一种外源基因敲入乳酸乳球菌快速筛选系统及其构建方法和应用

摘要

本发明提供了一种外源基因敲入乳酸乳球菌的快速筛选系统，所述筛选系统包括温敏质粒和乳酸乳球菌；其中，所述温敏质粒包含his基因片段和温敏复制子-红霉素抗性基因(Ts-Emr)片段；所述乳酸乳球菌的染色体上包含lacZ基因表达片段。当外源基因成功敲入时会导致乳酸乳球菌的lacZ基因不能表达，因而在含有X-Gal的固体培养基上显示白色菌落，否则显示为蓝色，这种蓝-白色的变化，可以在固体培养基上直观地观察到，因此大大减少筛选的工作量和时间。

说明书

技术领域

本发明属生物技术，具体说是将一个外源基因克隆到乳酸乳球菌(Lactococcuslactis，L.lactis)染色体上的新方法，该方法利用lacZ基因的表型特征，使筛选外源基因敲入株更加方便快捷。

背景技术

乳酸乳球菌(Lactococcuslactis，L.Lactis)是一种非侵入性、非致病性的食品安全级革兰阳性球菌，传统上被用于多种食品(例如奶酪、黄油等)的生产之中。由于其重要的应用价值，从20世纪80年代开始，乳酸乳球菌得到广泛而深入的研究，其生化、免疫以及遗传背景已研究得比较清楚。由于其良好的安全性，乳酸乳球菌被广泛用于表达各种外源蛋白，包括各种酶、治疗性蛋白产品和疫苗组分，应用于食品工业、生物制药和疫苗研制等领域，具有重要的经济价值。其中，乳酸乳球菌乳脂亚种(L.lactissubsp.cremoris)MG1363和NZ9000，应用得最为广泛。MG1363菌株具有生长迅速、遗传操作简便、外源基因导入稳定等特点，并有大量的遗传学工具。NZ9000是MG1363的衍生菌株，是在MG1363的pepN基因中插入了nisRK基因。该基因的产物能在微量的食品安全级抗菌肽nisin的诱导下，增强P_nisZ启动子下游基因的过表达，蛋白表达量可达到生产级。因此，NZ9000被当做“细菌工厂”，用于生产多种多样的异源蛋白。由于乳酸乳球菌具有一般安全级(GRAS)性质，同时它不属于正常菌群，只在消化道内短期定植，因此NZ9000特别适于作为载体表达异源蛋白，可直接用于人或动物的消化道。

在乳酸乳球菌中表达外源蛋白，可将目的基因克隆到质粒或者细菌染色体上两个方式，其中克隆到染色体上的方式更适宜，因为外源基因更为稳定，且不引入耐药基因。克隆的方式通常采用同源重组敲入(knockin)，需要在质粒上构建针对敲入位点的两个同源臂，而目的基因则位于上下游同源臂之间。敲入过程有两个步骤：首先将质粒转入乳酸乳球菌，通过单交换同源重组，整个质粒整合到细菌基因组敲入位点，整合子通过质粒的耐药标记被筛选出来。然后将整合子在不含抗生素的培养基中传代，此时部分细菌会发生双交换同源重组，整合的质粒被切离，同时质粒上的外源基因取代敲入位点序列，完成外源基因在染色体上的克隆。对双交换同源重组的筛选，一般是以质粒携带的耐药标志存在与否来进行初步判断，即挑选大量传代细菌克隆，检测其是否仍具有耐药性，失去耐药性的克隆即为发生了双交换同源重组的克隆；进一步检测该克隆的基因组上是否存在目的基因。由于双交换同源重组是一个小概率事件，往往要挑选成千上万个克隆才能筛选到目的菌株，工作量非常大，费时费力。

发明内容

为了能够简化筛选步骤，本发明的目的是提供一种可以通过直观观察的筛选标记，最大程度地减少筛选工作量的筛选系统。为了达到这个目的，发明人在乳酸乳球菌染色体上敲入了一个lacZ基因，将其作为敲入位点，由于lacZ基因的编码产物是半乳糖苷酶，可分解X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-3-D半乳糖苷)产生蓝色产物，使菌落在含有X-Gal的固体培养基上呈蓝色。而如果lacZ基因被敲入的外源基因取代，该蓝色表型则消失，菌落呈白色。这种蓝-白色的变化，可以在培养固体培养基上直观地观察到，因此大大减少筛选的工作量和时间，简化克隆步骤。

