疟原虫随机重组抗原-1在制备筛查和/或评估恶性疟疾流行强度的试剂盒中的用途

摘要

本发明涉及疟原虫随机重组抗原-1在制备筛查和/或评估恶性疟疾流行强度的试剂盒中的用途。另一方面，本发明涉及一种用于检测待测血清中疟原虫抗体的间接ELISA试剂盒，其中所述试剂盒包括包被于96孔板的0.1μg/100μl疟原虫随机重组抗原-1，所述待测血清用PBS稀释至1:200。

说明书

技术领域

本发明涉及疟原虫的检测领域。具体地，恶性疟疾随机重 组抗原-1(M.RCAg-1)在制备用于筛查和/或评估恶性疟疾流行强度的 试剂盒中的用途。

背景技术

疟疾是严重危害人类健康的一种传染性疾病,感染人的疟原虫主 要有恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、三 日疟原虫(P.malariae)和卵型疟原虫(P.ovale)4种，其中危害最为 严重的当属恶性疟原虫。疟原虫生活史复杂，有人和按蚊两个宿主， 疟原虫在人体内分为肝期和红内期，红内期又有四种不同的形态：环 期，滋养体期，裂殖体期和裂殖子期，不同阶段抗原多变，这也为疟 疾的防控工作增加了难度。

经过多年的研究探索，疟疾防治工作已经取得了巨大的进步，但 是该疾病仍然严重地威胁着人类的健康，据WHO报道，2013年全球 有584000人因感染疟疾而死亡，多数集中在非洲五岁以下的儿童和孕 妇。我国疟疾主要分布在中部省份以及海南和云南两省，以间日疟为 主(80％)，恶性疟主要发生在云南省，该省位于疟疾重灾区大湄公河 次区域，参见Cui,L.,等人,MalariaintheGreaterMekongSubregion: heterogeneityandcomplexity.ActaTrop,2012.121(3):p.227-39。毗邻缅 甸等疟疾高发国家，由于边境地区贸易频繁、出境务工人员流动大， 这使得云南省尤其中缅边境地区疟疾传播强度大，并且防治困难。近 年来，随着到非洲务工或经商的中国人和来自非洲的当地人数不断增 加，造成疟疾传播的隐患，值得引起重视。因此，继续加强对疟疾流 行区和非流行区的防控工作仍有十分重要的意义。

目前许多国家和地区致力于疟疾的控制和消除，我国政府于2010 年发布《中国消除疟疾行动计划(2012-2020年)，卫疾控发〔2010-47 号〕》，要求在2010年全面开展消除疟疾工作，到2020年全国实现消 除疟疾的目标。WHO提出疟疾消除阶段的目标是在某一国家或地区阻 断疟疾在当地的传播，防止出现新的输入性继发病例，并以连续3年 无本地感染疟疾病例(蚊传)作为消除疟疾的主要效果指标，参见 Mendis,K.,等人,Frommalariacontroltoeradication:TheWHO perspective.TropMedIntHealth,2009.14(7):p.802-9。所以该阶段急需 加强疟疾的监测力度，除了依赖医疗机构被动病例侦查去发现病例之 外，更需要增加主动病例侦查措施，及时搜索潜在病例和带虫者。

因此，血清学抗体检测在该阶段发挥着重要的作用，主要包括： 检测抗体水平，第一，有助于人群免疫水平监测；第二，评估疟疾流 行强度：疟疾抗体的特征，即带虫免疫(Premunition)，参见Perignon, J.L.andP.Druilhe,Immunemechanismsunderlyingthepremunition againstPlasmodiumfalciparummalaria.MemInstOswaldoCruz,1994.89 Suppl2:p.51-3，使得人群中血清抗体水平可以反映当地的疟疾流行强 度，参见Perignon,J.L.andP.Druilhe,Immunemechanismsunderlyingthe premunitionagainstPlasmodiumfalciparummalaria.MemInstOswaldo Cruz,1994.89Suppl2:p.51-3；Corran,P.,等人,Serology:arobust indicatorofmalariatransmissionintensity？TrendsParasitol,2007.23(12): p.575-82；Drakeley,C.J.,等人,Estimatingmedium-andlong-termtrends inmalariatransmissionbyusingserologicalmarkersofmalariaexposure. ProcNatlAcadSciUSA,2005.102(14):p.5108-13；Stewart,L.,等人, Rapidassessmentofmalariatransmissionusingage-specific sero-conversionrates.PLoSOne,2009.4(6):p.e6083；第三，主动侦查感 染者和带虫者：覆盖面广，受检人群数量大。

