一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌及其应用

摘要

本发明公开了一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌，属于生物工程技术领域。所述菌株为异常威克汉姆酵(Wickerhamomycesanomalus)，已于2015年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？NO.10370。本发明所述菌株产乙酸乙酯的最佳温度为22℃，耐酸性为pH2.5～7.0；耐盐性为0～15％(NaCl％)；耐乙醇性为0～10％(v％)，发酵产生的代谢产物仅有乙酸乙酯和少量乙醇，不含杂醇油。本发明菌株可作为重要功能菌应用于食醋、酱油、豆豉、面酱、酿造酒、蒸馏酒、配制酒等传统发酵行业及食品工业中，降低传统生产的发酵温度，优化生产工艺，降低生产能耗及成本，同时增加产品乙酸乙酯含量，改善产品风味，提高产品品质，具有可观的经济效益。

说明书

技术领域

本专利属于生物工程技术领域，具体涉及一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌及其应 用。

背景技术

产酯酵母又称生香酵母，不是酵母分类学上的名词，是指可生成较多量酯类物质的酵 母的通称，分属于汉逊酵母属、产朊酵母属、假丝酵母属、球拟酵母属和酒香酵母属等。 酯属于一种有机化合物，低级酯是一类具有香气的挥发性液体。产酯酵母大多是一些野生 酵母，它们在自然界中分布较广，在酿造工业的原料、制造工序以及制成品中都有不同程 度的体现，在我国酿造行业中占有举足轻重的地位，被广泛用于白酒、黄酒、葡萄酒、酱 油、豆瓣、甜面酱、食醋等传统发酵食品，是产香的主要菌种之一。

从20世纪60年代开始，产酯酵母便已用于白酒生产，弥补了白酒香气不足和后味较淡 的缺点。产酯酵母不但适于液体培养，也适于半固态和固态培养。据报道，当前大多产酯 酵母在温度为25～30℃，尤其是28℃时总酯生成量最高。专利号CN102199556A中公开一 种高产酯酿酒酵母基因工程及其构建方法，专利号CN102586125A中公开的一株高产酯的东 方伊萨酵母菌、其组合物及应用，专利号CN103184167A中公开的一株异常威克汉姆酵母及 其应用，这些专利中涉及的菌株均为高产乙醇、乙酸乙酯的菌株，但产酯温度都偏高 (25～28℃间)，此外以上报道菌株的代谢产物种类多，在实际应用中，不利于突出产品 的特有风味。对于低温条件下产酯高、且代谢产物单一的酵母，尚未见报道。而在发酵食 品生产过程中，生产企业为了增加产品的风味物质含量，大多都采用提高发酵温度以创造 有利于在较高温度下才能合成酯类物质的微生物的生长环境，可见，产酯酵母发酵温度 高，带来的后果是增加工艺难度，能耗增加，生产成本高。

发明内容

为了解决上述发酵食品生产过程中发酵温度高带来的工艺难度大、能耗增加、生产成本 高、代谢产物种类多等问题，本发明提供一种耐酸、耐盐、耐乙醇、在低温条件下即能高 产乙酸乙酯的酵母菌，本发明目的通过下述技术方案来实现：

一株低温条件下高产乙酸乙酯的酵母菌，其特征在于，所述菌株为异常威克汉姆酵母 (Wickerhamomycesanomalus)，已于2015年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.10370。

作为本发明的一种优选，所述菌株产乙酸乙酯的最佳温度为22℃，耐酸性为pH2.5～7.0， 耐盐性为0～15％(NaCl％)，耐乙醇性为0～10％(v％)。

作为本发明的一种优选，所述菌株的筛选方式为：将曲药、酿造醅或酿造原料用研钵研磨 后称取10g至100mL无菌生理盐水，摇床150r/min震荡30min，稀释涂布于初筛培养基，挑 选透明圈直径和菌落直径之比较大菌落即产酯显著菌株，再将菌株转接，进行摇瓶发酵复筛， 测定发酵液酯含量，筛选获得产酯能力强的菌株。

作为本发明的一种优选，所述产酯初筛培养条件为：初筛培养基：蛋白胨20％、葡萄糖2％、 酵母膏1％，琼脂2％、三丁酸甘油酯0.4％，用去离子水配制，自然pH，28～30℃培养1～3天， 根据透明圈直径和菌落直径之比判断产酯性能。

作为本发明的一种优选，所述摇瓶发酵培养条件为：将大米或麦芽糖化液与麸皮浸提液按 照体积比为5-9:3的比例进行配置，调节PH至5.0，在25-35℃，150rpm条件下摇瓶培养 24-120h。