本发明的技术方案是：

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种外源基因敲入乳酸乳球菌的快速筛选系统，所述筛选系统包括温敏质粒和乳酸乳球菌；其中，所述温敏质粒包含his基因片段和温敏复制子-红霉素抗性基因(Ts-Em^r)片段；所述乳酸乳球菌的染色体上包含lacZ基因表达片段；优选地，所述his基因片段的序列为SEQIDNO：2；更优选地，所述温敏复制子-红霉素抗性基因(Ts-Em^r)片段的序列为SEQIDNO：5；尤其优选地，所述lacZ基因表达片段的核苷酸序列为SEQIDNO：12。

在根据本发明的一个实施方案中，所述温敏质粒是以pUC18质粒为骨架质粒构建的。

在根据本发明的一个实施方案中，所述温敏质粒的核苷酸序列为SEQIDNO：1。

本发明还提供了上述筛选系统的构建方法，所述方法包括：

1)提供骨架质粒，将his基因片段和温敏复制子-红霉素抗性基因(Ts-Em^r)片段连接到所述骨架质粒中得到温敏质粒；优选地，所述骨架质粒为pUC18质粒；

2)将lacZ基因的表达片段通过同源重组的方法导入到乳酸乳球菌染色体上得到染色体上含有lacZ基因的表达片段的乳酸乳球菌；

优选地，所述his基因片段的序列为SEQIDNO：2；更优选地，所述温敏复制子-红霉素抗性基因(Ts-Em^r)片段的序列为SEQIDNO：5；尤其优选地，所述lacZ基因表达片段的核苷酸序列为SEQIDNO：12。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)所述的温敏质粒是通过包括下述步骤的方法实现的：

a)以序列为SEQIDNO：18的引物HisF和序列为SEQIDNO：19的引物HisR扩增乳酸乳球菌NZ9000的his基因，将获得的基因序列克隆到骨架质粒中；

b)以序列为SEQIDNO：20的引物TsF和序列为SEQIDNO：21的引物TsR扩增质粒pCrePA2的Ts-Em^r片段，并将获得的Ts-Em^r片段克隆到经步骤1)处理的骨架质粒中；

c)经氨苄青霉素抗性筛选，取阳性克隆提取，即得温敏质粒。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤a)中将所述his基因序列克隆到pUC18质粒的EcoRI-SmaI酶切位点。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤b)中将所述Ts-Em^r片段克隆到pUC18质粒的BamHI-PstI酶切位点。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤2)所述的染色体上含有lacZ基因的表达片段的乳酸乳球菌是通过包括下述步骤的方法实现的：

d)合成序列为SEQIDNO：6的启动子P_nisZ，以序列为SEQIDNO：22的引物PZF和序列为SEQIDNO：23的引物PZR扩增P_nisZ，获得P_nisZ的扩增产物；同时以序列为SEQIDNO：24的引物LF和序列为SEQIDNO：25的引物LR扩增lacZ基因，获得lacZ基因的扩增产物；

e)将步骤d)得到的P_nisZ的扩增产物与lacZ基因的扩增产物等比例混合作为模板，然后以PZF和LR为引物扩增，获得序列为SEQIDNO：9的PZL片段；

f)将步骤e)得到的PZL片段插入序列为SEQIDNO：10的pMG36e质粒的EcoRI-XbaI位点，通过红霉素抗性LB固体培养基筛选阳性克隆，酶切鉴定后提取得到质粒pMG36e-PZL；

g)以pMG36e-PZL质粒为模板，序列为SEQIDNO：22的PZRec和序列为SEQIDNO：22的TerRec为引物，扩增得到序列为SEQIDNO：11的PZLT片段，然后将所述PZLT片段克隆入线性化pJW质粒的AscI位点中，通过氨苄青霉素抗性固体培养基筛选阳性克隆，经酶切、测序鉴定后，提取得到序列为SEQIDNO：11的pJW-PZLT质粒；

h)将步骤g)得到的pJW-PZLT质粒转化受体菌NZ9000，然后先将获得的细菌在红霉素抗性培养基M17GS中以38.5℃的高温培养，再在无抗性M17GS培养基中以25℃的低温培养，之后将低温培养得到的培养液经适当稀释后涂布于无抗性的含有40μg/mL的X-Gal和0.1μg/mL的nisin的M17GS固体培养基上，然后对获得的蓝色菌落进行红霉素抗性筛选；筛选到的无红霉素抗性蓝色克隆经鉴定即得到PZLT片段敲入株PZLTNZ。

本发明进一步提供了上述筛选系统在快速筛选敲入乳酸乳球菌的外源基因中的应用，其特征在于，所述应用为：将外源基因插入到所述温敏质粒的his基因片段的中间，使his基因片段在外源基因两侧形成同源臂，获得含有外源基因的温敏质粒；然后将所述含有外源基因的温敏质粒转化到染色体上包含lacZ基因表达片段的乳酸乳球菌中，诱导同源重组；以含有X-Gal的培养基进行筛选，其中白色菌落即是成功敲入外源基因的乳酸乳球菌的菌落。

