调控武夷菌素产生菌生长表型的蛋白及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种调控武夷菌素产生菌生长表型的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)氨基酸序列为序列表中序列1的蛋白质；(b)将序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与武夷菌素生物合成相关的由序列1衍生的蛋白质。抑制所述蛋白质的表达，可以加快武夷菌素产生菌的生长速率，同时不会影响武夷菌素的总产量，获得相同武夷菌素总产量的时间大大缩短。在保证武夷菌素产量的前提下，不但节约了时间、还节约了培养基以及仪器设备的消耗成本。本发明对于培育武夷菌素高产新菌株具有重要的理论和实际意义。本发明在生物农药领域具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种调控武夷菌素产生菌生长表型的蛋白及其编 码基因与应用。

背景技术

生物农药是农作物病虫害绿色防控和农产品安全的主要技术支撑。其中，抗生素 类杀菌剂是生物农药产业化发展最快的产品之一，具有高效、易分解、与环境相溶性 好等优点，被认为是减少或代替化学农药的主要技术，也是植物病虫害生物防治研究 的热点。

链霉菌是一类来源于土壤的革兰氏阳性细菌，它可以产生丰富的次级代谢产物， 可广泛应用于人、畜及农业抗生素、抗真菌剂等方面，对人类具有重要的应用价值。 由于农用抗生素具有无残留、易降解等优点，在农业生产中发挥越来越重要的作用。 目前应用的绝大多数抗生素都是链霉菌的次生代谢物，如阿维菌素、井冈霉素、春雷 霉素等。链霉菌次级代谢产物的合成是一个庞大而复杂的调控网络，受到生物合成基 因簇的调控，且基因簇中包含很多调控基因。因此，为了明确其代谢产物的合成途径， 调控基因功能的研究成为了近年来研究的热点。阿维菌素生物合成的正调节因子 AveR，通过调节结构基因的转录表达来影响阿维菌素的产生。匹马霉素作为多烯大环 内酯类抗真菌剂的典型代表，其产生菌那塔链霉菌的调控基因pimM可以调控匹马霉 素的产生，该结果为LuxR家族蛋白的调控基因研究提供了理论依据。天蓝色链霉菌 中调控因子CSRs的功能研究，也在天蓝色链霉菌的调控网络研究中起到了重要的作 用。综上所述，通过对链霉菌中调控因子的研究，可以明确其在抗生素合成途径中的 作用。这为今后基因工程育种，定向筛选培育新菌株，奠定了良好的工作基础。

武夷菌素是由不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis) 产生的一种高效广谱低毒新型农用抗生素，是由中国农业科学院植物保护研究所研制 一种具有自主知识产权的生物农药，具有高效、广谱、低毒的特点，在生态农业和绿 色食品生产中得到了广泛的应用。2000年荣获得国家五部委颁发的“国家重点新产品” 认证。自2001年以来，连续多年被列入蔬菜病虫害安全防治技术规范(国家标准)， 指定用于防治茄果类、瓜类、绿叶类蔬菜白粉病、灰霉病、叶霉病等多种病害。2010 年武夷菌素产品获得国家有机产品认证(COFCC-R-0903-0070)。目前，武夷菌素已经 成为我国无公害蔬菜和有机蔬菜生产中防治真菌病害的高效生物农药。

前期主要是通过传统方式(物理或化学诱变等)筛选武夷菌素高产菌株并取得一 定的成果，比如原生质体融合的方法提高效价，采用亚硝基胍诱变和低能碳离子注入 的方法诱变武夷菌素产生菌，采用60Coγ射线诱变武夷菌素产生菌L7，这些方法都是 基于传统育种的方法筛选高产菌株，但是由于传统育种具有非定向回复突变、费时费 力的缺点，为了进一步提高武夷菌素效价，可以通过分子生物学的方法对武夷菌素产 生菌进行生物工程改造，以期获得高产稳定的菌株。

发明内容

本发明的目的是提供一种调控武夷菌素产生菌生长表型的蛋白及其编码基因与 应用。

本发明所提供的蛋白，名称为WysR3，来源于不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15，具体可为如下(a)或(b)：

(a)氨基酸序列为序列表中序列1的蛋白质；

(b)将序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且与武夷菌素生物合成相关的由序列1衍生的蛋白质。

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一 个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

其中，序列表中序列1由253个氨基酸残基组成。

编码所述WysR3蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子 也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子是编码所述WysR3蛋白的基因(命名为 wysR3基因)；所述wysR3基因具体可为如下1)至4)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列2的第20-781位所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述WysR3蛋白的 DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码所述WysR3 蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC， 0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列2由782个核苷酸组成，第20-781位为ORF，编码序列表中序列1 所示的WysR3蛋白。

含有所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

在本发明的实施例中，所述重组表达载体中启动所述wysR3基因转录的启动子具 体为P_SF14启动子。

更为具体的，所述重组表达载体为在pSETC载体的多克隆位点(如BamHI和Spe I)之间插入所述wysR3基因后得到的重组质粒。

所述表达盒由能够启动所述wysR3基因表达的启动子，所述wysR3基因，以及转 录终止序列组成。

在本发明的一个实施例中，所述重组菌具体为携带有所述wysR3基因的重组链霉 菌；所述链霉菌具体为不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicusvar. wuyiensis)CK-15。

所述WysR3蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在调 控武夷菌素产生菌的菌株生长表型中的应用也属于本发明的保护范围。

其中，所述菌株生长表型主要体现为菌株生长速率。

所述调控武夷菌素产生菌的菌株生长表型具体体现为：所述WysR3蛋白的含量越 高，则所述武夷菌素产生菌的生长速率越慢；所述WysR3蛋白的含量越低，则所述武 夷菌素产生菌的生长速率越快。

