一种安水金线鲃脾脏细胞系的构建方法

摘要

本发明涉及一种安水金线鲃脾脏细胞系的构建方法，该构建方法包括如下步骤：1)安水金线鲃脾脏的获取：采用酒精直接对鱼体进行消毒；2)原代培养：采用含有谷氨酰胺、胎牛血清、青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B的L-15培养液进行培养；3)传代培养：传至第8代时，细胞培养液换成基础培养液，所述安水金线鲃脾脏细胞系建立成功。本发明的构建方法所获得的安水金线鲃脾脏细胞系能够连续传代并直接应用于生物学特性研究，不仅能满足对安水金线鲃这一珍稀物种种质资源保存和理论研究的需要，更重要的是该细胞系是中国首个洞穴鱼类的细胞系，为细胞水平的洞穴适应性研究奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用安水金线鲃脾脏组织建立细胞系的方法，属 于淡水水生生物细胞培养和超低温冷冻保存的技术领域。

背景技术

安水金线鲃Sinocyclocheilusanshuiensis(Regan，1904)隶属于鲤 形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)金线鲃属(Sinocyclocheilus)， 是2013年发表的一盲鱼新种，目前，本种已知的分布点仅为广西壮族 自治区凌云县逻楼镇安水村一洞穴，对它的研究也仅见于其分类特征 的描述和分类地位的确认。

因安水金线鲃种群数量较小，且不易获得，因此，如何保护和保 存这一珍稀洞穴鱼类的种质资源成为现今亟待解决的问题。塘养环境 下，安水金线鲃还不能实现性腺的正常发育成熟，实现更进一步的人 工繁殖还存在一定困难，因此，通过保存其精子、卵子、胚胎、个体 等来保存其种质资源的方法已不可行，所以发明人将目光投向了安水 金线鲃的体细胞培养。

鱼类细胞培养起于20世纪60年代，发展至今已建立了280余株细胞 系，中国的鱼类细胞培养历经30多年，只建立了50余株细胞系，建立 细胞系的物种不足中国鱼类总数的1.5％(中国鱼类超过3500种)，由 此可见，细胞系的构建速度是非常缓慢的，关注度不够、参与的工作 者较少可能是其原因之一；其次，相较于哺乳动物细胞培养，鱼类细 胞培养中更易发生污染，导致失败率上升，而现有的专利或文章中大 多将这一现象归结为技术不过关，而嫌少注重鱼体本身的质量问题， 在安水金线鲃细胞培养实践中，鱼体的生活状态也直接影响了细胞系 构建的成败；另外，因安水金线鲃野外生境的局限性，对其生活习性 的了解较少，这也在一定程度上加大了安水金线鲃细胞培养的难度。 因此，安水金线鲃脾脏细胞系的成功构建是建立在长期对安水金线鲃 野生和塘养生态习性了解的基础上，同时，安水金线鲃是中国首个实 现细胞培养的盲鱼，此细胞系也是中国首个盲鱼的细胞系。经文献检 索，未见与本发明的相同报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简便易行的安水金线鲃脾脏细胞系 的构建方法，以满足对安水金线鲃快速核型分析、种质资源保存和洞 穴适应性研究的需要。

具体地，根据本发明的一个方面，提供了一种安水金线鲃脾脏细 胞系的构建方法，该构建方法包括如下步骤：1)安水金线鲃脾脏的获 取：先用80-120ppm的MS-222麻醉安水金线鲃；以75％酒精消毒鱼体后， 取其脾脏，加入HBSS消毒液浸泡脾脏组织；浸泡15-30分钟后，将脾脏 组织用HBSS消毒液清洗3-5次；2)原代培养：将通过1)获得的脾脏组 织剪成约100mm3的组织小块，并将其接种于细胞培养瓶中，在18-24 ℃培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液，在18-24℃培养箱中启 动原代培养，每三天半量更换所述原代培养液，第6-9天细胞开始从组 织块中迁移，20-40天长成细胞单层；3)传代培养：原代脾脏细胞铺满 瓶底80％后开始传代，先吸出培养瓶中的原代培养液，以含0.1-0.2％的 胰蛋白酶的胰酶消化法悬起细胞，细胞变圆后，加入传代培养液1-2ml 以中和胰酶反应，首次传代按1:1传，此后按1:2进行传代，于18-24℃培 养箱中继续培养；每4-6天传代一次，传至第8代时，细胞培养液换成基 础培养液，所述安水金线鲃脾脏细胞系建立成功。