在根据本发明的一个实施方案中，所述外源基因为序列为SEQIDNO：14的SACNP基因。

由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：

目前将外源基因克隆到乳酸乳球菌染色体上的方法，存在筛选工作量大，费时费力，效率低下的问题。本发明针对这个问题，提供了一种利用菌落颜色的变化来快速筛选出阳性克隆的快速筛选系统。本发明通过在乳酸乳球菌的染色体上插入了一个lacZ基因，将其作为敲入位点，由于lacZ基因的编码产物是半乳糖苷酶，可分解X-Gal产生蓝色产物，使菌落在含有X-Gal的平板上呈蓝色。而如果lacZ基因被敲入的外源基因取代，该蓝色表型则消失，菌落呈白色。这种蓝-白色的变化，可以在培养平板上直观地观察到，因此大大减少筛选的工作量和时间。

附图说明

图1为温敏质粒pJW的图谱及其构建。其中his为乳酸乳球菌NZ9000的his(组氨酸合成酶)基因，用作同源重组双交换的左右臂；TsOri为来自pCrePA2质粒的温敏复制子；Ori为来自pUC18质粒的复制子；MCS为多克隆位点；Em^r为红霉素抗性基因；Ap^r为氨苄青霉素抗性基因；P(Em^r)为红霉素抗性基因启动子；P(Ap^r)为氨苄青霉素抗性基因启动子。。

图2为lacZ基因表达片段PZLT敲入质粒pJW-PZLT的构建。其中his为乳酸乳球菌NZ9000的his(组氨酸合成酶)基因，用作同源重组双交换的左右臂；Hisa和Hisb，his基因经AscI酶切后的两个片段，作为同源重组双交换的左右臂；TsOri为来自pCrePA2质粒的温敏复制子；Ori为来自pUC18质粒的复制子；OriofpMG36e为质粒pMG36e复制子；P32和P_nisZ为启动子；lacZ为嗜酸乳杆菌乳糖酶(β-半乳糖苷酶)；MCS为多克隆位点；Ter为来自pMG36e质粒的终止子；Em^r为红霉素抗性基因；Ap^r为氨苄青霉素抗性基因；P(Em^r)为红霉素抗性基因启动子；P(Ap^r)为氨苄青霉素抗性基因启动子。

图3为lacZ基因表达片段PZLT敲入NZ9000基因组过程示意图。A所示为转化了pJW-PZLT质粒的NZ9000，培养温度30℃。B所示为含质粒细菌在含有红霉素的培养基中38.5℃培养，只有发生同源重组的克隆(整合子)才能够生长。同源重组能够发生在Hisa区域或者Hisb区域(示意图中未显示)。C所示为整合子在无抗生素和25℃条件下培养，整合在基因组上的质粒通过同源重组切离基因组。通过i)途径切离质粒后，细菌恢复为NZ9000菌株；通过ii)途径切离质粒后，lacZ基因(PZLT片段)插入NZ9000基因组his基因AscI位点处，命名为PZLTNZ。

图4为lacZ基因表达片段PZLT敲入株PZLTNZ的鉴定。A为PCR引物在基因组DNA上的结合位点示意图；B为lacZ基因敲入株PZLTNZ的鉴定PCR产物电泳结果，以LO-RO引物对和LF-LR引物对扩增(M.Marker；1，3.以PZLTNZ基因组为模板的PCR产物；2，4.以NZ9000基因组为模板的PCR产物)。

图5为外源基因SACNP敲入乳酸乳球菌基因组过程示意图。A所示为含外源基因SACNP的pJW-SACNP质粒转入PZLTNZ，培养温度30℃。B所示为含质粒细菌在含有红霉素的培养基中38.5℃培养，只有发生同源重组的克隆(整合子)才能够生长。同源重组能够发生在Hisa区域或者Hisb区域(示意图中未显示)。C所示为整合子在无抗生素和25℃条件下培养，整合在基因组上的质粒通过同源重组切离基因组。通过ii)途径切离质粒后，细菌恢复成PZLTNZ菌株；通过iii)途径切离质粒后，外源基因SACNP替代PZLT片段，但含PZLT片段的质粒未被丢失；通过iv)途径切离质粒后，外源基因SACNP片段替代PZLT片段且质粒被消除。其中i)～iii)菌落表现为蓝色，而iv)菌落表现为白色且无红霉素抗性。

