一种改造转运蛋白Bap2p促进酿酒酵母利用支链氨基酸的方法

摘要

本发明公开了一种改造转运蛋白Bap2p促进酿酒酵母利用支链氨基酸的方法，属于微生物遗传和分子生物学领域。本发明消除Bap2p的泛素化位点，从而解除Bap2p所受到的泛素化调控。弱化了酿酒酵母受到的泛素化调控，提高了其对支链氨基酸的利用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种改造转运蛋白Bap2p促进酿酒酵母利用支链氨基酸的方法，属于微生物遗传和分子生物学领域。

背景技术

转运蛋白Bap2p是一种位于细胞膜上的支链氨基酸特异性透性酶，转运的氨基酸包括亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)，对于Leu具有很高的亲和力。泛素化是蛋白质翻译后修饰的主要方式之一，被泛素标记的蛋白质将进入泛素-蛋白酶体途径，并进一步被液泡内的蛋白酶所降解。Bap2p受到泛素化调控，即Bap2p的泛素化位点(赖氨酸)被泛素所识别并标记，并最终被蛋白酶所降解。因此，解除或减轻Bap2p的泛素化修饰，从而减少其降解，将有助于其在细胞膜上的稳定存在并发挥氨基酸转运功能。

亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸等支链氨基酸为酿酒酵母非偏好型氮源，当培养基中存在偏好型氮源(谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸等)时，酿酒酵母优先利用偏好型氮源；只有当偏好型氮源耗尽时，才开始利用非偏好型氮源。酿酒酵母这种优先利用偏好型氮源的方式会带来许多不利的结果，如(1)不利于对氮源的充分利用，(2)有害代谢产物(如氨基甲酸乙酯)的积累等。因此，减弱支链氨基酸转运蛋白Bap2p受到的泛素化调控，使其能够在细胞膜上发挥稳定功能，有助于提高支链氨基酸的利用，从而有助于氮源的全面充分利用，且不会造成氨基甲酸乙酯等有害产物的积累。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种改造转运蛋白Bap2p促进酿酒酵母利用支链氨基酸的方法。

所述的改造转运蛋白Bap2p，是消除Bap2p的泛素化位点，从而解除Bap2p所受到的泛素化调控。

所述的消除Bap2p的泛素化位点，是将其第12和/或13和/或38和/或69位赖氨酸突变为精氨酸。

在本发明的一种实施方式中，编码所述转运蛋白Bap2p的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述的将赖氨酸突变为精氨酸，是不同的突变位点的组合。

在本发明的一种实施方式中，所述的将赖氨酸突变为精氨酸，是将第12、13、38和69位赖氨酸全部突变为精氨酸，得到突变体Bap2p^{K12,13,38,69R}。

所述的支链氨基酸指的是亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。

本发明对酿酒酵母支链氨基酸转运蛋白进行了遗传改造，弱化了其受到的泛素化调控，提高了其对支链氨基酸的利用。

附图说明

图1定点突变的组合方式

图2Bap2p系列突变体支链氨基酸利用情况

具体实施方式

材料与方法

下述实施例所用酿酒酵母菌株为S.cerevisiaeCEN.PK2-1D-Δubi4(MATαura3-52；trp1-289；leu2-3,112；his3Δ1；Δubi4::LEU2；MAL2-8^C；SUC2)单倍体模式菌株，酿酒酵母CEN.PK2-1D-Δubi4由酿酒酵母CEN.PK2-1D(MATαura3-52；trp1-289；leu2-3,112；his3Δ1；MAL2-8^C；SUC2)敲除基因UBI4改造而来，酿酒酵母CEN.PK2-1D购自EUROSCARF(Frankfurt,Germany)，其他操作均为常规分子生物学操作。

实施例1

YNB液体培养基：1.74g/LYeastNitrogenBasewithoutAminoAcidsandAmmoniumSulfate，20g/LD-glucose，5g/L(NH₄)₂SO₄。亮氨酸、尿嘧啶双缺陷型培养基(DM-leu^-，ura^-)：YNB培养基中添加50μg/mL组氨酸、50μg/mL色氨酸。固体培养基为相应的液体培养基中加入20g/L琼脂粉。

以酿酒酵母S.cerevisiaeCEN.PK2-1D-Δubi4基因组DNA为模版，使用引物对BAP2-F/BAP2-R(表1)扩增得到基因BAP2(SEQIDNO.1)。BAP2经挑取单菌落及Sanger测序验证正确后，通过限制性酶切位点NotI和SmaI连接至载体pUbDetec16(SEQIDNO.2)，得到重组表达载体pUbDetec16-BAP2。重组表达载体使用引物对pUbDetec16-ver-F/R(表1)进行验证。挑选测序正确的重组质粒利用醋酸锂转化法转化S.cerevisiaeCEN.PK2-1D-Δubi4，涂布DM-leu^-，ura^-固体培养基。于30℃培养箱培养3-4d，挑选单菌落进行菌落PCR验证后接种相应的液体培养基。待生长至对数期转接以便于后续试验。