本发明的另一个目的是提供一种获得转基因菌株的方法。

本发明所提供的获得转基因菌株的方法，为如下(A)或(B)：

(A)获得具有如下性状中至少一种的转基因菌株的方法，包括如下步骤：向受 体菌株中导入氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质的编码基因，得到转基因菌 株；所述转基因菌株与所述受体菌株相比具有如下(a1)和/或(a2)所示性状：

(a1)生长速率减慢；

(a2)在不影响武夷菌素总产量的前提下，延长武夷菌素产生周期；

(B)获得具有如下性状中至少一种的转基因菌株的方法，包括如下步骤：在受 体菌株中对氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质的编码基因进行抑制表达，得 到转基因菌株；所述转基因菌株与所述受体菌株相比具有如下(b1)和/或(b2)所示 性状：

(b1)生长速率加快；

(b2)在不影响武夷菌素总产量的前提下，缩短武夷菌素产生周期；

在所述(A)和所述(B)的方法中，所述受体菌株均为武夷菌素产生菌。

在所述(A)中，所述WysR3蛋白在所述转基因菌株中的表达量高于所述受体菌 株；在所述(B)中，所述WysR3蛋白在所述转基因菌株中的表达量低于所述受体菌 株。

在所述方法(B)中，所述转基因菌株与所述受体菌株相比具有“在不影响武夷 菌素总产量的前提下，缩短武夷菌素产生周期”的性状，具体体现为：与所述受体菌 株相比，所述转基因菌株的武夷菌素总产量基本持平(无统计学差异)，但是由于所述 转基因菌株的生长速率与所述受体菌株相比加快了，相比所述受体菌株而言，所述转 基因菌株产生相同总产量的武夷菌素所用时间(即武夷菌素产生周期)缩短了。

在所述方法(A)中，所述转基因菌株与所述受体菌株相比具有“在不影响武夷 菌素总产量的前提下，延长武夷菌素产生周期”的性状，具体体现为：与所述受体菌 株相比，所述转基因菌株的武夷菌素总产量基本持平(无统计学差异)，但是由于所述 转基因菌株的生长速率与所述受体菌株相比减慢了，相比所述受体菌株而言，所述转 基因菌株产生相同总产量的武夷菌素所用时间(即武夷菌素产生周期)延长了。

在所述方法中，所述编码基因(即wysR3基因)是如下1)至4)中任一所述的 DNA分子：

1)序列表中序列2的第20-781位所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述WysR3蛋白的 DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码所述WysR3 蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC， 0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

在所述方法(A)中，所述wysR3基因具体可通过以上所述重组表达载体导入所 述受体菌株中，得到所述转基因菌株。

在所述方法(B)中，所述“在受体菌株中对氨基酸序列为序列表中序列1所示 的蛋白质的编码基因进行抑制表达”，可为任何可降低所述受体菌株中所述编码基因的 表达的方法。

在本发明中，所述“在受体菌株中对氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质 的编码基因进行抑制表达”，具体是通过将如下式(I)所示的DNA片段转入所述受体 菌株中实现的：

SEQ_{上游同源臂}-X–SEQ_{下游同源臂}(I)

所述SEQ_{上游同源臂}是序列表中序列3的第1-590位核苷酸；

所述SEQ_{下游同源臂}是序列表中序列3的第1353-1777位核苷酸；

所述X是抗生素编码基因序列(具体如序列表中序列4的所示的庆大霉素编码基 因序列)。

在本发明中，所述式(I)所示的DNA片段的核苷酸序列为序列表中的序列5。

序列5由1882个核苷酸组成。其中，第1-590位为所述SEQ_{上游同源臂}，第597-1451 位为庆大霉素编码基因序列(即序列4)，第1458-1882位为所述SEQ_{下游同源臂}。

进一步，所述式(I)所示的DNA片段是通过重组载体的形式转入所述受体菌株 中的。具体的，所述重组载体为在pKC1139载体的酶切位点(如HindⅢ和BamHI) 之间插入序列表中序列5所示DNA片段后得到的重组质粒。

在上述应用或方法中，所述武夷菌素产生菌进一步为不吸水链霉菌武夷变种 (Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)，具体为不吸水链霉菌武夷变种 (Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15。

利于所述方法获得的转基因菌株也属于本发明的保护范围。

实验证明，抑制WysR3蛋白及其编码基因的表达，可以加快武夷菌素产生菌的生 长速率，同时不会影响武夷菌素的总产量，获得相同武夷菌素总产量的时间大大缩短。 在保证武夷菌素产量的前提下，不但节约了时间、还节约了培养基以及仪器设备的消 耗成本。本发明对于培育武夷菌素高产新菌株具有重要的理论和实际意义。本发明在 生物农药领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为wysR3基因的PCR扩增结果。

图2为重组表达载体pSTEC-wysR3的BamHI和SpeI双酶切鉴定结果。

图3为wysR3基因过表达菌株、△wysR3缺失突变株和互补菌株的PCR鉴定结果。 其中，A为wysR3基因过表达菌株(泳道1)；B为△wysR3缺失突变株；C为互补菌 株，M为分子量标准，1为互补菌株，2为原始菌株CK-15。