图6为外源基因敲入乳酸乳球菌快速筛选系统的应用：外源基因SACNP敲入PZLTNZ基因组的实验获得的敲入株SACNP-NZ.1～SACNP-NZ.11的鉴定。PCR产物电泳结果，以LO/RO引物对扩增(M.Marker；1～11.以SACNP-NZ.1～SACNP-NZ.11基因组为模板的PCR产物；12.以PZLTNZ基因组为模板的PCR产物)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处说描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一、试剂和材料

材料：

1.PremixTaq聚合酶(TaKaRa公司产品，中国大连)

2.PrimerSTARMaxPremix聚合酶(TaKaRa公司产品，中国大连)

3.FastDigestAscI、BamHI、EcoRI、PstI、SmaI、XbaI等限制性内切酶(Thermo公司产品，美国)

4.DNALigationKitVer.2.1连接试剂盒(TaKaRa公司产品，中国大连)

5.质粒pUC18(TaKaRa公司产品，中国大连)

6.质粒pMG36e(中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心，中国北京)

7.质粒pCrePA2由NIH的Stephen.H.Leppla教授馈赠

8.质粒pQE31-lacZ由本实验室潘渠构建(Q.Pan，J.Zhu，L.Liu，Y.Cong，F.Hu，J.Li，X.Yu，Functionalidentificationofaputativebeta-galactosidasegeneinthespeciallacgeneclusterofLactobacillusacidophilus，CurrMicrobiol60(2010)172-178.)

9.质粒DNA抽提试剂盒(Omega公司产品，美国)

10.细菌基因组抽提试剂盒(天根公司产品，中国北京)

11.PCR产物及DNA胶回收试剂盒(Promega公司产品，美国)

12.NovoRec无缝克隆试剂盒(近岸公司产品，中国上海)

13.nisin(Sigma-Aldrich公司产品，美国)

14.红霉素、氨苄青霉素(上海生工产品，中国上海)

15.X-Gal(Fluka公司产品，美国)

16.大肠杆菌Top10感受态细胞(天根公司产品，中国北京)

17.乳酸乳球菌NZ9000(中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心，中国北京)

18.酵母提取物、胰蛋白胨、M17肉汤(Oxoid公司产品，英国)

19.引物合成、DNA片段合成和DNA片段测序(华大基因，中国北京)

20.LB培养基：称取酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g，溶于1000mL去离子水中；121℃高压蒸汽灭菌；固体LB培养基另加入15g琼脂粉。根据需要加入终浓度250μg/mL的红霉素或100μg/mL的氨苄青霉素。

21.M17GS培养基：称取M17粉37.25g，蔗糖55g，溶于900mL去离子水中，定容至950mL；115℃高压蒸汽灭菌；固体M17GS培养基另加入1.5％琼脂粉；灭菌后加入过滤除菌的含10％葡萄糖、10％乳糖的溶液50mL。根据需要加入终浓度40μg/mL的X-Gal、0.1μg/mL的nisin、20μg/mL的红霉素。

22.SGM17培养基：称取M17粉37.25g，蔗糖181g，溶于800mL去离子水中，定容至950mL；115℃高压蒸汽灭菌；灭菌后加入过滤除菌的含10％葡萄糖、10％乳糖的溶液50mL。

23.SGM17MC培养基：称取M17粉37.25g，蔗糖181g，溶于800mL去离子水中，定容至940mL；115℃高压蒸汽灭菌；固体M17GS培养基另加入1.5％琼脂粉；灭菌后加入过滤除菌的含10％葡萄糖、10％乳糖的溶液50mL以及高压灭菌的含2MMgCl₂和0.2MCaCl₂的溶液10mL。根据需要加入终浓度20μg/mL的红霉素、40μg/mL的X-Gal和0.1μg/mL的nisin。

24.GS溶液：称取蔗糖181g，量取甘油100mL，溶于800mL去离子水中，定容至1000mL，115℃高压蒸汽灭菌。

25.凝胶成像仪(BIO-RAD公司产品，美国)

26.GenePμLserXcell型电穿孔仪(BIO-RAD公司产品，美国)

实施例1：温敏质粒pJW的构建。

1)引物设计：根据NZ9000基因组his基因序列(SEQIDNO：2)、Ts-Em^r片段序列(SEQIDNO：5)设计PCR引物，碱基序列如下：

引物名称引物序列(下划线处为引入的酶切位点)酶切位点HisFAAAGAATTCTAAAGTAATTTTCATCAATTTTTTCTAAGCEcoRIHisRGTTTGGGAGTCGCCTTTGGCTC-TsFAAAGGATCCTGATCGTTAAATTTATACTGCAATBamHITsRAAACTGCAGTACCTAATAATTTATCTACATTCCCPstI

