用于工业化生产手性非天然氨基酸的双酶制备法

摘要

本发明涉及一种用于工业化生产手性非天然氨基酸的双酶制备法，所述的双酶制备法包括：用复合固定化材料同时固定化两种基因工程菌菌体，其中所述的两种基因工程菌菌体为酰化消旋酶工程菌与L-氨基酰化酶工程菌，或者酰化消旋酶工程菌与D-氨基酰化酶工程菌；以滴落形式将所述的复合固定化材料滴入固定化液中，得到固定化细胞，将渗透交联的固定化细胞进行消旋和水解反应，转换乙酰化-DL-氨基酸为手性D-氨基酸和手性L-氨基酸。采用了该发明中的用于工业化生产手性非天然氨基酸的双酶制备法，其技术效果在于，一步法得到手性非天然氨基酸，其中生产材料安全易得，生产方法简单，生产效率高，操作简便，适合大规模生产手性非天然氨基酸，易于推广使用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学领域，尤其涉及氨基酸的生产方法，具体是指一种用于工业化生产手性非天然氨基酸的双酶制备法。

背景技术

非天然氨基酸是众多药物尤其是近10年来新药的核心中间体。众所周知，早期头孢类药物广泛使用非天然氨基酸D-苯甘氨酸和D-对羟基苯甘氨酸作为核心中间体，近20年来，越来越多的药物广泛使用非天然氨酸作为药物的核心中间体，如左乙拉西坦使用L-2-氨基丁酸，培哚普利使用L-正缬氨酸，达泊西汀使用L-3-苯丙氨酸，依那普利、贝那普利、群多普利使用L-高苯丙氨酸，正在三期临床的诺华的超级降压药物LCZ696使用L-2-(4-联苯)基丙氨酸。

非天然氨基酸的生产工艺主要有不对称合成法、化学拆分法和生物酶催化法，其中不对称合成法由于手性催化剂和手性辅助试剂比较昂贵，目前尚不能够广泛用于工业化生产；化学拆分法因为原料消耗大，污染大，手性含量低，逐渐不符合目前清洁生产的要求；生物酶催化法具有立体选择性高、反应条件温和、手性含量高、产品系列化、污染少等优点，是以后非天然氨基酸工业生产技术的发展方向。

在酶法生产非天然氨基酸的工艺中，氨基酰化酶是主要使用的酶和工艺；目前已经商品化L-氨基酰化酶和D-氨基酰化酶，但是目前该酶法理论转化率只有50％，只能够得到一种手性异构体，存在着成本高的问题；近年来研究发现，在生物体内存在酰化消旋酶，可以消旋L-和D-乙酰化氨基酸，因此有人将两种酶结合起来使用生产非天然氨基酸，但是众多文献均存在手续繁杂，不利于工厂生产，如何进一步简化工艺，提高收率，降低成本，依然是该双酶法工艺存在的问题，制备固定化菌体是一个发展方向。

聚乙烯醇是一个优良的固定化细胞的材料，具有强度高、化学稳定性好、价格低廉的特点，但是单独使用聚乙烯醇作为固定化材料，有细胞毒性高、不易制备球形颗粒、凝固速度慢的特征。明胶也为固定化细胞的常规原料，但是存在酶活性低的特征。

固定化细胞与固定化酶不同，细胞存在细胞酶，酶在细胞内，转化底物和产物，均需要通过细胞膜，因此存在细胞膜的通透性问题。固定化细胞比游离细胞通透性更差，如何提高固定化细胞的通透性，也是一个研究方向。

发明内容

本发明的目的是克服了上述现有技术的缺点，提供了一种能够用于工业化生产手性非天然氨基酸的双酶制备法。

为了实现上述目的，本发明的双酶制备法具有如下构成：

该用于工业化生产手性非天然氨基酸的双酶制备法，其主要特点是，所述的双酶制备法包括：

(1)用复合固定化材料同时固定化两种基因工程菌菌体，其中所述的两种基因工程菌菌体为酰化消旋酶工程菌与L-氨基酰化酶工程菌，或者酰化消旋酶工程菌与D-氨基酰化酶工程菌；以滴落形式将所述的复合固定化材料滴入固定化液中，得到固定化细胞；