图4为原始菌株CK-15、wysR3基因过表达菌株、wysR3基因缺失突变株和互补 菌株的表型生长对比及生长速度测定结果。A和B为原始菌株CK-15和wysR3基因过 表达菌株的表型生长对比；A为生长24h菌株，B为培养96h后菌株；左侧为原始菌 株CK-15，右侧为wysR3基因过表达菌株(实验1)。C为原始菌株CK-15和wysR3 基因缺失突变株的表型生长对比，为培养96h后菌株；左侧为wysR3基因缺失突变株， 右侧为原始菌株CK-15(实验1)。D为原始菌株CK-15、wysR3基因过表达菌株、wysR3 基因缺失突变株和互补菌株的表型生长对比(实验2，D图中的a表示原始菌株CK-15， b表示wysR3基因缺失突变株，c表示互补菌株，d表示wysR3基因过表达菌株)。E 为原始菌株CK-15、wysR3基因过表达菌株和wysR3基因缺失突变株的生长速度测定 结果。

图5为原始菌株CK-15、wysR3过表达菌株、wysR3基因缺失突变株和互补菌株 发酵液的HPLC检测结果。A和B为实验1，A为原始菌株CK-15，B为wysR3过表 达菌株。C、D、E和F为实验2，C为原始菌株CK-15，D为wysR3基因缺失突变株， E为wysR3过表达菌株，F为互补菌株。

图6为wysR3过表达菌株、wysR3基因缺失突变株、互补菌株与原始菌株CK-15 发酵液对深红酵母的抑制作用。A为wysR3过表达菌株与原始菌株CK-15发酵液对深 红酵母的抑制作用，左侧为原始菌株CK-15抑菌圈，右侧为wysR3过表达菌株抑菌圈 (实验1)。B为wysR3基因缺失突变株与原始菌株CK-15发酵液对深红酵母的抑制作 用，左侧为原始菌株CK-15抑菌圈，右侧为wysR3基因缺失突变株抑菌圈(实验1)。 C为wysR3过表达菌株、wysR3基因缺失突变株、互补菌株与原始菌株CK-15发酵液 对深红酵母的抑制作用，WT表示原始菌株CK-15，△wysRIII表示wysR3基因缺失突 变株，comRIII表示互补菌株，ooRIII表示wysR3过表达菌株(实验2)。

图7为葡萄糖标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15：记载 于“王万群，武夷菌素产生菌CK-15细菌人工染色体(BAC)文库构建，2008.6.1” 一文中，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

E.coliET12567/pUZ8002：记载于“KieserTBM,ButtnerMJ,ChaterKF,Hopwood DA(2000)PracticalStreptomycesGenetics.TheJohnInnesFoundation,Norwich”一文中， 公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

pKC1139载体：记载于“BiermanM,LoganR,O’BrienK,SenoET,RaoRN,Schoner BE(1992)PlasmidcloningvectorsfortheconjugaltransferofDNAfromEscherichiacolito Streptomycesspp.Gene116:43–49”一文中，公众可从中国农业科学院植物保护研究所 获得。pKC1139为温度敏感型质粒，带有一个来自s.ghanaensis的温度敏感型复制子， 当培养温度超过34℃时该游离质粒在链霉菌中不能自我复制。

pSETC载体：记载于“KeqiangFan,GuohuiPan,XiaojingPeng,JiantingZheng, WubinGao,JuanWang,WeishanWang,YueLi,andKeqianYang.(2012)Identificationof JadGastheBRingOpeningOxygenaseCatalyzingtheOxidativeC-CBondCleavage ReactioninJadomycinBiosynthesis.Chemistry&Biology19,1381–1390”一文中，公众 可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

pBBR1MCS-5载体：记载于“刘钰莹.脱氮关键酶基因的克隆、鉴定及高效脱氮 菌株的构建.中国农业科学院，2010年硕士论文”一文中，公众可从中国农业科学院 植物保护研究所获得。

pEASY-T1simple载体：全式金生物试剂公司。

深红酵母AS2.282(Rhodotorularubra)：武夷菌素生物效价测定用指示菌，记载 于“曾洪梅林德忻石义萍，农抗武夷菌素产生菌原生质体诱变育种.中国生物防治， 1996年01期，48-49.”一文中，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

实施例1、wysR3基因的获得

以不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15为 出发菌株，通过筛选CK-15基因组fosmid文库中的阳性单克隆，并进行测序，得到一 段约50kb的序列，利用生物信息学分析及开放阅读框的比对，得到一个GC含量非 常高，符合链霉菌基因特征的基因，将该基因命名为wysR3。wysR3基因的ORF序列 如序列表中序列2的20-781位所示。

提取不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15 的基因组DNA，以其为模板，采用引物1和引物2进行PCR扩增。

引物1：5'-GGATCCGTAGCGCAGGAGGAACAC-3'(下划线部分为酶切位点 BamHⅠ的识别序列，其后的序列为序列2的第1-18位)；

引物2：5'-ACTAGTGTCAGACCCGGATCACC-3'(下划线部分为酶切位点SpeⅠ 的识别序列，其后的序列为序列2的第766-782位的反向互补序列)。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，结果显示经 PCR扩增获得了长度约为760bp的目的片段。回收并纯化PCR产物，进行测序。结果 表明，该片段的长度为794bp，核苷酸序列为“GGATCC+序列2+ACTAGT”，序列2 的第20-781位为wysR3基因的编码区序列(CDS)，编码序列表中序列1所示的蛋白 质，将该蛋白命名为WysR3。

实施例2、wysR3基因过表达菌株构建及鉴定

一、重组表达载体pSTEC-wysR3的构建

用限制性内切酶BamHI和SpeI对实施例1的PCR扩增产物的纯化产物进行双酶 切，回收目的片段，与经过同样双酶切的pSETC载体骨架大片段相连，得到重组质粒。 将BamHI和SpeI双酶切鉴定正确的重组质粒(图2，得到大小约为6636bp和794bp 的两个条带)送样测序。将经测序表明在pSETC载体的酶切位点BamHI和SpeI之 间插入序列表中序列2所示DNA片段后的质粒命名为pSTEC-wysR3。