达到以上目标需要采用简便可行的筛查方法，而目前用于疟疾筛查 的方法尚有限，近年研发的高通量核酸检测技术，参见Cheng,Z.,等 人,Anovel,sensitiveassayforhigh-throughputmoleculardetectionof plasmodiaforactivescreeningofmalariaforelimination.JClinMicrobiol, 2013.51(1):p.125-30，如检测血液中的疟原虫18S核糖体RNA，有很 高的灵敏性和特异性，但是对检测环境和检测仪器等要求依然较高， 在经济较为落后、卫生条件有限的疫区实施仍有一定的困难。

很多研究调查表明，抗体检测有作为疟疾筛查方法的潜力，检测 用抗原主要是恶性疟原虫固有蛋白，包括裂殖子表面蛋白1(MSP-1)， 参见Badu,K.,等人,MarkedvariationinMSP-119antibodyresponsesto malariainwesternKenyanhighlands.BMCInfectDis,2012.12:p.50；裂 殖子表面蛋白2(MSP-2)，参见Polley,S.D.,等人,Highlevelsofserum antibodiestomerozoitesurfaceprotein2ofPlasmodiumfalciparumare associatedwithreducedriskofclinicalmalariaincoastalKenya.Vaccine, 2006.24(19):p.4233-46；裂殖子表面蛋白3(MSP-3)参见Segeja,M.D., 等人,Acquisitionofantibodiestomerozoitesurfaceprotein3among residentsofKorogwe,northeasternTanzania.BMCInfectDis,2010.10:p. 55；裂殖子表面蛋白4(MSP-4)参见Wang,L.,等人,Naturallyacquired antibodyresponsestoPlasmodiumfalciparummerozoitesurfaceprotein4 inapopulationlivinginanareaofendemicityinVietnam.InfectImmun, 2001.69(7):p.4390-7；恶性疟原虫顶端膜抗原1(AMA1)参见Polley, S.D.,等人,Humanantibodiestorecombinantproteinconstructsof PlasmodiumfalciparumApicalMembraneAntigen1(AMA1)andtheir associationswithprotectionfrommalaria.Vaccine,2004.23(5):p.718-28 以及肝期特异的抗原-1和-3(PfLSA-1,PfLSA-3)参见Kim,T.S.,等人, ComparisonoftheantibodyresponsestoPlasmodiumvivaxand PlasmodiumfalciparumantigensinresidentsofMandalay,Myanmar. MalarJ,2011.10:p.228等。

相比于核酸检测方法，抗原抗体检测研究对象是蛋白，结构稳定， 操作简单，对检测环境要求不高，更不需要特殊检测仪器，成本较低。 尽管灵敏度和特异度达不到核酸检测的高度，但是在经济卫生条件较 差的疫区，作为一种疟疾流行的筛查和趋势评价，仍有很大的优势。

目前用于间日疟原虫感染的血清学筛查方法已有研究，应用重组 PvMSP1-19和-42蛋白检测病人血清中的抗体水平，参见Chen,J.H.,等 人,Measurementofnaturallyacquiredhumoralimmuneresponsesagainst theC-terminalregionofthePlasmodiumvivaxMSP1proteinusingprotein arrays.ParasitolRes,2011.109(5):p.1259-66，敏感度接近90％，特异度 可达90％以上。

鉴于疟原虫生活史复杂，抗原多样，所以要想通过检测抗体水平 达到上述目的，必然对用于检测的抗原有很高的要求：①为了提高检 测的特异性，所用抗原必须来自恶性疟原虫特异性蛋白，②为了提高 检测的敏感性，所用抗原应包括恶性疟原虫多期多种抗原。

因而，目前仍然需要开发针对恶性疟疾抗体进行检测的抗原蛋白。

发明内容

本发明人实验室在之前的研究中构建了一种多表位嵌合蛋白-疟原 虫随机重组抗原-1(MalariaRandomConstructedAntigen-1； M.RCAg-1)，参见Cai,Q.,等人,Immunogenicityandinvitroprotective efficacyofapolyepitopePlasmodiumfalciparumcandidatevaccine constructedbyepitopeshuffling.Vaccine,2007.25(28):p.5155-65，其包 括11个恶性疟原虫特异性B细胞和T细胞表位，可覆盖肝期和红内期， 对疫区恶性疟疾患者血清抗体有很好的识别性，因此具有用于人群恶 性疟原虫特异性抗体检测的技术优势。