(2)将所述的固定化细胞渗透交联，提高所述的固定化细胞的比活力；

(3)在生物反应器中将渗透交联的固定化细胞进行消旋和水解反应，转换乙酰化-DL-氨基酸为手性D-氨基酸和手性L-氨基酸。

优选地，所述的复合固定化材料为聚乙烯醇和明胶的复配材料，聚乙烯醇与明胶的比例为20：0.8～1.6。

更优选地，所述的固定化液为戊二醛与硼酸的复配材料，其中戊二醛为交联剂，浓度为5％，硼酸水溶液为固化剂，硼酸溶液pH为8.0。

进一步优选地，所述的明胶加热至75～85℃，后降温至55～65℃使用。

优选地，所述的步骤(1)具体为：

将所述的两种基因工程菌菌体分别克隆至同一种大肠杆菌中，分别培养后得到有效表达，离心得到湿菌体；以聚乙烯醇与明胶的复配材料作为固定化材料共同固定酰化酶菌体和消旋酶菌体；以滴落形式将所述的复合固定化材料滴入固定化液中，得到固定化细胞。

更优选地，所述的有效表达为大肠杆菌感受态细胞经转化后在抗性平板上筛选得到的阳性菌株

进一步优选地，所述的液滴为2～3mm，用注射器抽取滴落。

再进一步优选地，所述的消旋和水解反应的底物浓度为0.1～0.3mol。

更进一步优选地，所述的生物反应器包括流化床生物反应器、固定床生物反应器或反应釜。

最优选地，每一步骤结束后对得到的固定化菌或固定化细胞进行比活力测定。

采用了该发明中的用于工业化生产手性非天然氨基酸的双酶制备法，其技术效果在于，一步法得到手性非天然氨基酸，其中生产材料安全易得，生产方法简单，生产效率高，操作简便，适合大规模生产手性非天然氨基酸，易于推广使用。

具体实施方式

为了能够更清楚地描述本发明的技术内容，下面结合具体实施例来进行进一步的描述。

实施例1：

L-氨基酰化酶基因工程菌的构建以及培养：

目的基因细菌为嗜热脂肪芽孢杆菌和受体菌BL21(DE3)来自复旦大学，PET28aVector，PMD-18tVector，限制酶，T4DNA连接酶，Taq聚合酶为TaKaRa产品。

嗜热脂肪芽孢杆菌基因组DNA提取按照常规方法进行，amaA基因PCT扩增，Sense链引入NdeI酶切位点，引物5’-GCCATATGACAAAGGAAGAAATCAA-3’，Anti-Sense链引入EcoRI酶切位点，5’-TTGAATTCTCAATCGTAAAGCGC-3’。常规PCR，PCR产物经过回收纯化，克隆到Pmd-18TVector，酶切鉴定测序，再用NdeI和EcoRI双酶切amaA基因和载体PET28a，回收后16度连接转化BL21，培养，筛选阳性菌株，得到L-氨基酰化酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-acy1。

实施例2：

D-氨基酰化酶基因工程菌的构建：

D-氨基酰化酶(EC.3.5.1.81，N-D-AAase)，根据已经发表的文献Alcaligenesxylosoxidans的全序列(GenBank:D45918.1)全合成该基因序列。设计含有BgllI和XhoI位点的上下游引物，扩增基因后插入pET32a中，构建表达载体，热击转化到BL21(DE3)感受态细胞中，抗性平板筛选，得到D-氨基酰化酶基因工程菌BL21(DE3)/pET32a-aaase。