在重组表达载体pSTEC-wysR3中，启动序列2所示的wysR3基因转录的启动子 为P_SF14启动子。

二、wysR3基因过表达菌株的构建

将步骤一构建的重组表达载体pSTEC-wysR3通过电击法转入E.coli ET12567/pUZ8002，得到的重组菌命名为ETpKC-wysR3。再通过接合转移的方法，将 ETpKC-wysR3导入不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis) CK-15中，具体操作参见“杨振娟,孙蕾,武哲等.不吸水链霉菌武夷变种CK-15遗传 转化体系的探索及初建.生物技术通报,2012,(10):193-198”一文，如下：取作为出发 菌株的不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15的 成熟孢子做成孢子悬浮液，将重组菌ETpKC-wysR3做成感受态，与CK-15孢子悬浮 液等体积混合后涂MS平板，于30℃培养16小时后，覆盖含25μg/ml的萘啶酮酸以及 50μg/ml的安普霉素(pSETC载体携带安普霉素抗性基因)的1ml无菌水中，继续培 养至长出接合转移子，得到wysR3转基因菌株。

同时设置向出发菌株CK-15中转入pSETC空载体的对照，所得重组菌株命名为 CK-15/pSETC。

三、wysR3基因过表达菌株的鉴定

挑取步骤二构建的wysR3转基因菌株的单菌落，进行液体培养，提取菌株的基因 组DNA，以其为模板，采用如下引物进行PCR扩增，通过PCR产物大小及测序结果 对wysR3转基因进行分子鉴定。同时以作为出发菌株的不吸水链霉菌武夷变种 (Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15作为对照。

引物3：5'-GTGCAATACGAATGGCGAA-3'(序列6的第1-19位)；

引物4：5'-GCATTCTTCGCATCCCGCCT-3'(序列6的第731-750位的反向互补 序列)。

理论上，在wysR3转基因菌株中，由于重组表达载体pSTEC-wysR3中有安普霉 素抗性基因，以其基因组DNA为模板，采用以上引物对进行PCR扩增，会得到与安 普霉素抗性基因序列大小吻合的扩增片段(750bp，序列6的第1-750位)；而作为对 照的出发菌株CK-15由于不含有安普霉素抗性基因，因而采用以上引物对进行PCR 扩增，不会得到目的条带。

将wysR3转基因菌株和出发菌株CK-15的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果 显示，wysR3转基因菌株(泳道1)的PCR产物大小约为750bp(如图3中A所示)， 而出发菌株CK-15无扩增条带，与预期结果一致。进一步，将wysR3转基因菌株的 PCR产物送样测序，其核苷酸序列正为序列6的第1-750位。可见，步骤二所得到的 wysR3转基因菌株为阳性。

实施例3、wysR3基因缺失突变株的构建及鉴定

一、同源重组质粒pKC-WG的构建

将不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15的 基因组DNA中的wysR3基因的上、下游片段分别扩增出来，得到两个同源臂，接着 在两个同源臂之间连入抗性标记基因庆大霉素基因(Gm)，再将其插入到pKC1139载 体骨架中，得到用于构建wysR3基因缺失突变株的同源重组质粒pKC-WG。具体操作 如下：

1、用于扩增两个同源臂的引物的设计

根据不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15 基因组DNA中wysR3基因上下游序列(序列3)设计引物，用于扩增两个同源臂。

用于扩增上游同源臂(简称ArmA)的引物如下：

ArmA-F：5'-AAGCTTGCTTCGTTGCCCTGTT-3'(下划线部分为HindIII的识别 序列，其后为序列3的第1-16位)；

ArmA-R：5'-TCTAGAGGTGTTCCTCCTGCG-3'(下划线部分为XbaI的识别序列， 其后为序列3的第576-590位的反向互补序列)。

用于扩增下游同源臂(简称ArmB)的引物如下：

ArmB-F：5'-TCTAGACCCCCTACGGGCGTG-3'(下划线部分为XbaI的识别序列， 其后为序列3的第1353-1367位)；

ArmB-R：5'-GGATCCCCCCGACACCGTGCG-3'(下划线部分为BamHI的识别序 列，其后为序列3的第1763-1777位的反向互补序列)。

2、PCR扩增获得两个同源臂

以不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15基 因组fosmid文库6E11质粒为模板，采用引物对ArmA-F/ArmA-R进行PCR扩增，扩 增产物大小约为590bp，测序后其核苷酸序列为序列表中序列3的第1-590位。

以不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15基 因组DNA为模板，采用引物对ArmB-F/ArmB-R进行PCR扩增，扩增产物大小约为 425bp，测序后其核苷酸序列为序列表中序列3的第1353-1777位。

3、重组质粒pEASY-W的构建

用HindⅢ和XbaI双酶切上游同源臂，回收酶切产物，与经过同样双酶切的 pEASY-T1simple载体骨架大片段相连，得到中间载体；用XbaI和BamHI双酶切下 游同源臂，回收酶切产物，与经过同样双酶切的中间载体骨架大片段相连，得到重组 质粒。将经测序表明在pEASY-T1simple载体的HindⅢ和BamHI之间插入“序列3 的第1-590位+TCTAGA+序列3的第1353-1777位”的重组质粒命名为pEASY-W。