作为本发明的一种优选，所述大米或麦芽糖化液的制备为：50g大米或麦芽样品经粉碎后， 加2-6倍体积的水，蒸煮0.5-2h，呈糊状，冷却后以每克原料4～8U的量加入糖化酶α-淀粉 酶，于60℃水浴0.5-2h，液化完成后用1mol/L的盐酸调节pH至4.0，然后以每克原料40～ 100U的量加入糖化酶，60℃水浴，糖化完全，过滤、离心，收集上清液即为大米汁或麦芽汁。

作为本发明的一种优选，所述麸皮浸提液的制备为：称取400g麸皮并加入1-5倍水，90℃ 水浴1-2h，冷却过滤，滤液即为麸皮浸提液。

本发明还公开了所述菌株在传统发酵行业和食品工业中的应用。

作为本发明的一种优选，所述菌株在食醋、酱油、豆豉、面酱、酿造酒、蒸馏酒、配制 酒等行业中的应用。

本发明的有益效果：本发明所述菌株产乙酸乙酯的最佳温度为22℃，耐酸性为pH2.5～ 7.0；耐盐性为0～15％(NaCl％)；耐乙醇性为0～10％(v％)，在低温条件下即能使产酯量达 到最大，且发酵产生的代谢产物仅有乙酸乙酯和少量乙醇，不含杂醇油。本发明菌株可作 为重要功能菌应用于食醋、酱油、豆豉、面酱、酿造酒、蒸馏酒、配制酒等传统发酵行业 及食品工业中，降低传统生产的发酵温度，优化生产工艺，降低生产能耗及成本，同时增 加产品乙酸乙酯含量，改善产品风味，提高产品品质，具有可观的经济效益。

附图说明

图1为酵母菌Njsys-HD1的26SrDNAD1/D2区序列系统发育树；

图2为酵母菌Njsys-HD1代谢产物图；

图3乙酸乙酯质谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发 明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不 用于限定本发明。

实施例1产酯酵母菌的筛选

将曲药、发酵醅用研钵研磨后分别称取10g至100ml无菌生理盐水，摇床150r/min震 荡30min即为菌悬液，进行十倍系列稀释，将稀释液涂布于初筛培养基，挑选透明圈直径 和菌落直径之比较大菌落即产酯显著菌株。再将菌株转接，进行摇瓶发酵复筛，采用 HS-SPME-GC-MS方法测定发酵液酯种类，利用GB/T10345—2007规定的白酒总酯的测定方 法测定发酵液乙酸乙酯含量，筛选获得产乙酸乙酯能力强的菌株。

产酯初筛培养条件为：初筛培养基：蛋白胨20％(质量百分比，下同)、葡萄糖2％、酵 母膏1％，琼脂2％、三丁酸甘油酯0.4％，用去离子水配制，自然pH，28℃培养2天，根据 透明圈直径和菌落直径之比判断产酯性能。

摇瓶发酵培养的具体过程如下：

①、大米汁发酵培养基的制作：50g大米经粉碎后，加入4.5倍体积的水，蒸煮1h，呈 糊状，冷却后以每克原料6U的量加入α-淀粉酶，于60℃水浴1h，液化完成后用1mol/L的 盐酸调节pH至4.0，然后以每克原料80U的量加入糖化酶60℃，60℃水浴，直至碘试不显 蓝色为止，后煮沸灭酶，糖化完全，过滤、离心，收集上清液即大米汁备用。

②、麸皮浸提液的制备：称取400g麸皮并加入5倍水，90℃水浴1h，冷却过滤，收集 滤液备用，滤液即为麸皮浸提液。

③、摇瓶发酵培养：将麸皮浸提液添加到大米汁发酵培养基中，大米汁与麸皮浸提液的 体积比为7:3，调节PH至5.0，在28℃，150rpm的条件下，摇瓶培养24h。

发酵液酯种类的测定：采用HS-SPME-GC-MS方法测定，15mL顶空瓶中加入5～10mL澄清 发酵液及1～5gNaCl，进行顶空固相微萃取。顶空固相微萃取的条件为：三相(Car/DVB/PDMS) 萃取头，60℃预热5～10min，萃取吸附30～50min，GC解吸3～10min。发酵液酯种类的测 定结果如图2，图3所示。

实施例2产乙酸乙酯酵母菌及其分子生物学鉴定

对获得的产乙酸乙酯酵母菌进行分子生物学鉴定，利用酵母特异分类鉴定引物分别扩增 菌株的26SrDNA片段，经凝胶电泳检测。随后进行测序比对，确定所筛得酵母的种属。将 菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，酵母种属及保藏编号为：异 常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)CGMCCNO：10370。