2)his基因的PCR扩增：以NZ9000基因组DNA为模板，用引物HisF(SEQIDNO：18)和HisR(SEQIDNO：19)进行PCR，扩增his基因，方法如下：

PCR的反应体系为：2×PrimerS TAR Max Premix25μLNZ9000基因组1μL引物HisF(20μM)1μL引物HisR(20μM)1μLddH₂O22μL合计50μL

PCR的反应条件为：第一阶段98℃预变性2min；第二阶段98℃变性10sec，55℃退火15sec，72℃延伸1min，循环30次；第三阶段72℃延伸5min。所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见～2.5kb大小的电泳条带，将所得PCR产物电泳做胶回收纯化，标记为His1，用EcoRI进行单酶切，将酶切产物电泳做胶回收纯化，标记为His2，冻存备用。

3)His2片段的克隆：

将EcoRI单酶切后的His2片段与用EcoRI/SamI内切酶双酶切处理过的pUC18载体进行连接，16℃连接过夜后将连接产物转化Top10大肠杆菌感受态细胞，经氨苄青霉素筛选后，挑取LB固体培养基上的克隆培养于LB液体培养基中37℃振荡过夜。次日提取质粒DNA，用EcoRI和BamHI进行双酶切鉴定，将有～2.5kb大小DNA片段出现的重组质粒命名为pUC18-H。

4)Ts-Em^r片段的PCR扩增：以pCrePA2质粒(SEQIDNO：4)为模板，用引物TsF(SEQIDNO：20)和TsR(SEQIDNO：21)进行PCR，扩增Ts-Em^r片段，方法如下：

PCR的反应条件为：第一阶段98℃预变性2min；第二阶段98℃变性10sec，55℃退火15sec，72℃延伸2min，循环30次；第三阶段72℃延伸5min。所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见～3.8kb大小的电泳条带，将所得PCR产物电泳做胶回收纯化，标记为Ts1，用BamHI和PstI进行双酶切，将酶切产物电泳做胶回收纯化，标记为Ts2，冻存备用。

5)Ts2片段的克隆：将BamHI和PstI双酶切后的Ts2片段与用同样内切酶双酶切处理过的pUC18-H载体进行连接，16℃连接过夜后将连接产物转化Top10大肠杆菌感受态细胞，经氨苄青霉素筛选后，挑取LB固体培养基上的克隆培养于含氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃振荡过夜。次日提取质粒DNA，用BamHI和PstI进行双酶切鉴定，将有～3.8kb大小DNA片段出现的重组质粒命名为pJW。

质粒pJW的确认：温敏质粒pJW进行测序，测序结果表明载体pJW的构建完全正确。(SEQIDNO：1)。

实施例2lacZ基因表达序列(PZLT片)段敲入载体pJW-PZLT的构建。

1).P_nisZ片段合成：根据P_nisZ启动子序列(SEQIDNO：6)，由华大基因合成启动子P_nisZ并克隆入pEASY质粒，构建质粒pEASY-P_nisZ。

2).OverlapPCR获得PZL片段：

(1).引物设计：根据P_nisZ序列、嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶lacZ基因序列(SEQIDNO：7)设计OverlapPCR引物，碱基序列如下：

其中PZR和LF有30bp的互补序列。

(2).以pEASY-P_nisZ质粒为模板，用引物PZF(SEQIDNO：22)和PZR(SEQIDNO：23)进行PCR，扩增P_nisZ片段，方法如下：

PCR的反应体系为：2×PrimerSTAR Max Premix25μLpEASY-P_nisZ质粒0.1μL引物PZF(20μM)1μL引物PZR(20μM)1μLddH₂O22.9μL合计50μL

PCR的反应条件为：第一阶段98℃预变性2min；第二阶段98℃变性10sec，52℃退火15sec，72℃延伸15sec，循环30次；第三阶段72℃延伸5min。所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见200bp大小的电泳条带，将所得PCR产物电泳做胶回收纯化，标记为PZ1，冻存备用。

(3).以pQE31-lacZ质粒(SEQIDNO：8)为模板，用引物LF(SEQIDNO：24)和LR(SEQIDNO：25)进行PCR，扩增lacZ片段，方法如下：

PCR的反应体系为：2×PrimerSTAR Max Premix25μLpQE31-lacZ质粒0.1μL引物LF(20μM)1μL引物LR(20μM)1μLddH₂O22.9μL合计50μL

