一株抗苜蓿根腐病的木霉菌及其应用

摘要

本发明公开了一株抗苜蓿根腐病的木霉菌及其应用。本发明提供了一种木霉菌，该木霉菌(Trichoderma？viride)的保藏编号为CGMCC？No.11220。本发明还提供了一种复合微生物菌剂，所述的复合微生物菌剂的活性成分包含如上所述的木霉菌和枯草芽胞杆菌(Bacillus？subtilis)。本发明还提供了如上所述的木霉菌或如上所述的微生物菌剂在苜蓿根腐病防治中的应用。通过上述技术方案，本发明能够有效地防治苜蓿根腐病的发生。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地，涉及一种木霉菌(Trichodermaviride)， 含有该木霉菌的微生物菌剂以及它们在苜蓿根腐病防治中的应用。

背景技术

苜蓿MedicagosativaL.是世界上种植最广，面积最大的一种优良豆科牧 草。其根系发达、固氮能力强，所含的蛋白质可以满足家畜在任何生长阶段 对蛋白质的要求，堪称牧草之王。

苜蓿根腐病是一种典型的土传病害，普遍发生在苜蓿栽培的各个地区， 尤其在美国、澳大利亚、加拿大、俄罗斯、阿根廷、日本等。我国自1991 年发现此病以来，先后在新疆、甘肃、青海、四川、内蒙古等地报道。在2006 年，先后报道该病的病原菌已达28种，其中以镰刀菌为主，有13种，其它 病原真菌12种，细菌2中，线虫1种。细菌等虽然也可以引发苜蓿根部腐 烂，但真菌的侵染是导致苜蓿根腐病的最主要原因。该病对苜蓿生长造成严 重危害。据估计，每年全世界由该病造成的产量损失在20％左右，有些严重 地带可达40％。苜蓿感染根腐病后，寿命和利用年限缩短，固氮能力下降， 导致苜蓿品质和产量降低。

目前，苜蓿根腐病的主要防治手段包括选用抗病苜蓿品种、化学杀菌剂 防治和加强农业管理。抗病苜蓿品种的筛选主要包括利用无直接杀伤作用的 诱导因子(如减活的病原菌)诱导苜蓿自身的防疫系统；化学防治方法如使 用多菌灵、甲基硫菌灵、枯腐宁等杀菌剂；加强农业管理包括改良土壤、增 施磷钾肥、调节割期，以及降低温度以抑制病原菌菌丝的生长和分生孢子的 萌发等。

苜蓿根腐病病原菌包括镰刀菌、丝核菌、腐霉菌和疫霉菌等，病原菌成 分复杂，目前缺乏有效的抗病品种，加之苜蓿为多年生牧草，长期使用化学 药剂防治根腐病势必存在草产品农药残留、污染环境、易产生抗药性等问题， 致使其应用受到局限。

生物防治具有无污染、无残留、难以产生抗药性等优点，筛选和利用对 苜蓿根腐病病原真菌有拮抗作用的生防微生物，是防治苜蓿根腐病的有效途 径。

发明内容

本发明的发明人分离筛选到了一株木霉菌，发现其能够显著抑制苜蓿根 腐病病原菌的生长，有效防治苜蓿根腐病的发生，由此得到了本发明。

本发明提供了一种木霉菌，该木霉菌为绿色木霉(Trichodermaviride)， 其保藏编号为CGMCCNo.11220。

本发明还提供了一种复合微生物菌剂，所述的复合微生物菌剂活性成分 包含如上所述的木霉菌和商品号为ACCC03221的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。

本发明还提供了如上所述的木霉菌或如上所述的复合微生物菌剂在苜 蓿根腐病防治中的用途。

通过上述技术方案，本发明提供的木霉菌或复合微生物菌剂对于苜蓿根 腐病具有较高的防效，并且具有绿色环保的优点。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物材料保藏