酵母菌的种属确认过程如下：

分离菌株的26SrDNA序列同源性鉴定：酵母菌DNA的提取:将酵母菌活化后接种在液体 YPD培养基中，28℃摇床培养12h后，取少量菌体到灭菌的1.5mLEP管中，加入500ulCBTA 缓冲液和50ul蜗牛酶(100mg/ul)，37℃，225r/min，震荡2h后，加入100ulSDS，接着在 65℃水浴15min和-80℃冰浴20min，反复冻融3次之后，加等体积氯仿酚异戊醇(25:24:1， v/v/v)震荡1min，静置10min，12000g离心10min，取上清液到新的无菌EP管中，取上 清液450ul到新的EP中，加入0.6倍体积预冷的异丙醇，常温静置1h后，20℃，13000g 离心20min，完成后，弃上清液，加入1ml70％乙醇，静置10min后4℃，13000g离心15min， 弃乙醇溶液(重复洗涤2次)，吹干至无醇味，加入50ul无菌双蒸水，65℃水浴1h，最后 琼脂糖电泳检测DNA有无。

26SrDNA基因的扩增：对所提的总DNA进行26SrDNA的PCR扩增，扩增反应的引物 为一对通用引物，正向引物为NL-1(5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3')，反向引物 为NL-4(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3')。

PCR反应体系(50uL)为：无菌超纯水33.5ul，10×PCRBuffer5ul，dNTP4ul，Mg2+3ul， 两个引物各1ul(10uM/ul)，Taq酶0.5ul，模板1ul。

PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸90s，共 35个循环，最后72℃延伸10min，最后通过140V电泳20min检测结果。并寄往上海杰李 生物技术公司测序。

数据分析：将扩增序列与NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库进行比对，找出 与克隆子序列同源性最高的序列，用于构建系统发育树和确定其分类地位。DNAMAN软件 对齐序列，Mega6.0软件的邻位法(Neighbor-joining)构建系统发育树，系统发育树采用 Neighbor-Joining(邻位相接)算法、Boottrap1000次计算，结果如图1所示。Njsys-HD1 菌株与Wickerhamomyces·sp在进化树一个分枝上，与Wickerhamomycesanomalus种的菌株 在一个类群内而与其他种处于不同的分枝。因此该菌株为异常威克汉姆酵母。

实施例3酵母菌株的耐酸性能试验

调节YPD液体培养基pH至1.0-7.0，以pH0.5梯度递增，每个梯度做三个平行，接种 10％(V/V)酵母菌悬液，在30℃，150r/min，培养24h后，用酶标仪在600nm波长条件下 测定培养基的浊度，确定菌体生长情况。菌株耐酸性结果如下表1所示。

表1菌株耐酸性能(OD₆₀₀值)

pH 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 OD₆₀₀0.002 1.085 1.291 1.341 1.335 1.403 1.403 1.425 1.421 1.417 1.433

表1表明菌株在pH2.5时OD₆₀₀达到1.085，说明在pH2.5的环境下菌株能正常生长，

且随着pH的增大，菌株在酸性环境下仍能很好的生长。但当pH为2.0时，OD₆₀₀值为0.002， 菌株生长受到限制。从本实施例得出本发明酵母菌菌株的耐酸性为pH2.5～7.0。

实施例4酵母菌株的耐盐性能试验

调节YPD液体培养基NaCl浓度为2％、4％、9％、12％、15％、18％(m/V)，每个梯度做三个 平行，接种10％(V/V)酵母菌悬液，在30℃下，150r/min，培养24h后，用酶标仪在600nm 波长条件下测定培养基的浊度，确定菌体生长情况。以未添加NaCl的YPD液体培养基为空 白，菌株耐盐性能如下表2所示。

表2菌株耐盐性能(OD₆₀₀值)

盐浓度(％) 0％ 3％ 6％ 9％ 12％ 15％ 18％ OD₆₀₀值 1.754 1.673 1.526 1.309 1.186 0.105 0.008

表2表明，在盐度为0％～15％时，菌株能正常生长，当盐度大于15％后OD₆₀₀减小到0.008， 说明当盐度大于15％，菌株不能很好的生长。本实施例得出本发明酵母菌耐盐范围为0％～ 15％(NaCl％)。

实施例5酵母菌株的耐乙醇性能试验

调节YPD液体培养基乙醇浓度为0％，2％，4％，6％，8％，10％，12％(V/V)，并接种10％(V/V) 酵母菌悬液，每个梯度做三个平行，并做一个空白，加入等体积的无菌水代替菌悬液，在 30℃，150r/min，培养24h后，用酶标仪在600nm波长条件下测定培养基的浊度，确定菌 体生长情况。菌株耐乙醇性能如下表3所示。