进一步地，所述HBSS消毒液为含有浓度为100-300IU/ml的青霉 素、浓度为100-300μg/ml的链霉素、浓度为20-40μg/ml的庆大霉素以 及浓度为20-40μg/ml的两性霉素B的Hanks平衡盐溶液。

进一步地，所述基础培养液为含有占总体积的10-15％的胎牛血清 和浓度为300-400mg/l的谷氨酰胺的L-15培养液。

进一步地，所述原代培养液为含有占总体积的15-25％的胎牛血清、 浓度为600-800mg/l的谷氨酰胺、浓度为100-200IU/ml的青霉素、浓度 为100-300μg/ml的链霉素、浓度为20-40μg/ml的庆大霉素以及浓度为 20-40μg/ml的两性霉素B的L-15培养液。

进一步地，所述传代培养液为含有占总体积的10-20％的胎牛血清、 浓度为500-600mg/l的谷氨酰胺、浓度为20-40μg/ml的庆大霉素以及浓 度为20-40μg/ml的两性霉素B的L-15培养液。

进一步地，所述原代培养液、所述传代培养液和所述基础培养液 的pH值为7.2-7.4，渗透压为280-360mOsm/l。

进一步地，所述构建方法还包括如下细胞冻存与复苏的步骤：1) 配制细胞冻存液：冻存液包括L-15培养液、胎牛血清和DMSO，按4.5： 4.5：1的体积比混合，现用现配；2)细胞冻存：取对数生长期的细胞， 经上述胰酶消化后，细胞悬液800-1200rpm离心6-10分钟，弃掉上清液； 向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度约为1×106 个/ml，将1ml细胞悬液转移至1.8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温 盒中，-80℃放置24-48小时，然后放入液氮中长期保存；3)细胞复苏： 将上述冻存管从液氮中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化；然 后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量基 础培养液，800-1000rpm离心6-8分钟，除上清液；用基础培养液重悬 细胞，并转移至细胞培养瓶中，18-24℃培养箱中培养，5-9天细胞即长 成单层。

本发明的各步骤中所用的百分比为体积百分比。

本发明的显著效果在于：

1.本发明的构建方法操作简便易行，并且构建方法重复性强，构 建的细胞系稳定性好。

2.相对于用于核型分析的血液短期培养，采用本发明的构建方法 获得的脾脏组织块中刚迁移出来的细胞具有活性，且细胞量大，可用 于染色体分析。

3.与鳍条细胞系相比，用本发明的构建方法获得的脾脏细胞系原 代培养中组织块污染率较低，从而提高了成功率。

4.本发明构建的安水金线鲃脾脏细胞系形态为成纤维样，能够连 续传代并直接应用于生物学特性研究，满足了对安水金线鲃种质资源 保存和理论研究及应用的需要。

5.细胞培养不是独立事件，其需要结合鱼本身的生物学特点，用 本发明的构建方法获得的安水金线鲃脾脏细胞是中国首个盲鱼的细胞 系，为研究洞穴鱼类对洞穴环境的适应性提供了很好的素材，奠定了 洞穴适应性研究的基础。

附图说明

图1是示出不同消毒方式对安水金线鲃脾脏组织块细胞迁移的影 响的图。

图2是示出不同培养液对安水金线鲃脾脏细胞生长的影响的图。

具体实施方式

从下文的详细描述中，本发明的上述方面和本发明的其他方面将 是明显的。

实施例1

1.制备HBSS消毒液和细胞培养液

HBSS消毒液：向HBSS中加入抗生素，使青霉素的浓度为200 IU/ml，链霉素浓度为200μg/ml，庆大霉素的浓度为30μg/ml，两性霉 素B浓度为30μg/ml。