本发明的木霉菌(Trichodermaviride)是本发明的发明人从内蒙古自治 区赤峰市苜蓿种植地土壤中分离获得，其保藏编号为CGMCCNo.11220， 保藏日期为2015年8月11日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为 绿色木霉(Trichodermaviride)。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种木霉菌，该木霉菌为绿色木霉(Trichodermaviride (TVmx))，其保藏编号为CGMCCNo.11220。

本发明还提供了一种复合微生物菌剂，所述的复合微生物菌剂活性成分 包含如上所述的木霉菌和商品号为ACCC03221的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。

其中，相对于1g的微生物菌剂，所述木霉菌的含量可以为10⁵-10⁹CFU， 优选为10⁶-10⁸CFU。

其中，所述木霉菌和所述枯草芽胞杆菌的CFU比优选为1：(10-20)。

其中，该微生物菌剂可以通过如下步骤的制备方法制备得到：

1)将保藏编号为CGMCCNo.11220的木霉菌和商品号为ACCC03221 的枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)菌种分别在活化培养基中接种并培养得 到各自的活化菌种；

(2)将木霉菌的活化菌种在木霉菌液体发酵培养基中培养，同时将枯 草芽胞杆菌的活化菌株在其液体发酵培养基中培养，得到各自的发酵后的菌 液；

(3)将步骤(2)得到的木霉菌和枯草芽胞杆菌菌液分别经惰性载体吸 附、烘干和粉碎，得到各个菌种的菌粉；

(4)将木霉菌和枯草芽胞杆菌的菌粉按比例混合，得到复合微生物菌 剂。

其中，步骤(1)中，菌种的活化培养条件及培养后菌种状态没有特别 的限制，可以为木霉菌和枯草芽胞杆菌培养的常用条件，例如培养温度可以 为28-32℃，培养时间可以为1-5天。在培养的过程中，可以通过常规的方 法，例如显微镜观察确定活化菌种的状态。

其中，步骤(2)中，发酵条件和发酵后的物料中的活菌浓度没有特别 要求，可以为木霉菌和枯草芽胞杆菌发酵过程中常用的条件和浓度，作为本 发明优选的一种实施方式，步骤(2)中，发酵的条件使得发酵后的物料中 的活菌浓度为(5-500)×10⁸CFU/mL，在该优选实施方式中的活菌浓度下， 获得的发酵后的菌液作为微生物菌剂制备的原料使用。例如发酵的时间可以 为20-200小时，温度可以为28-32℃。

其中，所述活化培养基可以为常规的各种能够培养木霉菌和枯草芽胞杆 菌的培养基，例如包括但不限于PDA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤 培养基和LB培养基中的至少一种。

其中，所述木霉菌液体发酵培养基可以为常规的各种能够发酵扩大木霉 菌数目的液体培养基，例如所述液体培养基可以含有淀粉，酵母粉，玉米浆 的至少一种；且所述液体培养基还可以含有0.01-0.02％的ZnSO₄和 0.01-0.03％的MgSO₄，以补充木霉菌快速生长时所需的无机盐。

其中，所述枯草芽胞杆菌液体发酵培养基可以为常规的各种能够发酵扩 大枯草芽胞杆菌数目的液体培养基，例如所述液体培养基可以含有玉米淀 粉、酵母浸粉、花生饼粉、棉籽饼粉的至少一种；且所述液体培养基还可以 含有0.2-0.5％硫酸铵、0.02-0.05％硫酸镁、0.01-0.05％氯化钠，以补充枯草 芽胞杆菌快速生长时所需的无机盐。

其中，作为本发明特别优选的一种实施方式，以所述木霉菌液体发酵培 养基的总重量为基准，以重量比计算，所述木霉菌液体发酵培养基含有 2.0-3.5％淀粉，1.0-2.0％酵母粉，4.0-8.0％玉米浆，0.1-0.5％的CaCO₃， 0.01-0.02％的ZnSO₄和0.01-0.03％的MgSO₄。其中，该培养基还可以含有余 量的水和/或其它成分。在该优选方式中，一方面能够让木霉菌在发酵过程中 快速生长，产生足够数量的厚垣孢子，另一方面获得的发酵后的物料作为微 生物菌剂使用，能够更好地在苜蓿根腐病防治中应用。