表3菌株耐乙醇性能(OD₆₀₀值)

乙醇浓度(％) 0％ 2％ 4％ 6％ 8％ 10％ 12％ OD₆₀₀值 1.931 1.644 1.600 1.406 0.905 0.366 0.046

表3表明，当乙醇浓度在0％～10％时，OD₆₀₀有吸光度值，菌株能正常生长。当乙醇浓度 大于10％上升为12％使，OD₆₀₀降低为0.046，说明当乙醇浓度大于10％时，会使菌株的生长 受到限制。本实施例表面本发明菌株的耐乙醇范围为0％～10％。

实施例6酵母菌株温度耐受性试验

接种10％(V/V)酵母菌悬液于YPD液体培养基，分别于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃， 150r/min条件下培养24h，用酶标仪在600nm波长条件下测定培养基的浊度，确定菌体生 长情况。菌株温度耐受性如下表4所示。

表4菌株温度耐受性试验(OD600值)

温度(℃) 25 30 35 40 45 OD₆₀₀值 1.714 1.755 1.624 0.319 0.015

表4表面，当温度在25～40℃时，OD₆₀₀有吸光度值，菌株能正常生长。当温度大于40℃ 达到45℃时，OD₆₀₀降低为0.015，说明当温度大于40℃时，会使菌株的生长受到限制。本 实施例表面能使本发明菌株生长的最高温度为40℃。

实施例7酵母菌株产酯条件的确定

1.最适产酯温度的确定：

灭菌大米培养基(50mL)中接种10％(V/V)酵母菌悬液，分别放于16℃、19℃、22℃、 25℃、28℃、31℃、34℃静置培养4d，将发酵液用于产酯测定。不同温度下菌株的产酯量 如下表5所示。

表5不同温度下菌株的产酯量

温度(℃) 16 19 22 25 28 31 34 产酯量(g/L) 2.61 5.29 6.26 5.23 2.21 1.14 0

通过在16℃、19℃、22℃、25℃、28℃、31℃、34℃不同温度下菌株产酯量的对比可以 看出，菌株在22℃时的产酯量达到最大，所以菌株的最佳产酯温度为22℃。

2.最适产酯pH的确定：

灭菌大米培养基(50mL)加入已灭菌的1mol/L的盐酸或者强氧化钠溶液调节pH，使其 pH分别为2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，并接种10％(V/V)酵母菌悬液，于22℃置培 养4d，将发酵液用于产酯量测定。不同pH值下菌株的产酯量如下表6所示。

表6不同pH值下菌株的产酯量

pH值 2.5 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 产酯量(g/L) 5.60 6.63 4.77 3.95 2.36 1.75

通过在2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0不同pH值下菌株产酯量的对比可以看出，菌株 在pH为3.0时产酯量达到最大，所以菌株的最佳产酯pH为3.0

3.最适的产酯供氧量确定：

灭菌大米培养基(50mL)中接种10％(V/V)酵母菌悬液，在22℃、pH为3.0的条件下， 分别放于0r/min、60r/min、120r/min、180r/min、240r/min条件下摇床培养4d，分 别测定各发酵液产酯情况。菌株在不同供氧量条件下的产酯量如下表7所示。

表7菌株在不同供氧量下的产酯量

供氧量(r/min) 0 60 120 180 240 产酯量(g/L) 7.89 0.25 1.82 6.34 1.40

通过在0r/min、60r/min、120r/min、180r/min、240r/min不同供氧量下菌株产 酯量的对比可以看出，菌株在供氧量为0r/min，即静置条件下的产酯量最好。

从上述产酯温度、PH及供氧量可以看出，当菌株在温度22℃，pH3.0，静置条件下其产 酯量能够达到最好，为最佳产酯条件。

实施例8异常威克汉姆酵母Njsys-HD1在生产中的应用

以生产米酒和制醋酒化阶段所用的酿酒酵母为对照：在大米汁培养基(pH3.0)中分别 接种1％(v/v)的酿酒酵母菌悬液和本发明异常威克汉姆酵母Njsys-HD1菌悬液，放置于 22℃的培养箱，静置培养4d，分别测定发酵的总酯含量。

结果表明异常威克汉姆酵母Njsys-HD1的发酵液与酿酒酵母菌发酵液中的总酯含量分别 为7.89g/L和0.23g/L，本发明异常威克汉姆酵母Njsys-HD1的产酯量能达到常规酿酒酵母 的34.4倍，具有优良的产酯效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原 则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。