酿酒酵母的醋酸锂转化法：将S.cerevisiaeCEN.PK2-1D-Δubi4在YPD培养基中30℃，200rpm培养过夜后，转接至新鲜的40mLYPD培养基中，并使终浓度为10⁶cell·mL^-1。30℃，200rpm培养约6h，待菌体生长至浓度为1.2-1.5×10⁷cell·mL^-1(OD₆₀₀＝1.2-1.5)。收集菌体于4000rpm4℃离心5min收集全部细胞，用1倍体积的预冷无菌水洗涤细胞。4000rpm4℃离心5min收集细胞，用1/2体积的预冷无菌水洗涤细胞。4000rpm4℃离心5min收集细胞，加入4mL转化液并用移液枪将细胞和转化液混合均匀，室温孵育30min。4000rpm4℃离心5min收集细胞，用1mL1mol·L^-1山梨醇悬浮细胞并转移至1.5mL离心管中。室温13000rpm离心30s，弃上清，重复该步骤两次。用100μL1mol·L^-1山梨醇悬浮细胞，使终浓度为10¹⁰cell·mL^-1。取40μL制备的感受态细胞并加入5μL(100μg)质粒或线性DNA，混合后转入冰上预冷的0.2cm电转杯中，冰上孵育5min。将电转杯放入电转仪中，参数设定为1.5kV、25μF，电击后立即加入1mL1mol·L^-1山梨醇。用移液枪混合均匀后(轻轻吹吸，不要产生气泡)，将得到的电击混合物转移至1.5mL离心管中，30℃静置孵育1h。取0.2mL涂布相应的营养缺陷型平板，置于30℃培养箱3-4d后观察结果。

表1pUbDetec16-BAP2表达载体构建及验证所用引物

泛素化位点的定点突变：采用定点突变的方法，将相应的泛素化位点(赖氨酸)突变为精氨酸。采用快切酶DpnI消化模板的方法进行定点突变。首先，以重组质粒pUbDetec16-BAP2为模板，使用2×SuperpfuMixDNA聚合酶扩增完整的重组质粒。PCR产物经柱回收后添加DpnI于37℃，反应1h，由于菌体自身的质粒模板会被甲基化修饰，而扩增的质粒则不会被甲基化。通过DpnI消化后就可以消除原始模板质粒。将酶切反应后的混合液于PCR仪80℃，5min使酶失活后即可转化E.coliJM109。转化体系涂布含有适量氨苄青霉素的LB平板，于37℃培养箱中静置过夜培养。随机挑取单菌落进行菌落PCR验证，验证引物采用pUbDetec16-ver-F/R。经Sanger测序验证正确的单克隆继续用于下一轮突变，直到完成四重突变，定点突变的位点顺序如图1。

表2pUbDetec16系列表达载体定点突变所用引物

泛素化位点消除对支链氨基酸代谢的影响：分别将活化的CEN.PK2-1D-Δubi4[pUbDetec16]、CEN.PK2-1D-Δubi4[pUbDetec16-Bap2p]、CEN.PK2-1D-Δubi4[pUbDetec16-Bap2p^K12,13R]、CEN.PK2-1D-Δubi4[pUbDetec16-Bap2p^K12,13,38R]、CEN.PK2-1D-Δubi4[pUbDetec16-Bap2p^{K12,13,38,69R}]接种YNB液体培养基(不添加铵盐)，并在培养基中添加Leu、Ile、Val各10mM。于30℃，200rpm培养周期48h，分别在0h和48h取样检测支链氨基酸代谢情况。

从结果(图2)可以看出，相对于阴性对照CEN.PK2-1D-Δubi4[pUbDetec16]，工程菌株对3种支链氨基酸的利用率随着泛素化位点突变数量的增加不断增加，且四重突变体CEN.PK2-1D-Δubi4[pUbDetec16-Bap2p^{K12,13,38,69R}]对支链氨基酸的利用率最高，分别达到30.1±1.5％(Val)、41.5±1.8％(Ile)和30.8±0.8％(Leu)，相对于对照组分别提高了88.1％、48.2％和47.4％。该结果表明，Bap2p泛素化位点的改造对于提高基因工程菌株支链氨基酸的利用取得了显著的效果。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。