PCR的反应条件为：第一阶段98℃预变性2min；第二阶段98℃变性10sec，52℃退火15sec，72℃延伸1min，循环30次；第三阶段72℃延伸5min。所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见～2kb大小的电泳条带，将所得PCR产物电泳做胶回收纯化，标记为L1，冻存备用。

(4).OverlapPCR由于PZR和LF引物有部分互补序列，所以再用PZ1和L1片段为模板做OverlapPCR，方法如下：

PCR的反应体系为：2×PrimerSTAR Max Premix25μLPZ1片段0.5μLL1片段0.5μL引物LF(20μM)1μL引物LR(20μM)1μLddH₂O22μL合计50μL

PCR的反应条件为：第一阶段98℃预变性2min；第二阶段98℃变性10sec，52℃退火15sec，72℃延伸1min，循环30次；第三阶段72℃延伸5min。所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见～2.2kb大小的电泳条带，将所得PCR产物电泳做胶回收纯化，标记为PZL1，用EcoRI和XbaI进行双酶切，将酶切产物电泳做胶回收纯化，标记为PZL2，冻存备用。

3).PZL2片段的克隆：将EcoRI和XbaI双酶切后的PZL2片段与用同样内切酶双酶切处理过的pMG36e质粒进行连接，16℃连接过夜后将连接产物转化Top10大肠杆菌感受态细胞，经红霉素筛选后，挑取LB固体培养基上的克隆培养于含红霉素的LB液体培养基中37℃振荡过夜。次日提取质粒DNA，用EcoRI和XbaI进行双酶切鉴定，将有～2.2kb大小DNA片段出现的重组质粒命名为pMG36e-PZL。

4).PZLT片段的扩增与克隆：

(1).根据P_nisZ序列、pMG36e多克隆位点后的终止子Ter序列和his基因AscI酶切位点左右的序列设计无缝克隆引物，碱基序列如下：

(2).以pMG36e-PZL质粒为模板，用引物PZRec(SEQIDNO：26)和TerRec(SEQIDNO：27)进行PCR，扩增PZLT片段，方法如下：

PCR的反应体系为：2×PrimerSTAR Max Premix25μLpMG36e-PZL质粒0.1μL引物PZRec(20μM)1μL引物TerRec(20μM)1μLddH₂O22.9μL合计50μL

PCR的反应条件为：第一阶段98℃预变性2min；第二阶段98℃变性10sec，52℃退火15sec，72℃延伸2min，循环30次；第三阶段72℃延伸5min。所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见～2.5kb大小的电泳条带，将所得PCR产物电泳做胶回收纯化，标记为PZLT-A，冻存备用。

(3).PZLT片段的克隆：pJW使用AscI单酶切线性化，将所得线性化载体电泳做胶回收纯化，标记为pJW-A，使用NovoRec无缝克隆试剂盒与PZLT片段重组，方法如下：

无缝克隆反应体系：NovoRec 10×重组缓冲液1μLNovoRec重组酶0.5μL线性化载体pJW-A1μLPZLT-A片段7.5μL合计10μL

无缝克隆反应条件为：37℃孵育30min，后将无缝克隆产物转化Top10大肠杆菌感受态细胞，经氨苄青霉素素筛选后，挑取LB固体培养基上的克隆培养于含氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃振荡过夜。次日提取质粒DNA，用AscI进行单酶切鉴定，将有～2.5kb大小DNA片段出现的重组质粒命名为pJW-PZLT。

载体pJW-PZLT的确认：PZLT片段敲入载体pJW-PZLT进行测序，测序结果表明在pJW质粒上的his基因的AscI酶切位点中插入的PZLT片段完全正确(SEQIDNO：12)。

实施例3乳酸乳球菌NZ9000菌株PZLT片段敲入株的构建、筛选与鉴定

1).乳酸乳球菌电转化法感受态细胞的制备：

受体菌乳酸乳球菌(NZ9000)接种于M17GS培养基，30℃静置培养过夜后，1∶100接种SGM17培养基，30℃静置培养至菌液OD₆₀₀＝0.2～0.3(约4hr)。将菌液迅速置于冰上冷却30min，4℃下3200g冷冻离心30min，弃上清。菌体置于冰上，用约200mL预冷GS溶液轻柔重悬，3200g、4℃离心20min，弃上清；重复上步骤两次(GS溶液分别减少至100mL、50mL)。菌体沉底加1mL的GS溶液重悬，分装后立即使用或置于-80℃冻存。

2).乳酸乳球菌的电转化法：

乳酸乳球菌电转化法感受态细胞50μL，与冰上融化；加入5μL质粒，枪头混匀，置于2mm电击杯中。电击参数：电压2kV，电容25μF，电阻200Ω。电击后立即加入0.95mL预冷的SGM17MC重悬细胞，冰浴5min后30℃复壮2hr，分别涂多块含抗生素的SGM17MC固体培养基，30℃培养至长出菌落，即为转化了质粒的乳酸乳球菌。