其中，作为本发明特别优选的一种实施方式，所述枯草芽胞杆菌液体发 酵培养基含有1-1.5％玉米淀粉、1-1.5％花生饼粉、0.2-0.5％硫酸铵、0.1-0.4％ 碳酸钙、0.02-0.05％硫酸镁和0.01-0.05％氯化钠。其中，该培养基还可以含 有余量的水和/或其它成分。在该优选方式中，一方面能够让枯草芽胞杆菌发 酵过程中快速生长，产生足够数量的芽胞，另一方面获得的发酵后的物料作 为微生物菌剂使用，能够更好地在苜蓿根腐病防治中应用。

其中，发酵后的菌液可以直接作为微生物菌剂使用，也可以通过包括载 体吸附、烘干、粉碎和/或造粒等步骤进一步加工为更方便贮藏的剂型的微生 物菌剂使用。惰性载体的用量可以使得木霉菌菌粉中活菌含量达到(2-5) ×10⁸CFU/g，枯草芽胞杆菌菌粉中活菌含量分别达到(2-10)×10⁹CFU/g。 将木霉菌和枯草芽胞杆菌菌粉混合；使得所述木霉菌和所述枯草芽胞杆菌的 CFU比为1：(10-20)。该复合微生物菌剂制备中两种菌剂的配制并不限于上 述比例，可以为其它比例的混合。

其中，所述惰性载体可以包括碳酸钙、黄土、硅藻土、膨润土、滑石粉、 云母粉、高岭土和方解石粉中的至少一种。

本发明还提供了如上所述的木霉菌或如上所述的复合微生物菌剂在苜 蓿根腐病防治中的用途。

其中，在本发明的一种优选的实施方式中，将如上所述的木霉菌或如上 所述的复合微生物菌剂在苜蓿根腐病防治中应用。

其中，在本发明特别优选的一种实施方式中，在栽种苜蓿的农田施用木 霉菌或如上所述的复合微生物菌剂；其中，栽种苜蓿前将木霉菌或如上所述 的复合微生物菌剂与细土混匀，施入种植土壤中；或者在苜蓿出苗期，将所 述木霉菌或如上所述的复合微生物菌剂与细土混匀，施入种植土壤中。

以下通过实施例进一步详细说明本发明：

实施例1

本实施例用于说明本发明的木霉菌的培养及微生物菌剂的制备。

将保藏编号为CGMCCNo.11220的木霉菌(Trichodermaviride(Tvmx)) 接种到活化培养基PDA培养基(取削皮后的马铃薯20g煮沸20分钟取汁， 将汁与2g葡萄糖、1.5g琼脂和水配成100ml，pH6.8-7.0，装入2个三角瓶， 每个50ml，灭菌后制斜面)上，在28℃培养6天。将活化好的斜面木霉菌 菌种接种至灭菌的液体发酵培养基(以重量计，含有2.5％淀粉，1.5％酵母 粉，5.0％玉米浆，0.4％的CaCO₃，0.01％的ZnSO₄、0.03％的MgSO₄)，28℃ 培养144小时，至90％菌丝都形成厚垣孢子，得到木霉菌液。

将10000mL上述木霉菌液进行离心，收集湿菌体与厚垣孢子混合物， 与适量载体硅藻土充分混合。将混合均匀的物料置于50℃烘箱中，烘烤4-7 个小时，使其含水量小于5％。利用平板培养计数法检测菌粉中活菌数量， 然后使用硅藻土调节直至每克菌剂中含有的木霉活菌数为5亿，所得到的物 料即为本实施例的木霉菌微生物菌剂。