基础培养液：向L-15培养液中加入谷氨酰胺和胎牛血清，使谷氨 酰胺的浓度为360mg/L，胎牛血清占总体积的15％。

原代培养液：向L-15培养液中加入谷氨酰胺、胎牛血清和抗生素， 使谷氨酰胺的浓度为700mg/L，胎牛血清占总体积的20％，青霉素的浓 度为150IU/ml，链霉素浓度为150μg/ml，庆大霉素的浓度为30μg/ml， 两性霉素B浓度为30μg/ml。

传代培养液：向L-15培养液中加入谷氨酰胺、胎牛血清和抗生素， 使谷氨酰胺的浓度为600mg/L，胎牛血清占总体积的20％，庆大霉素的 浓度为20μg/ml，两性霉素B浓度为20μg/ml。

调节上述培养液的pH值为7.2，渗透压为300mOsm/l，放置于4℃ 冰箱中保存备用。

2.原代培养

先用100ppm的MS-222麻醉安水金线鲃；再以75％酒精消毒鱼体 后，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其脾脏，置于12孔板中， 加入HBSS消毒液浸泡脾脏组织。浸泡30分钟后，将脾脏组织用HBSS 消毒液清洗4次，剪成组织小块，并将其接种于25cm²细胞培养瓶中， 在20℃培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液4ml，在22℃培养箱 中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第6天细胞开始从组织块中 迁移，30天长成细胞单层。

3.传代培养

原代脾脏细胞铺满瓶底80％后开始传代。传代培养具体方法如下： 先吸出培养瓶中的原代培养液，加入0.1％的胰蛋白酶-EDTA溶液1.5 ml，消化2分钟，细胞变圆后，加入传代培养液2ml以中和胰酶反应， 轻轻吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按1:1传，此后按1:2进行传 代，于22℃培养箱中继续培养；每5天传代一次，传至第8代时，细胞 培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功。目前，细胞传代已 传至40代。

4.细胞冻存与复苏

(a)配制细胞冻存保护液：冻存液包括L-15培养液、胎牛血清和 DMSO，按4.5：4.5：1的体积比混合，现用现配。

(b)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬 液1000rpm离心8分钟，弃掉上清液。向细胞沉淀中加入配制的细胞冻 存液，重悬，使细胞的浓度约为1×10⁶个/ml，将1ml细胞悬液转移至 1.8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80℃放置24小时，然后 放入液氮中长期保存。

(c)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37℃水浴锅中快 速摇晃至融化。然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管 中，并加入等量基础培养液，800rpm离心8分钟，除上清液。用基础培 养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，22℃培养箱中培养，7天细胞 即长成单层。

实施例2

1.制备HBSS消毒液和细胞培养液

HBSS消毒液：向HBSS中加入抗生素，使青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素浓度为100μg/ml，庆大霉素的浓度为40μg/ml，两性霉 素B浓度为40μg/ml。

基础培养液：向L-15培养液中加入谷氨酰胺和胎牛血清，使谷氨 酰胺的浓度为400mg/L，胎牛血清占总体积的15％。

原代培养液：向L-15培养液中加入谷氨酰胺、胎牛血清和抗生素， 使谷氨酰胺的浓度为600mg/L，胎牛血清占总体积的20％，青霉素的浓 度为100IU/ml，链霉素浓度为100μg/ml，庆大霉素的浓度为40μg/ml， 两性霉素B浓度为40μg/ml。

传代培养液：向L-15培养液中加入谷氨酰胺、胎牛血清和抗生素， 使谷氨酰胺的浓度为500mg/L，胎牛血清占总体积的20％，庆大霉素的 浓度为30μg/ml，两性霉素B浓度为30μg/ml。