3).乳酸乳球菌NZ9000菌株的lacZ基因表达片段PZLT敲入突变株的构建和筛选

pJW-PZLT质粒使用电转化法转入NZ9000菌株，复壮后涂多块SGM17MC固体培养基(含X-Gal、nisin、红霉素)，30℃培养至长出蓝色菌落，即为转化了pJW-PZLT质粒的NZ9000菌株，命名为pJW-PZLT/NZ9000。

pJW-PZLT/NZ9000在含有红霉素的M17GS中，30℃培养过夜。培养物1∶100接种含有红霉素的M17GS中，38.5℃培养，诱导质粒pJW-PZLT通过同源重组整合入NZ9000基因组。38.5℃培养至菌液变浑浊后，1∶10⁵接种M17GS，25℃培养，诱导质粒pJW-PZLT通过同源重组从基因组上掉下。25℃培养至菌液变浑浊后，培养液经适当稀释后涂多块M17GS(含X-Gal、nisin)固体培养基，30℃培养至长出蓝色菌落。用灭菌牙签挑取所以蓝色菌落，分别接种不含红霉素的M17GS(含X-Gal、nisin)固体培养基和含红霉素的M17GS(含X-Gal、nisin)固体培养基。当挑取到的蓝色菌落不含红霉素抗性基因，只在不含红霉素的M17GS(含X-Gal、nisin)固体培养基上生长变蓝，而在含有红霉素的固体培养基上不生长，获得的菌落即为发生了第二次同源重组双交换，并且lacZ基因表达片段PZLT敲入NZ9000菌株基因组的突变株，命名为PZLTNZ。

4).乳酸乳球菌NZ9000菌株PZLT片段敲入株PZLTNZ的鉴定：

(4).鉴定引物的设计：根据NZ9000基因组his基因上下游序列(SEQIDNO：16和17)，设计了基因敲入鉴定引物，碱基序列如下：

鉴定引物LO(SEQIDNO：28)和RO(SEQIDNO：29)均位于his基因的外侧，用于基因敲入突变株的PCR及测序鉴定。

(5).PCR扩增鉴定：

a.以PZLTNZ菌株和NZ9000菌株基因组DNA为模板，用引物LO和RO进行PCR，看结果是否符合预期。

PCR的反应体系为：2×PrimerS TAR Max Premix25μLPZLTNZ和NZ9000基因组1μL引物LF(20μM)1μL引物LR(20μM)1μLddH₂O22μL合计50L

PCR的反应条件为：第一阶段98℃预变性2min；第二阶段98℃变性10sec，55℃退火15sec，72℃延伸1min，循环30次；第三阶段72℃延伸5min。所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见～2kb(PZLTNZ)大小的电泳条带，而以NZ9000为模板的PCR产物无扩增条带。

b.以PZLTNZ菌株和NZ9000菌株基因组DNA为模板，用引物LO和RO进行PCR，看结果是否符合预期。

PCR的反应体系为：2×PrimerS TAR Max Premix25μLPZLTNZ和NZ9000基因组1μL引物LO(20μM)1μL引物RO(20μM)1μLddH₂O22μL合计50μL

PCR的反应条件为：第一阶段98℃预变性2min；第二阶段98℃变性10sec，55℃退火15sec，72℃延伸2min，循环30次；第三阶段72℃延伸5min。所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见～5kb(PZLTNZ)和2.5kb(NZ9000)大小的电泳条带；将～5kb的PCR产物回收、纯化，分别送交华大基因进行测序，结果符合预期(SEQIDNO：12)。

实施例4外源基因敲入乳酸乳球菌快速筛选系统的应用

本发明所述外源基因敲入乳酸乳球菌快速筛选系统包括之前所述温敏质粒pJW和敲入了lacZ基因的乳酸乳球菌菌株PZLTNZ。使用本系统，本申请的发明人已经成功将十个外源基因分别敲入到菌株PZLTNZ基因组中，证实了该系统的有效性。在本实施例中，以一个～4.3kb的外源基因为例，详细说明该系统的操作过程。该外源基因为本实验室构建的pMG36e-SACNP(SEQIDNO：13)质粒上的一段～4.3kb的片段SACNP(SEQIDNO：14)。