一方面，本发明提供了疟原虫随机重组抗原-1在制备用于筛查和/ 或评估恶性疟疾流行强度的试剂盒中的用途。

根据本发明所述的用途，其中所述试剂盒是间接ELISA试剂盒。

根据本发明所述的用途，其中所述试剂盒用于检测待测血清中的 恶性疟原虫抗体。

另一方面，本发明提供了一种用于筛查和/或评估恶性疟疾流行强 度的间接ELISA试剂盒，所述试剂盒含有包被于固体支持物的疟原虫 随机重组抗原-1。

根据本发明所述的用于筛查和/或评估恶性疟疾流行强度的间接 ELISA试剂盒，其中所述疟原虫随机重组抗原-1被pH9.2的0.1M碳酸 盐包被缓冲液稀释至0.1μg/100μl。

根据本发明所述的用于筛查和/或评估恶性疟疾流行强度的间接 ELISA试剂盒，其中所述固体支持物是96孔板。

根据本发明所述的用于筛查和/或评估恶性疟疾流行强度的间接 ELISA试剂盒，其中所述试剂盒用于检测待测血清中的恶性疟原虫抗 体。

再一方面，本发明提供了用于检测待测血清中恶性疟原虫抗体的 间接ELISA试剂盒，其中所述试剂盒包括包被于96孔板的0.1μg/100μl 恶性疟原虫随机重组抗原-1，所述待测血清用PBS稀释至1:200。

附图说明

图1A至1C：不同批次蛋白的质量检测及对血清检测的影响。

图1A：条带1-3是由韦氏博慧色谱科技有限公司制备和纯化的不 同批次的M.RCAg-1蛋白，蛋白结构不稳定，-80度保存，仍有严重降 解现象；

条带4-7是中国科学院过程工程研究所制备和纯化的M.RCAg-1蛋 白，加有稳定剂，相同保存方式，蛋白结构稳定，几乎没有降解发生。

图1B：蛋白降解后对血清抗体检测的影响。1-3应用来源于公司 的发生降解的蛋白，4-6应用来自过程所的未发生降解的蛋白，6种蛋 白对4例血清检测结果一致。

图1C：稳定剂对血清抗体检测的影响。透析前蛋白中含有蛋白 稳定剂，透析后蛋白稳定剂被去除，透析前和透析后蛋白对16例血清 检测结果趋于一致。

图2：M.RCAg-1对正常人、间日疟和恶性疟疾病人血清的抗体识 别情况。

图3A-3C：应用血清抗体检测技术对疫区居民进行筛检的实验结 果。图3A：筛检地点是海南儋州市居民(n＝150)。图3B：筛检地点是 云南丘山(n＝491)。图3C：筛检地点是中缅边境：缅甸的拉咱市(n＝575) 和中国云南的盈江县(n＝152)，镜检和高灵敏度核酸检测未发现恶性疟 疾病人，有12例间日疟疾病人。

具体实施方式

首先，本发明使用恶性疟原虫随机重组抗原-1(M.RCAg-1)检测 了实验室存储样本：67例恶性疟疾病人血清和108例正常人血清，灵 敏度和特异度达到90％以上；其次，本发明完成了疫区1368例居民血 清检测：其中海南儋州市150例，云南丘山491例，中缅边境727例， 敏感度和特异度也都在90％以上。证实此抗原能够特异性检出血清中 恶性疟原虫抗体水平，因此可用于筛查或评价不同地区疟疾流行强度。

另一方面，本发明使用恶性疟原虫随机重组抗原-1(M.RCAg-1) 具有以下的优点：

1)此抗原对检测用血清蛋白的质量要求并不严格，允许有部分降 解，添加的蛋白稳定剂也不影响抗体检测(图1A至图1C)：

2)区分正常人和恶性疟疾病人时敏感度和特异度都可达到90％ 以上(图2)；

3)不同地区人群抗体水平的比较可以反映疟疾流行强度的差异 (图3A至3C)。

因此，相比于核酸检测，该方法的优势在于成本低，操作简单， 对检测环境要求不高，更不需要特殊检测仪器，同时可以实现高通量。

实施例1：抗原蛋白的合成和检测

M.RCAg-1蛋白由韦氏博慧色谱科技有限公司和中国科学院过程工 程研究所制备并纯化，公司制备的蛋白稳定性差，易降解；过程工程 研究所蛋白溶液中添加了稳定剂，蛋白稳定性好。实验检测，蛋白降 解以及稳定剂对抗体识别的影响：