4、重组质粒pEASY-WG的构建

以pBBR1MCS-5载体为模板，采用引物Gm-F和Gm-R进行PCR扩增，获得抗 性基因庆大霉素基因(Gm)。其中，引物GM-F和GM-R的序列如下：

GmS：5'-TCTAGAGACGCACACCGTGGAAA-3'(下划线部分为XbaI的识别序 列，其后为序列4的第1-17位)；

GmA：5'-TCTAGAGCGGCGTTGTGACAATTT-3'(下划线部分为XbaI的识别序 列，其后为序列4的第838-855位的反向互补序列)；

将经过上述PCR扩增所得产物——抗性基因庆大霉素基因(Gm)进行序列测定， 其核苷酸序列为“TCTAGA+序列4+TCTAGA”。

将所得PCR产物用XbaI单酶切，回收酶切产物，与经过同样酶切的pEASY-T 1simple载体骨架大片段相连，得到重组质粒，将其命名为pEASY-TGM。

用XbaI单酶切重组质粒pEASY-TGM，与经过同样酶切的重组质粒pEASY-W的 骨架大片段正向相连，得到重组质粒pEASY-WG。

重组质粒pEASY-WG的结构描述为：在pEASY-T1simple载体的HindⅢ和BamH I之间插入序列5后得到的重组质粒。

5、同源重组质粒pKC-WG的构建

用HindⅢ和BamHI双酶切重组质粒pEASY-WG，回收大小约为1870bp的目的 片段，将其与经过同样双酶切的pKC1139载体的骨架大片段相连，得到重组质粒。将 酶切鉴定正确的质粒送样测序。将经测序表明在pKC1139载体的酶切位点HindⅢ和 BamHI之间插入序列表中序列5所示DNA片段后的质粒命名为pKC-WG。

二、wysR3基因缺失突变株的构建

将步骤一构建的同源重组质粒pKC-WG通过电击法转入E.coliET12567/pUZ8002 中，得到的重组菌命名为ETpKC-WG。再通过接合转移的方法，将ETpKC-WG导入 不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15中，具体 操作参见“杨振娟,孙蕾,武哲等.不吸水链霉菌武夷变种CK-15遗传转化体系的探索 及初建.生物技术通报,2012,(10):193-198”一文，如下：取作为出发菌株的不吸水链 霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15的成熟孢子做成孢 子悬浮液，将重组菌ETpKC-WG做成感受态，与CK-15孢子悬浮液等体积混合后涂 MS平板，于30℃培养16小时后，覆盖含25μg/ml的萘啶酮酸(抑制大肠杆菌生长) 以及50μg/ml的安普霉素(pKC1139载体携带安普霉素抗性基因)和50μg/ml的庆大 霉素的1ml无菌水中，继续放37℃培养箱恒温培养至长出接合转移子。长出的菌落可 能为重组质粒pKC-WG整合到链霉菌CK-15染色体上的重组菌株，再挑取单菌落分 别在含有庆大霉素和安普霉素的MS平板上划线，选取在庆大霉素抗性平板上生长， 而在安普霉素抗性平板上不生长的菌株，得到wysR3基因缺失突变株，将其命名为△ wysR3缺失突变株。

三、wysR3基因缺失突变株的鉴定

挑取步骤二构建的△wysR3缺失突变株的单菌落，进行液体培养，提取菌株的基 因组DNA，以其为模板，采用如下引物对进行PCR扩增，通过PCR产物大小及序列 对△wysR3缺失突变株进行分子鉴定。同时以作为出发菌株的不吸水链霉菌武夷变种 (Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15作为对照。

上游引物VF：5'-TAGCGCAGGAGGAACAC-3'(序列5的第573-589位，序列 3的第573-589位)；

下游引物VR：5'-TGGACGAGGAGGGCTAC-3'(序列5的第1522-1538位，序 列3的第1417-1433位的反向互补序列)。

理论上，在△wysR3缺失突变株中，由于庆大基因Gm(855bp)代替了原来目的 基因wysR3(762bp，即序列3的第591-1352位)，同时在庆大基因Gm(855bp)的上 下游各加入了一个XbaI的识别序列(6bp)，发生同源重组双交换的突变株比出发菌 株序列长105bp(855-762+6+6＝105)。采用以上引物对突变株进行PCR扩增的片段大 小应为966bp(序列5的第573-1538位)；而作为对照的出发菌株CK-15的PCR产物 大小应为861bp(序列3的第573-1433位)。

将△wysR3缺失突变株和出发菌株CK-15的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果 显示，△wysR3缺失突变株的PCR产物大小约为966bp，而出发菌株CK-15的PCR 产物大小约为861bp(如图3中B所示)，与预期结果一致。进一步，将△wysR3缺失 突变株的PCR产物送样测序，其核苷酸序列正为序列5的第573-1538位；将出发菌 株CK-15的PCR产物送样测序，其核苷酸序列正为序列3的第573-1433位。可见， 步骤二所得到的△wysR3缺失突变株为阳性。

实施例4、wysR3基因缺失突变株的互补菌株的构建及鉴定

一、wysR3基因缺失突变株的互补菌株的构建

将实施例2步骤构建的重组表达载体pSTEC-wysR3通过电击法转入E.coli ET12567/pUZ8002，得到的重组菌命名为ETpKC-wysR3。再通过接合转移的方法，将 ETpKC-wysR3导入实施例3构建的△wysR3缺失突变株中，具体操作参见“杨振娟,孙 蕾,武哲等.不吸水链霉菌武夷变种CK-15遗传转化体系的探索及初建.生物技术通 报,2012,(10):193-198”一文，得到wysR3基因缺失突变株的互补菌株。

二、互补菌株的鉴定

挑取步骤一构建的互补菌株的单菌落，进行液体培养，提取菌株的基因组DNA， 以其为模板，采用如下引物进行PCR扩增，通过PCR产物大小及测序结果对互补菌 株进行分子鉴定。同时以作为出发菌株的不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15作为对照。