1).受体菌PZLTNZ菌株电转化法感受态细胞的制备及电转化方法：

PZLTNZ菌株电转化法感受态细胞的制备及电转化方法，与前所述NZ9000电转化法感受态细胞的制备及电转化方法一致。

2).以pMG36e-SACNP质粒为模板，用引物PZRec和TerRec进行PCR，扩增SACNP片段，方法如下：

PCR的反应体系为：2×PrimerS TAR Max Premix25μLpMG36e-SACNP质粒0.1μL引物PZRec(20μM)1μL引物TerRec(20μM)1μLddH₂O22.9μL合计50μL

PCR的反应条件为：第一阶段98℃预变性2min；第二阶段98℃变性10sec，52℃退火15sec，72℃延伸2min，循环30次；第三阶段72℃延伸5min。所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见～4.3kb大小的电泳条带，将所得PCR产物电泳做胶回收纯化，标记为SACNP-A，冻存备用。

3).SACNP片段的克隆：pJW使用AscI单酶切线性化片段pJW-A，使用NovoRec无缝克隆试剂盒与SACNP片段重组，方法如下：

无缝克隆反应体系：NovoRec 10×重组缓冲液1μLNovoRec重组酶0.5μL线性化载体pJW-A1μLSACNP-A片段7.5μL合计10μL

无缝克隆反应条件为：37℃孵育30min，后将无缝克隆产物转化Top10大肠杆菌感受态细胞，经氨苄青霉素素筛选后，挑取LB固体培养基上的克隆培养于含氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃振荡过夜。次日提取质粒DNA，用AscI进行单酶切鉴定，将有约4.3kb左右大小DNA片段出现的重组质粒命名为pJW-SACNP。

4).载体pJW-SACNP的确认：SACNP片段敲入载体pJW-SACNP进行测序，测序结果表明在pJW质粒上的his基因的AscI酶切位点中插入的SACNP(SEQIDNO：14)片段完全正确。

5).无抗性外源基因SACNP敲入乳酸乳球菌基因组的构建及快速筛选：

pJW-SACNP质粒使用电转化法转入PZLTNZ菌株，复壮后涂多块SGM17MC固体培养基(含X-Gal、nisin、红霉素)，30℃培养至长出蓝色菌落，即为转化了pJW-SACNP质粒的PZLTNZ菌株，命名为pJW-SACNP/PZLTNZ。

pJW-SACNP/PZLTNZ在含有红霉素的M17GS中，30℃培养过夜。培养物1∶100接种含有红霉素的M17GS中，38.5℃培养，诱导质粒pJW-SACNP通过同源重组整合入PZLTNZ基因组。38.5℃培养至菌液变浑浊后，1∶10⁵接种M17GS，25℃培养，诱导质粒pJW-SACNP通过同源重组从基因组上掉下。25℃培养至菌液变浑浊后，培养液经适当稀释后涂多块M17GS(含X-Gal、nisin)固体培养基，30℃培养至长出的菌落绝大部分变蓝。在获得的2149个菌落中，有11个菌落为白色。用灭菌牙签挑取所有白色菌落，分别接种不含红霉素的M17GS(含X-Gal、nisin)固体培养基和含红霉素的M17GS(含X-Gal、nisin)固体培养基，经30℃培养过夜后，11株细菌后均无红霉素抗性，分别命名为SACNP-NZ.1～SACNP-NZ.11。

6).乳酸乳球菌的SACNP片段敲入突变株SACNP-NZ的鉴定：PCR扩增及测序

PCR的反应条件为：第一阶段98℃预变性2min；第二阶段98℃变性10sec，55℃退火15sec，72℃延伸2min，循环30次；第三阶段72℃延伸5min。所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见～7.8kb(SACNP-NZ.1～SACNP-NZ.11)和～5kb(PZLTNZ)大小的电泳条带。将所以约7.8kb的PCR产物回收、纯化，送交华大基因进行测序，结果符合预期(SEQIDNO：15)。

现有的技术能将外源基因敲入到乳酸乳球菌的基因组上，但存在筛选工作量大，费时费力，引入抗性基因的问题。而本发明所述的外源基因敲入乳酸乳球菌快速筛选系统，利用菌落颜色的变化，能快速筛选到外源基因敲入的阳性克隆。本专利实施例3中，共在2149个克隆中获得了11个白色菌落，这11个克隆均无抗生素抗性。经测序检测，均有目的片段SACNP片段敲入基因组，替代lacZ基因表达序列PZLT。整个筛选工作的工作量非常小，仅挑选11个菌落，而准确率达到100％，且不在最终的菌株中引入抗性基因。因此，该快速筛选系统可替代NZ9000，用于外源基因的敲入，成为乳酸乳球菌稳定表达外源基因的实验室常用工具之一，并可进一步用于下游的研究及工业化生产。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。