通过普通SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质量。

溶液配制：

【1.5MTris·HCl(pH8.8)】

Tris18.6g

去离子水50ml

1NHCl调节pH8.8，补足去离子水至100ml。

【1.0MTris·HCl(pH6.8)】

Tris碱12.1g

去离子水50ml

1NHCl调节pH6.8，补足去离子水至100ml。

【10％过硫酸铵】

【10％SDS】

【Tris-甘氨酸电泳缓冲液(10×)】

【TEMED(N，N，N'，N'-四甲基乙二胺)】

【5×SDS凝胶上样缓冲液】

【染色液】

【脱色液】

甲醇100ml

冰醋酸100ml

ddW800ml

实验步骤：

a)用两块干净的玻璃平板，组装于电泳装置中的玻璃平板夹层， 并固定在灌胶架上；

b)配制分离胶液体，加入10％的过硫酸铵和TEMED后立即轻轻 搅拌混匀；将分离胶液体加入玻璃板夹层中，液面离玻璃板顶端1.5cm 左右；往夹层的液面顶部缓缓加满去离子水；

c)凝胶在室温聚合15-30min；倒去顶层封闭水层，用吸水纸吸干；

d)配制积层胶液体，将积层胶液体加入玻璃板夹层中，立即在积 层胶溶液中插入干净的Teflon梳子，必要时再补充积层胶液体充盈剩 余空间，凝胶在室温聚合15-30min；

e)小心拔出梳子，以1×电泳缓冲液冲洗加样孔，并以缓冲液充满 之；将凝胶板固定在电泳槽，往内外槽中加缓冲液直至淹没加样孔；

f)样品中加入适量的上样缓冲液(上样缓冲液终浓度为1×)，100℃， 变性5-10min；冷却至室温，12,000rpm离心5min，用100μl注射器将 样品按顺序小心加入到样品孔中；

g)先以60V电压电泳，当溴酚蓝进入分离胶后，调节电压至120V， 继续电泳直至溴酚蓝达到凝胶底部为止，卸去玻璃板，用染色液对凝 胶进行染色；

h)用脱色液进行脱色。

实施例2、间接ELISA检测M.RCAg-1对正常人、间日疟和恶 性疟疾病人血清的抗体识别情况

溶液配制：

【包被液】0.1M碳酸包被缓冲液，pH9.2

Na₂CO₃0.68g

NaHCO₃3.67g

加蒸馏水至500ml

【封闭液】3％(v/v)羊血清，溶于PBS

【显色液】

显色液A(储备液):柠檬酸6.2g

Na₂HPO₄·12H₂025g

添加蒸馏水至500ml

显色液B(储备液):柠檬酸1.05g

EDTA0.093g

添加蒸馏水至500ml

TMB储备液：

3,3’,5,5’四甲基联苯胺(TMB)140mg溶于20mlDMSO

10ml显色液＝(5mlA储备液+5ulH₂O₂)+(4.8mlB储备液+0.2 mlTMB储备液)

实验步骤：

a)包被：用pH9.2的0.1M碳酸盐包被缓冲液稀释M.RCAg-1蛋 白至所需的蛋白质浓度(0.1μg/100μl/孔，实验摸索获得的最佳剂量) 用加样器每孔加入100μl，然后将平板置于湿盒中，4℃过夜，或37℃， 2小时，将平板小孔中液体倾尽，用PBST洗板5次；

b)封闭：每孔200μl含3％羊血清的PBST(实验摸索获得的最佳 包被液)，37℃，2小时；

c)用PBST洗板5次；

d)加入Ⅰ抗(即患者和正常人血清)：将待检血清用PBS溶液作 以1:200稀释，每孔100μl稀释血清，37℃，2小时；

e)PBST洗板5次；

f)加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗(山羊抗人IgG-HRP)：每 孔中加入100μl经PBST稀释过的Ⅱ抗(1:20000)，37℃，2小时；