引物3：5'-GTGCAATACGAATGGCGAA-3'(序列6的第1-19位)；

引物4：5'-GCATTCTTCGCATCCCGCCT-3'(序列6的第731-750位的反向互补 序列)。

理论上，在互补菌株中，由于重组表达载体pSTEC-wysR3中有安普霉素抗性基因， 以其基因组DNA为模板，采用以上引物对进行PCR扩增，会得到与安普霉素抗性基 因序列大小吻合的扩增片段(750bp，序列6的第1-750位)；而作为对照的出发菌株 CK-15由于不含有安普霉素抗性基因，因而采用以上引物对进行PCR扩增，不会得到 目的条带。

将互补菌株和出发菌株CK-15的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，wysR3 转基因菌株(泳道1)的PCR产物大小约为750bp(如图3中C所示)，而出发菌株 CK-15无扩增条带，与预期结果一致。进一步，将互补菌株的PCR产物送样测序，其 核苷酸序列正为序列6的第1-750位。可见，步骤一所得到的互补菌株为阳性。

实施例5、wysR3基因过表达菌株、△wysR3缺失突变株以及互补菌株的生长速 度鉴定

一、表型鉴定

(一)实验1

在MS培养基中分别培养实施例2和3获得的wysR3基因过表达菌株及△wysR3 缺失突变株，观察菌株表型，包括菌落形态、生长速度、菌落颜色等。同时设置不吸 水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15作为对照。

结果显示，wysR3基因过表达菌株生长速率明显慢于原始菌株CK-15(图4中A)， 产孢量下降，有的菌株甚至不产生灰色气生孢子，只有白色的基内菌丝(图4中B)。 而△wysR3缺失突变株生长速率明显快于原始菌株CK-15(图4中C)。以上结果说明 wysR3基因影响武夷菌素产生菌S.wuyiensisCK-15的表型生长。

(二)实验2

在MS培养基中分别培养实施例2获得的wysR3基因过表达菌株、实施例3获得 的△wysR3缺失突变株、实施例4获得的互补菌株，观察菌株表型，包括菌落形态、 生长速度、菌落颜色等。同时设置不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicus var.wuyiensis)CK-15作为对照。

结果如图4中D所示，△wysR3缺失突变株较野生型菌株CK-15菌丝生长较快， 产孢量增加且产孢时间提前，生长3-4d即可完成产孢。互补菌株的表型恢复至相应 野生型，表明这种表型变化不是极性效应引起的，而是由wysR3基因的缺失引起的。 wysR3基因过表达菌株生长速率变慢，产孢受阻，甚至不再产生灰色的气生孢子，只 有白色的基内菌丝和稀疏的气生菌丝。说明wysR3基因影响武夷菌素产生菌 S.wuyiensisCK-15的表型生长，推测其可能参与CK-15形态分化的调控过程。

二、干重法测定

以实施例2获得的wysR3过表达菌株、实施例3获得的△wysR3缺失突变株、向 所述△wysR3缺失突变株中重新导入wysR3基因后所得的互补菌株，以及作为出发菌 株的不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15为实 验材料。

取新鲜成熟的各菌株斜面孢子接种于50mLM3G纯液体培养基(配方：每升培养 基中含有(NH₄)₂SO₄10g，葡萄糖50g，酵母粉5.0g，KH₂PO₄1.36g，K₂PO₄·3H₂O0.8 g，MgSO₄·7H₂00.5g，ZnSO₄·7H₂O0.04g，FeSO₄·7H₂O0.03g；pH7.0)中，28℃、 220r/min培养48h作为种子液。将各菌株种子液以2％比例分别接种于100mLM3G 纯液体培养基中(相同的孢子接种量)，28℃、220r/min振荡培养。每隔6h取样100ml， 用预先烘干至恒重的滤纸过滤后，将滤纸置于90℃烘箱内再次烘干至恒重。两次重量 相减即为取样发酵液中菌丝体的干重。

结果如图4中E所示，由图可以看出，野生型菌株在0-18h为延滞期，18-36h为 对数生长期，菌丝体生长量最多，互补菌株与野生型菌株生长趋势大致相同。△wysR3 缺失突变株生长速率加快，在12-36h即进入对数生长期，较野生型菌株菌体大量生长 时间提前约6h，而wysR3过表达菌株生长缓慢，在0-24h为延滞期，24h-48h才进入 对数生长期，较野生型菌株菌体大量生长时间推迟约6h。

实施例6、wysR3过表达菌株、△wysR3缺失突变株以及互补菌株发酵产物的效 价鉴定

一、实验1

(一)各wysR3相关菌株的发酵培养

以实施例2获得的wysR3过表达菌株、转入pSETC空载体的对照菌株 CK-15/pSETC，以及作为出发菌株的不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15为实验材料。

取各菌株新鲜成熟的斜面孢子接种于50mL种子培养基中振荡培养(28℃、220 r/min)20h。将种子液以10％(体积比)接种于100mL发酵培养基中(各菌株保持 相同的孢子接种量)，振荡培养(28℃、220r/min)64h，过滤收集发酵液。发酵液于 6000r/min离心10min，取上清液再经过0.22μm的微孔过滤器，获得无菌发酵滤液， 4℃保存备用。

(二)发酵液中武夷菌素含量的HPLC分析

利用高效液相色谱(high-performanceliquidchromatography，HPLC)分析各菌株 的武夷菌素发酵液，所用仪器型号为Agilend1100。用武夷菌素色谱图的峰面积大小 来表示各菌株武夷菌素产量变化。色谱柱为ZORBAXSB-AQ(4.6mm×250mm，5μm)； 流动相为1.4g/L三氯乙酸水溶液，流速1mL/min；柱温25℃；进样量20μL；检测 波长254nm。