实施例3：

构建酰化消旋酶基因工程菌：

根据已经报道的AmycolatopsisazureaCCRC13413的酰化消旋酶基因(GenBank:AY271627.1)全合成该基因序列，两端设计酶切位点以NdeI和BamHI，亚克隆至载体pET24a-aar，获得重组质粒，回收后转化至大肠杆菌BL21(DE3，培养检测阳性菌，得到酰化消旋酶基因工程菌BL21(DE3)/pET24a-aar。

实施例4：

按照常规方法培养上述阳性基因工程菌，管式离心机20000RPM离心，得到湿菌体。

实施例5：

取L-氨基酰化酶菌体20g(菌体酶比活力120umol/g.min)，酰化消旋酶菌体20g(菌体酶比活力210umol/g.min)，加入100G水中混合，保温到40度均匀；取聚乙烯醇20克，明胶1克，加入水100克，混合加热至80度溶解，降温至60度；以上混合菌体和固定化材料，迅速混合均匀，用注射器抽取然后再滴落到5％戊二醛的0.02mo1/LpH8.0硼酸溶液中，得到颗粒状固定化细胞，过滤，加入5％多乙烯多胺溶液中交联2小时，过滤，得到颗粒固定化细胞250克，经过测定，固定化细胞的比活力为(菌体酶比活力6.5umol/g.min)，用于生物催化。

在1L蒸馏水中加入乙酰化-DL-丙氨酸27克，配成0.2M溶度溶液，用片碱调整PH＝7.5，加入上述混合湿菌体50克转化，37度，15小时后测定，乙酰化-DL-丙氨酸小于0.001％，几乎全部转换为L-丙氨酸，经过纯化处理，得到L-丙氨酸17克。以DL-乙酰-亮氨酸，DL-乙酰-缬氨酸，DL-乙酰苯丙氨酸，DL-乙酰正亮氨酸为原料，分别得到L-亮氨酸，L-缬氨酸，L-苯丙氨酸，L-正亮氨酸。

实施例6：

取D-氨基酰化酶菌体40g(菌体酶比活力65umol/g.min)，酰化消旋酶菌体20g(菌体酶比活力210umol/g.min)，加入100G水中混合，保温到40度均匀；取聚乙烯醇20克，明胶1克，加入水100克，混合加热至80度溶解，降温至60度；以上混合菌体和固定化材料，迅速混合均匀，用注射器抽取然后再滴落到5％戊二醛的0.02mo1/LpH8.0硼酸溶液中，得到颗粒状固定化细胞，过滤，加入5％多乙烯多胺溶液中交联2小时，过滤，得到颗粒固定化细胞270克，经过测定，固定化细胞的比活力为(菌体酶比活力5.3umol/g.min)，用于生物催化。

在1L蒸馏水中加入乙酰化-DL-丙氨酸27克，配成0.2M溶度溶液，用片碱调整PH＝7.5，加入上述混合湿菌体50克转化，37度，15小时后测定，乙酰化-DL-丙氨酸小于0.001％，几乎全部转换为L-丙氨酸，经过浓缩以及纯化处理，得到D-丙氨酸17.2克。以DL-乙酰-亮氨酸，DL-乙酰-缬氨酸，DL-乙酰苯丙氨酸，DL-乙酰正亮氨酸为原料，分别得到D-亮氨酸，D-缬氨酸，D-苯丙氨酸，D-正亮氨酸。

实施例7：

取L-氨基酰化酶菌体20g(菌体酶比活力120umol/g.min)，酰化消旋酶菌体20g(菌体酶比活力210umol/g.min)，加入100G水中混合，保温到40度均匀；取聚乙烯醇20克，加入水100克，混合加热至80度溶解，降温至60度；以上混合菌体和固定化材料，迅速混合均匀，用注射器抽取然后再滴落到0.02mo1/LpH8.0硼酸溶液中，得到颗粒状固定化细胞，经过观察，颗粒成球较慢，球形颗粒有粘结现象，颗粒状固定化细胞经过测定抗压强度为1.1N/cm²，固定化细胞酶比活力为8.0umol/g.min。

