后用PBS洗涤两次后，通过流式细胞仪收集细胞，使用Cellquest软件对结果进行分析。

细胞培养上清中细胞因子水平检测：利用引流淋巴结单细胞悬液铺板，用不同浓度mMOG35-55多肽再次活化引流淋巴结免疫细胞，利用ELISA分析上清中细胞因子IL-17A，IFN-γ，IL-6的分泌情况。

细胞因子mRNA水平检测：研磨对照小鼠和转基因小鼠脊髓组织（每组各3~5只小鼠），参照说明书提取总RNA，每个样品取5ug，逆转录合成单链cDNA文库。分别使用细胞因子特异性引物进行PCR扩增；Gapdh作为内参。试剂PCRmasterMix购自PowerSYBRGreen公司，引物由北京生工公司合成。通过7500HTFastReal-TimePCRSystem完成测试分析。

结果：CCDC134转基因鼠与对照鼠相比，CD4⁺T细胞数量明显减少，Th1和Treg细胞比例稍有增加，Th17细胞比例没有明显变化，B细胞数量增加（图11）。与对照组相比，CCDC134转基因鼠中特异性T细胞IFN-γ分泌增加，而IL-17A和IL-10的分泌没有明显差异（图12）。mRNA水平检测显示相比较对照小鼠，转基因小鼠脊髓中IFN-γ和TGF-βmRNA水平上调（图13）。上述结果提示提示CCDC134通过介导Th1和Treg细胞功能进而调节EAE发病情况。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCELISTING

<110>北京大学

<120>人类细胞因子CCDC134在自身免疫性疾病中的应用

<130>P20150222

<160>4

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>621

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

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<212>PRT

<213>人工序列

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<212>DNA

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