1、标准曲线制作

取武夷菌素标准品，用纯水配制系列浓度的溶液。将系列浓度的武夷菌素标准品 溶液按照如上条件进行高效液相色谱检测。以武夷菌素标准品溶液的浓度为横坐标， 以峰面积为纵坐标，制作标准曲线。

2、待测发酵液中的武夷菌素含量测定

将步骤(一)所得的各菌株发酵液也分别按照如上条件进行高效液相色谱检测， 将与武夷菌素标准品保留时间一致的色谱峰的峰面积代入步骤1所得标准曲线，从而 计算得到待测发酵液中的武夷菌素的含量。实验重复三次，结果取平均值。

3、结果

结果显示，武夷菌素标准品的出峰时间为18min，其他各菌株产生武夷菌素的出 峰时间也为18min，原始菌株CK-15发酵液中武夷菌素含量为18.16mg/L，wysR3过 表达菌株发酵液中武夷菌素含量为19.36mg/L。原始菌株CK-15、wysR3过表达菌株 发酵液的HPCL检测结果如图5中A和B所示。wysR3过表达菌株、转入pSETC空 载体的对照菌株CK-15/pSETC均与原始菌株CK-15发酵液中武夷菌素含量基本一致， 无统计学差异。以上结果说明wysR3基因在武夷菌素生物合成途径中没有发挥调控作 用。

二、实验2

(一)各wysR3相关菌株的发酵培养

以实施例2获得的wysR3过表达菌株、实施例3获得的△wysR3缺失突变株、实 施例4获得的互补菌株、转入pSETC空载体的对照菌株CK-15/pSETC，以及作为出 发菌株的不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15 为实验材料。

取各菌株新鲜成熟的斜面孢子接种于50mL种子培养基中振荡培养(28℃、220 r/min)20h。将种子液以10％(体积比)接种于100mL发酵培养基中(各菌株保持 相同的孢子接种量)，振荡培养(28℃、220r/min)64h，过滤收集发酵液。发酵液于 6000r/min离心10min，取上清液再经过0.22μm的微孔过滤器，获得无菌发酵滤液， 4℃保存备用。

(二)发酵液中武夷菌素含量的HPLC分析

利用高效液相色谱(high-performanceliquidchromatography，HPLC)分析各菌株 的武夷菌素发酵液，所用仪器型号为LC-1260。用武夷菌素色谱图的峰面积大小来表 示各菌株武夷菌素产量变化。色谱柱为ZORBAXSB-AQ(4.6mm×250mm，5μm)； 流动相为1.4g/L三氯乙酸水溶液，流速1mL/min；柱温25℃；进样量5μL；检测波 长254nm。

1、标准曲线制作

取武夷菌素标准品，用纯水配制系列浓度的溶液。将系列浓度的武夷菌素标准品 溶液按照如上条件进行高效液相色谱检测。以武夷菌素标准品溶液的浓度为横坐标， 以峰面积为纵坐标，制作标准曲线。

2、待测发酵液中的武夷菌素含量测定

将步骤(一)所得的各菌株发酵液也分别按照如上条件进行高效液相色谱检测， 将与武夷菌素标准品保留时间一致的色谱峰的峰面积代入步骤1所得标准曲线，从而 计算得到待测发酵液中的武夷菌素的含量。实验重复三次，结果取平均值。

3、结果

结果如图5中C-F所示，武夷菌素标准品的出峰时间约为20min，其他各菌株产 生武夷菌素的出峰时间也为20min。野生型菌株、△wysR3缺失突变株、wysR3基因 过表达菌株和互补菌株发酵液中对应的武夷菌素含量分别为1.193g/L、1.236g/L、1.18 g/L和1.213g/L，因此各菌株所产的武夷菌素含量并没有明显变化。说明在该条件下， wysR3基因不直接参与武夷菌素生物合成的调控，对武夷菌素的产量没有明显影响。

实施例7、wysR3过表达菌株及△wysR3缺失突变株的抑菌活性测定

一、实验1

(一)wysR3过表达菌株及△wysR3缺失突变株的发酵培养

以实施例2获得的wysR3过表达菌株、实施例3获得的△wysR3缺失突变株、转 入pSETC空载体的对照菌株CK-15/pSETC，以及作为出发菌株的不吸水链霉菌武夷 变种(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15为实验材料。

取各菌株新鲜成熟的斜面孢子接种于50mL种子培养基中振荡培养(28℃、220 r/min)20h。将种子液以10％(体积比)接种于100mL发酵培养基中，振荡培养(28 ℃、220r/min)64h，过滤收集发酵液。发酵液于6000r/min离心10min，取上清液 再经过0.22μm的微孔过滤器，获得无菌发酵滤液，4℃保存备用。

(二)管碟法检测发酵液抑菌活性

将各菌株发酵液过滤后，用管碟法测发酵液抑菌活性。以可被武夷菌素抑制生长 的深红酵母AS2.282(Rhodotorularubra)作为指示菌，从而检测各菌株发酵液的抑菌 活性。具体操作如下：

(1)将深红酵母AS2.282接种于PDA斜面培养基，28℃恒温培养5天，待斜面上 均匀地长满一层菌后用50mL无菌水洗下菌苔，制成菌悬液备用；

(2)将所得菌悬液以2％(体积比)接种量接种于冷却至约40℃的PDA培养基中， 混匀后将此含深红酵母AS2.282的PDA培养基按每皿12.5mL吸入直径为9cm的无菌 培养皿中，待培养基凝固后在培养基表面对称放置4个牛津杯；