g)PBST洗板5次；

h)显色。每孔加入底物显色缓冲液100μl，室温反应10分钟，每 孔加入终止液50μl终止反应；

i)利用LabsystemsGenesisV3.03系统(WellscanMK3，Labsystems Dragon，USA)，读取450nm/630nm吸光度值；

j)利用生物统计学工具分析实验结果，确定患者和正常人血清对 重组蛋白的识别程度。

结果显示于图2中。其中正常人对照来自非疟疾疫区北京(n＝108)， 没有疟疾感染史且未去过疟疾疫区；PV(间日疟疾)病人(n＝38)和PF (恶性疟疾)病人(n＝67)来自疟疾流行区缅甸拉咱市；

抗体检测结果分析：恶性疟疾病人67例，假阴性5例，灵敏度 ＝92.5％；正常人108例，假阳性2例，特异度＝98％。此能有效区分正 常人和恶性疟本人，故特异性针对恶性疟疾感染。

抗体水平结果分析：恶性疟病人抗体水平显著高于正常人和间日疟 病人(Mann-Whitneytest,p<0.001)，间日疟病人高于正常人 (Mann-Whitneytest,p<0.001)。

另外，M.RCAg-1蛋白的降解和添加稳定剂对血清抗体检测的结果 并无显著的影响(参见图1B和1C)。

实施例3、间接ELISA对疟疾流行区(疫区)居民进行筛检的实 验结果

采集有两种形式：①静脉采血，抗凝，离心获得血清；②指尖采血， 滴在采血滤纸上，自然干燥形成干血片。

数据处理：

a)每块检测板设有相同的阴性对照和阳性对照，所有样本检 测结果以比值的形式表示，记为OD％；

OD％＝样本OD值/(X+3SD)_{阴性对照OD值}

b)非疫区健康人血清检测结果作为正常对照，(X+3SD)_{正常对照OD％}作为判断阳性和阴性的cutoff值，高于该值判为阳性，否则 判为阴性；

c)所有样本与cutoff值比较后，记录假阳性和假阴性例数，计算 敏感度和特异度；

统计分析：秩和检验(Mann-Whitneytest)用于不同地区抗体水平 差异性分析；p<0.05判定为有统计学意义；统计软件版本为IBMSPSS Statistics19。

采用实施例2所述的间接ELISA方法对疫区居民血清检测的实验 结果显示于图3A-3C。其中3A筛检地点是海南儋州市居民(n＝150)。 镜检结果未发现恶性疟疾病人和间日疟疾病人。抗体筛检结果：150 人中，7例假阳性；海南居民血清抗体水平与北京正常人血清抗体水平 没有显著性差异(Mann-Whitneytest,P>0.05)。

图3B筛检地点是云南丘山(n＝491)。镜检和高灵敏度核酸检测未 发现恶性疟疾病人，有5例间日疟疾病人。抗体筛查结果：491人中， 13例假阳性，云南丘山居民血清抗体水平显著高于北京正常人抗体水 平(Mann-Whitneytest,p<0.001)。

图3C筛检地点是中缅边境：缅甸的拉咱市(n＝575)和中国云南 的盈江县(n＝152)，镜检和高灵敏度核酸检测未发现恶性疟疾病人，有 12例间日疟疾病人。抗体筛查结果：拉咱市出现39例假阳性，盈江 县出现8例假阳性。拉咱市和盈江县的人群抗体水平都显著高于非疫 区北京(Mann-Whitneytest,p<0.001)；盈江-1指僳僳寨(海拔1660米， 年平均气温15.9℃，年降水量1422.2毫米)，盈江-2指卡牙河(海拔 210米，年平均气温22.7℃，年降水量2,655.00毫米)，卡牙河疟疾流 行强度高于僳僳寨，抗体水平结果一致：卡牙河人群血清抗体水平高 于僳僳寨(Mann-Whitneytest,p<0.001)。

结论

应用M.RCAg-1人工多表位蛋白检测人群中血清抗体水平的优点 在于：1)区分正常人和恶性疟疾患者时敏感度和特异度都可达到90％ 以上，可以作为人群恶性疟疾筛查的重要手段；2)不同地区人群抗体 水平比较可用于评估恶性疟疾流行强度。该方法成本低，操作简单， 对检测环境要求不高，更不需要特殊检测仪器，同时可以实现高通量。