实施例2

本实施例用于说明本发明的复合微生物菌剂的制备。

将商品号为ACCC03221的枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)接种到LB 培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和15g/L 琼脂)斜面上，在37℃培养18小时，得到活化的菌种。将活化好的菌种接 种至灭菌的液体发酵培养基(以重量计，含有1％玉米淀粉、1.5％花生饼粉、 0.5％硫酸铵、0.4％碳酸钙、0.03％硫酸镁、0.02％氯化钠)中，于35℃培养 至活菌浓度为5-10×10⁹CFU/mL，得到枯草芽胞杆菌菌液。

将10000mL上述枯草芽胞杆菌菌液进行离心或抽滤，收集湿菌体，然 后与适量载体硅藻土混合。将充分混合均匀的物料置于60℃烘箱中，烘烤 4-7个小时，使其含水量低于5％。利用平板培养计数法检测菌粉中菌体数量， 然后使用硅藻土调节直至每克菌剂中含有的枯草芽胞杆菌活菌数为20亿。

将实施例1得到的木霉菌菌粉、以及本实施例得到枯草芽胞杆菌菌粉按 重量比1：3混合，所得到的物料即为本实施例的复合微生物菌剂。

对比例1

按照实施例2的方法制备复合微生物菌剂，不同的是，木霉菌使用的是 文献(熊敏等，拮抗尖孢镰刀菌的木霉菌筛选方法评估，《中国生物防治学 报》2011年11月)中的木霉菌株SZ2212。

对比例2

按照实施例2的方法制备复合微生物菌剂，不同的是，用商品号为ACCC 11109的蜡状芽胞杆菌(Bacilluscereus)替换商品号为ACCC03221的枯草 芽胞杆菌(Bacillussubtilis)。

测试实施例1

本测试实施例在田间试验中测定本发明的微生物菌剂在防治苜蓿根腐 病中的效果。

试验田位于河北省廊坊市中国农业科学院试验基地，将死于根腐病的苜 蓿植株的组织捣碎，用等重量的水浸泡48小时，过滤得到含有根腐病致病 菌的浸种液。将紫花苜蓿(中苜1号，由国家种植牧草中期库提供，产品目 录号为00068)种子浸泡于上述含有根腐病致病菌的浸种液中24小时，浸种 液的用量足以淹没紫花苜蓿种子，得到浸泡后的种子。

将浸泡后的苜蓿种子播种于农田中，设置实施例1制备得到的木霉菌剂、 实施例2制备得到的复合微生物菌剂和对比例1、2制备得到的复合微生物 菌剂以及空白对照五个处理，各设3次重复，共15个小区，随机排列。在 苜蓿出苗10天后，分别将实施例1制备得到的木霉菌剂、实施例2和对比 例1、2制备得到的复合微生物菌剂与灭菌细土充分混合，使细土中活菌数 含量达到2×10⁶CFU/g，同处理，每平方米100g细土均匀施入农田，以同 等重量硅藻土进行相同掺土处理作为对照。田间管理常规。生长40天后调 查苜蓿根腐病发病情况。苜蓿根腐病病情分为5个级别，免疫(0级)：病 指0；抗病(1级)：病指0.1-20.0；耐病(2级)：病指20.1-40.0；感病(3 级)：病指40.1-60.0；高感(4级)：病指60.0以上或完全腐烂。病情指数＝ ∑(发病级别代表值×该级的株数)/(发病最重级别代表值×总株数)×100； 防治效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％。结果如表 1所示。

表1

处理 病情指数 防治效果 对照 92.26±4.25 - 实施例1木霉菌剂 17.85±2.58 80.65％ 实施例2复合微生物菌剂 14.74±3.42 84.02％ 对比例1复合微生物菌剂 36.81±4.63 60.10％ 对比例2复合微生物菌剂 26.09±3.59 71.72％

通过表1的数据可见，本发明的木霉菌菌剂、复合微生物菌剂都对苜蓿 根腐病具有显著的防治效果，并且本发明的复合微生物菌剂比木霉菌菌剂的 防效更高。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实 施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方 案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特 征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必 要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其 不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。