调节上述培养液的pH值为7.4，渗透压为320mOsm/L，放置于4℃ 冰箱中保存备用。

由于安水金线鲃是洞穴鱼类，免疫力较低，因此，在安水金线鲃 的细胞培养的各个阶段的培养液中加入了谷氨酰胺，以提高其免疫力 降低组织块的污染率。

2.原代培养

先用80ppm的MS-222麻醉安水金线鲃；再以75％酒精消毒鱼体后， 置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其脾脏，置于12孔板中，加入 HBSS消毒液浸泡脾脏组织。浸泡30分钟后，将脾脏组织用HBSS消毒 液清洗3次，剪成组织小块，并将其接种于25cm²细胞培养瓶中，在20 ℃培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液5ml，在20℃培养箱中启 动原代培养，每三天半量更换培养液，第7天细胞开始从组织块中迁移， 30天长成细胞单层。

3.传代培养

原代脾脏细胞铺满瓶底80％后开始传代。传代培养具体方法如下： 先吸出培养瓶中的原代培养液，加入0.2％的胰蛋白酶-EDTA溶液1ml， 消化2分钟，细胞变圆后，加入传代培养液2ml以中和胰酶反应，轻轻 吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按1:1传，此后按1:2进行传代， 于20℃培养箱中继续培养；每5天传代一次，传至第8代时，细胞培养 液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功。目前，细胞传代已传至 40代。

4.细胞冻存与复苏

(a)配制细胞冻存保护液：冻存液包括L-15培养液、胎牛血清和 DMSO，按4.5：4.5：1的体积比混合，现用现配。

(b)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬 液800rpm离心10分钟，弃掉上清液。向细胞沉淀中加入配制的细胞冻 存液，重悬，使细胞的浓度约为1×10⁶个/ml，将1ml细胞悬液转移至 1.8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80℃放置24小时，然后 放入液氮中长期保存。

(c)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37℃水浴锅中快 速摇晃至融化。然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管 中，并加入等量基础培养液，800rpm离心8分钟，除上清液。用基础培 养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，20℃培养箱中培养，8天细胞 即长成单层。

实施例3

1.制备HBSS消毒液和细胞培养液

HBSS消毒液：向HBSS中加入抗生素，使青霉素的浓度为300 IU/ml，链霉素浓度为300μg/ml，庆大霉素的浓度为20μg/ml，两性霉 素B浓度为20μg/ml。

基础培养液：向L-15培养液中加入谷氨酰胺和胎牛血清，使谷氨 酰胺的浓度为300mg/L，胎牛血清占总体积的10％。

原代培养液：向L-15培养液中加入谷氨酰胺、胎牛血清和抗生素， 使谷氨酰胺的浓度为600mg/L，胎牛血清占总体积的15％，青霉素的浓 度为200IU/ml，链霉素浓度为200μg/ml，庆大霉素的浓度为30μg/ml， 两性霉素B浓度为30μg/ml。

传代培养液：向L-15培养液中加入谷氨酰胺、胎牛血清和抗生素， 使谷氨酰胺的浓度为500mg/L，胎牛血清占总体积的10％，庆大霉素的 浓度为20μg/ml，两性霉素B浓度为20μg/ml。

调节上述培养液的pH值为7.4，渗透压为300mOsm/L，放置于4℃ 冰箱中保存备用。

2.原代培养

先用120ppm的MS-222麻醉安水金线鲃；再以75％酒精消毒鱼体 后，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其脾脏，置于12孔板中， 加入HBSS消毒液浸泡脾脏组织。浸泡20分钟后，将脾脏组织用HBSS 消毒液清洗3次，剪成组织小块，并将其接种于25cm²细胞培养瓶中， 在18℃培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液5ml，在18℃培养箱 中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第7天细胞开始从组织块中 迁移，40天长成细胞单层。

3.传代培养

原代脾脏细胞铺满瓶底80％后开始传代。传代培养具体方法如下： 先吸出培养瓶中的原代培养液，加入0.2％的胰蛋白酶-EDTA溶液1ml， 消化2分钟，细胞变圆后，加入传代培养液2ml以中和胰酶反应，轻轻 吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按1:1传，此后按1:2进行传代， 于18℃培养箱中继续培养；每7天传代一次，传至第8代时，细胞培养 液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功。目前，细胞传代已传至 40代。