实施例8：

取L-氨基酰化酶菌体20g(菌体酶比活力120umol/g.min)，酰化消旋酶菌体20g(菌体酶比活力210umol/g.min)，加入100G水中混合，保温到40度均匀；取明胶10克，加入水100克，混合加热至80度溶解，降温至60度；以上混合菌体和固定化材料，迅速混合均匀，用注射器抽取然后再滴落到0.02mo1/LpH8.0硼酸溶液中，得到颗粒状固定化细胞，经过观察，颗粒成球速度较快，球形颗粒无粘结现象，颗粒状固定化细胞经过测定抗压强度为15N/cm²，固定化细胞酶比活力为4.1umol/g.min。。

实施例9：

取D-氨基酰化酶菌体40g(菌体酶比活力65umol/g.min)，酰化消旋酶菌体20g(菌体酶比活力210umol/g.min)，加入100G水中混合，保温到40度均匀；取聚乙烯醇20克，明胶1克，加入水100克，混合加热至80度溶解，降温至60度；以上混合菌体和固定化材料，迅速混合均匀，用注射器抽取然后再滴落到5％戊二醛的0.02mo1/LpH8.0硼酸溶液中，得到颗粒状固定化细胞，经过观察，颗粒成球速度较快，球形颗粒无粘结现象，颗粒状固定化细胞经过测定抗压强度为11N/cm²。

实施例10：

取D-氨基酰化酶菌体40g(菌体酶比活力65umol/g.min)，酰化消旋酶菌体20g(菌体酶比活力210umol/g.min)，加入100G水中混合，保温到40度均匀；取聚乙烯醇20克，明胶不同克，加入水100克，混合加热至80度溶解，降温至60度；以上混合菌体和固定化材料，迅速混合均匀，用注射器抽取然后再滴落到5％戊二醛的0.02mo1/LpH8.0硼酸溶液中，得到颗粒状固定化细胞，观察颗粒成球和测定抗压强度，结果见下表1。从表1中得出聚乙烯醇与明胶比例为20:0.8～1.6合适。

表1：不同明胶浓度对载体性能

实施例11：

取L-氨基酰化酶菌体20g(菌体酶比活力120umol/g.min)，酰化消旋酶菌体20g(菌体酶比活力210umol/g.min)，加入100G水中混合，保温到40度均匀；取聚乙烯醇20克，明胶1克，加入水100克，混合加热至80度溶解，降温至60度；以上混合菌体和固定化材料，迅速混合均匀，用注射器抽取然后再滴落到5％戊二醛的0.02mo1/LpH8.0硼酸溶液中，得到颗粒状固定化细胞，过滤，过滤，得到颗粒固定化细胞250克，经过测定，固定化细胞的比活力为5.5umol/g.min。

实施例12：

取D-氨基酰化酶菌体40g(菌体酶比活力65umol/g.min)，酰化消旋酶菌体20g(菌体酶比活力210umol/g.min)，加入100G水中混合，保温到40度均匀；取聚乙烯醇20克，明胶1克，加入水100克，混合加热至80度溶解，降温至60度；以上混合菌体和固定化材料，迅速混合均匀，用注射器抽取然后再滴落到5％戊二醛的0.02mo1/LpH8.0硼酸溶液中，得到颗粒状固定化细胞，过滤得到颗粒固定化细胞270克，经过测定，固定化细胞的比活力为4.4umol/g.min。

采用了该发明中的用于工业化生产手性非天然氨基酸的双酶制备法，其技术效果在于，一步法得到手性非天然氨基酸，其中生产材料安全易得，生产方法简单，生产效率高，操作简便，适合大规模生产手性非天然氨基酸，易于推广使用。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。