(3)将待测的经过滤的各菌株发酵液300μL加入到牛津杯，28℃培养24h后观 察并用游标卡尺测定抑菌圈直径。

实验重复6次，结果取平均值。

结果显示，各菌株发酵液抑菌圈与原始菌株CK-15的抑菌圈大小均没有明显差异 (图6中A和B)，利用DPS数理统计分析软件进行完全随机试验设计的标准方差分 析，并且进行Duncan’s多重比较分析各菌株发酵液抑菌圈与原始菌株的抑菌圈直径没 有显著性差异(表1为wysR3过表达菌株与原始菌株的抑菌圈直径比较结果)，这和 HPLC分析结果是一致的。说明在wysR3基因对武夷菌素总产量没有影响。

表1wysR3过表达菌株与原始菌株CK-15发酵液对深红酵母的抑菌作用

注：数据后字母表示0.01水平差异显著。

二、实验2

(一)wysR3过表达菌株、△wysR3缺失突变株以及互补菌株的发酵培养

以实施例2获得的wysR3过表达菌株、实施例3获得的△wysR3缺失突变株、实 施例4获得的互补菌株、转入pSETC空载体的对照菌株CK-15/pSETC，以及作为出 发菌株的不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15 为实验材料。

取各菌株新鲜成熟的斜面孢子接种于50mL种子培养基中振荡培养(28℃、220 r/min)48h。将种子液以2％(体积比)接种于100mL发酵培养基中，振荡培养(28 ℃、220r/min)72h，过滤收集发酵液。发酵液于6000r/min离心10min，取上清液 再经过0.22μm的微孔过滤器，获得无菌发酵滤液，4℃保存备用。

(二)管碟法检测发酵液抑菌活性

将各菌株发酵液过滤后，用管碟法测发酵液抑菌活性。以可被武夷菌素抑制生长 的深红酵母AS2.282(Rhodotorularubra)作为指示菌，从而检测各菌株发酵液的抑菌 活性。具体操作参见步骤一(实验1)。

结果显示：各菌株发酵液抑菌圈与原始菌株CK-15的抑菌圈大小均没有明显差异 (图6中C)，利用DPS数理统计分析软件进行完全随机试验设计的标准方差分析， 并且进行Duncan’s多重比较分析各菌株发酵液抑菌圈与原始菌株的抑菌圈直径没有显 著性差异(表2为wysR3过表达菌株、△wysR3缺失突变株、互补菌株以及原始菌株 的抑菌圈直径比较结果)，这和HPLC分析结果是一致的。说明在wysR3基因对武夷 菌素总产量没有影响。

表2wysR3过表达菌株、△wysR3缺失突变株、互补菌株以及原始菌株CK-15发酵液 对深红酵母的抑菌作用

注：数据后字母表示0.01水平差异显著。

实施例8、wysR3过表达菌株及△wysR3缺失突变株发酵产物的可溶性糖测定

一、wysR3过表达菌株及△wysR3缺失突变株的发酵培养

以实施例2获得的wysR3过表达菌株、实施例3获得的△wysR3缺失突变株、转 入pSETC空载体的对照菌株CK-15/pSETC，以及作为出发菌株的不吸水链霉菌武夷 变种(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15为实验材料。

取各菌株新鲜成熟的斜面孢子接种于50mL种子培养基中振荡培养(28℃、220 r/min)20h。将种子液以10％(体积比)接种于100mL发酵培养基中，振荡培养(28 ℃、220r/min)64h，过滤收集发酵液。发酵液于6000r/min离心10min，取上清液 再经过0.22μm的微孔过滤器，获得无菌发酵滤液，4℃保存备用。

二、发酵产物的可溶性糖鉴定

1、葡萄糖标准曲线的制定

取6只25mL容量瓶编号，取1.0mg/mL葡萄糖标准溶液，加入不同试剂(表3)。 摇匀后沸水浴中加热10min显色，冷水冷却后定容至25mL颠倒混匀，用UV-75B 型分光光度计在520nm波长测吸光度，以0号管为对照调零，测定出1～5号管的吸 光值。以测定的吸光值为纵坐标，以葡萄糖含量(mg)为横坐标绘制葡萄糖标准曲线。

表3葡萄糖标准溶液的系列值

2、发酵液中总糖的测定方法

参考文献“韩德权,章佳佳.DNS法在普鲁兰多糖发酵液中糖测定的研究[J].食品 工业科技,2008,29(2):285-290.”，具体步骤如下：

(1)发酵液中总糖的水解

取发酵过滤液0.5mL置于50mL容量瓶中，加入6mol/L的盐酸溶液2mL，在沸 水浴中加热15min水解，冷水冷却后加入6mol/L的氢氧化钠溶液1.8mL，并定容至 50mL，得总糖水解液。

(2)发酵液中总糖的测定

取总糖水解液2mL于25mL容量瓶中，加入DNS试剂1.5mL沸水浴中加热5min， 冷水冷却后定容至25mL摇匀，以空白作对照在520nm波长测吸光值。以葡萄糖吸光 值标准曲线为对照，计算发酵液中总糖含量。

3、结果

根据测定数据得到葡萄糖标准曲线(图7)，回归方程Y＝0.631X-0.028，方程中Y 为吸光值，X为葡萄糖含量，相关系数R²＝0.998，说明以葡萄糖为标准品在0.2～1 mg/mL范围内可用于糖含量的测定。

各菌株发酵液的测定结果显示，原始菌株CK-15的发酵液与各菌株发酵液中糖含 量没有明显变化。表4为wysR3过表达菌株和原始菌株CK-15发酵液中糖含量的测定 结果。以上结果说明wysR3基因与发酵液中糖含量没有直接关系，不影响糖含量的变 化。

表4发酵液中总糖含量