4.细胞冻存与复苏

(a)配制细胞冻存保护液：冻存液包括L-15培养液、胎牛血清和 DMSO，按4.5：4.5：1的体积比混合，现用现配。

(b)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬 液1200rpm离心6分钟，弃掉上清液。向细胞沉淀中加入配制的细胞冻 存液，重悬，使细胞的浓度约为1×10⁶个/ml，将1ml细胞悬液转移至 1.8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80℃放置48小时，然后 放入液氮中长期保存。

(c)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37℃水浴锅中快 速摇晃至融化。然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管 中，并加入等量基础培养液，1000rpm离心6分钟，除上清液。用基础 培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，18℃培养箱中培养，9天细 胞即长成单层。

实施例4

对实施例1的安睡金线鲃的鱼体采用不同消毒方法进行比较。

将实施例1中的安水金线鲃分别采用最常见的高锰酸钾浸泡消毒、 亚甲基蓝浸泡消毒和酒精直接消毒，其他步骤与实施例1中的步骤相 同。结果显示(参见图1)，在整个原代培养过程中，高猛酸钾和亚甲 基蓝浸泡消毒都表现出较低的组织块细胞迁移率，且随着培养天数的 增加，某些迁移出细胞的组织块会脱落而不会再重新贴壁迁移出细胞； 在不发生污染的情况下，酒精直接消毒可获得较高的组织块细胞迁移 率，且随着培养天数的增加，脾脏组织块基本都能迁移出细胞，且脱 落的组织块较少。

对于安水金线鲃而言，高猛酸钾和亚甲基蓝的毒性较大，这可能 与其体表无鳞，消毒液更易进入体内有关，在降低污染率的同时也影 响了组织块细胞的迁出，因此，对于以安水金线鲃为代表的洞穴鱼类， 酒精直接消毒是更为合适的消毒方式。

实施例5

对实施例1的细胞培养液的基液采用不同的培养液进行比较。

将实施例1中的培养液替换成鱼类细胞培养常用的几种培养液 DMEM、DMEM(高糖)、DMEM/F12、L-15、M199、M1640，对比 这些不同培养液对安水金线鲃脾脏细胞生长的影响(参见图2)。结果 显示，不同培养液条件下，细胞的生长速率不同，贴壁率也不同。细 胞培养一天后，L-15和DMEM/F12的贴壁细胞较多，其次是DMEM和 DMEM(高糖)，而M199和M1640培养液贴壁的细胞最少；随着培养 时间的增加，各种培养液条件下，细胞数量都有不同程度的增加，其 中，L-15和DMEM/F12培养液细胞的生长速率最快，DMEM和DMEM 次之，而M199和M1640的细胞生长速率最慢，细胞数量无明显增加， L-15培养液下的细胞数量约为DMEM和DMEM(高糖)细胞数量的两 倍，M199和M1640细胞数量的六倍。因此，对于安水金线鲃脾脏细胞 而言，L-15的效果最好，其次是DMEM/F12，其他四种培养液并不适合 细胞生长。

安水金线鲃属于洞穴鱼类，在本发明的实施例中的细胞培养过程 中，原代培养液和传代培养液中都加入了庆大霉素。庆大霉素属于氨 基糖苷抗生素，主要作用于革兰氏阴性菌，它与硫酸链霉素的抗菌谱 相似，只是安水金线鲃的脾脏细胞对庆大霉素更为敏感(参见表1)。

表1庆大霉素和硫酸链霉素对安水金线鲃组织块细胞迁出的影响

本领域的技术人员应当明了，尽管为了举例说明的目的，本文描 述了本发明的具体实施方式，但可以对其进行各种修改而不偏离本发 明的精神和范围。因此，本发明的具体实施方式和实施例不应当视为 限制本发明的范围。本发明仅受所附权利要求的限制。本申请中引用 的所有文献均完整地并入本文作为参考。