一种含黑色素的体外皮肤测试模型及其制备方法

摘要

本发明公开了一种含黑色素的体外测试皮肤模型和制备方法及其用途。该测试模型包含真皮层和表皮层，其中所述表皮层为表皮细胞和黑色素细胞构成，真皮层为成纤维细胞及其分泌的细胞外基质形成的膜片。此皮肤模型与人体皮肤结构非常相似，构建过程模拟皮肤发育的过程，在真皮层的滋养下进行表皮层的生发并可促进黑色素的合成、分泌、转运等。本发明公开了所述皮肤模型的制备方法及其用于各种化妆品、保健品、药品的美白祛斑功效检测及相关机制探索研究等。

说明书

技术领域

本发明属于组织工程学生物材料领域，具体涉及一种含黑色素的体外皮肤测试模型及其制备方法。

背景技术

化妆品、药品、化学品等产品上市前都要进行大量的测试以保障产品的安全性与功效性。传统的检测一般通过动物实验进行，但由于动物实验的偏差性及3R理论的提出，促使研究者努力寻找更合适的检测的方法。目前已基于组织工程原理构建出多种皮肤模型，用于替代动物模型来研究皮肤的不同生物学功能，以及皮肤对化妆品或药物制剂的反应。良好的皮肤模型应具有与人类皮肤检测结果的高度一致性。

在化妆品的安全性及功能效果检测中，皮肤模型的应用已经被人们所接受。比如，EpiDerm (MatTek Corporation)和EPISKIN (EPISKIN SNC)已经完成正式的体外皮肤刺激性检测验证，并纳入OECD TG 439指南。

含祛斑美白成分的化妆品、药物目前深受广大消费者的欢迎。而这些产品在使用于人体前，需要对其祛斑、美白功效加以验证。目前美白原料及化妆品功效验证方法较多采用的是动物模型如豚鼠进行验证，但动物实验与人体结果会出现一定的偏差，而且在欧盟对化妆品的管理条例中，将逐渐取消动物实验。利用人工皮肤模型检测是目前化妆品、药物检测是目前检测的一大方向，但是目前还未有被认可的皮肤模型用于祛斑美白功效的检测。

专利200910138703.X公开了一种采用胶原、层粘连蛋白、成纤维细胞制备的支架结构即真皮层，然后接种角质形成细胞、黑色素细胞，并通过体外培养制备出功能性色素等同物。这种方法所制备的皮肤模型可包含真皮层和表皮层。但是这种皮肤模型含有的真皮层中的细胞外基质主要来源于动物，后期培养中这些胶原会有较快的降解，易发生结构收缩，从而导致整体模型的损坏，难以应用于长期稳定的检测中。

专利201019018002.2中采用生物可降解材料支撑膜模拟真皮层，表皮层利用角质形成细胞、黑色素细胞共同接种，构建的含黑色素细胞的皮肤模型。此种含黑色素细胞的皮肤只含有表皮层。

专利201410045511.5中构建的含黑色素皮肤模型，其真皮层以凝固的胶原为主要材料，在其上单次接种了成纤维细胞、黑色素细胞及表皮细胞，构建含黑色素的皮肤模型，但其在接表皮细胞前未有真皮层细胞外基质的沉积，并未对黑色素模型的后期稳定性做一定的研究。

从以上的分析中可以看出，虽然现在已有相关的黑色素模型被开发，但是这些模型的基底层主要来源于外源的细胞外基质或惰性载体，这样的基底层不能很好地模拟天然皮肤的基底层结构，因此在后期升发过程中存在一定的局限性，最终导致了黑色素模型后期培养的稳定性较差。结合目前人们对药物及化妆品的长期功效具有较高的要求。因此，建立具有高稳定性的黑色素皮肤模型具有较好的市场与前景。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种含黑色素的体外皮肤测试模型和制备方法及其应用，所制备的含黑色素的皮肤测试的模型机械性能良好，后期培养稳定性好，真表皮连接紧密，表皮层结构分化结构良好，可用于各种药物及化妆品的祛斑美白功效的体外长期检测 。

本发明所提供的黑色素的体外皮肤测试模型的特征在于：其包括含有活性成纤维细胞及细胞外基质的真皮层及含有黑色素细胞和表皮细胞的表皮层； 所述的含有活性成纤维细胞及细胞外基质的真皮层是由6～10层成纤维细胞及成纤维细胞自身分泌的细胞外基质；所述表皮层包含：由黑色素细胞和角质细胞所形成的基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层；所述黑色素的体外皮肤测试模型的真皮层中成纤维细胞有数层排列，表皮层中含有基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层，与天然皮肤结构有高度一致性，且在UV（紫外光）照射下，有黑色素产生，具有与正常皮肤高度一致的生物学反应。

本发明含黑色素的体外皮肤测试模型的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、真皮层的构建：

选择具有微孔结构的聚酯纤维素膜为支撑膜的Transwell小室进行皮肤模型的构建，先于小室底部包被浓度为0.005~0.02g/ml的明胶溶液或Matrigel（基质胶）之一，用以粘附及滋养成纤维细胞。成纤维细胞的接种密度为2×10⁵/cm²，采用SK1液体（DMEM/F12培养基，>3，0.3~3mg/ml；胰岛素，0.5~5ng/ml；胎牛血清，10%(v/v)；硫酸软骨素，0.1~0.6>4），10~37.5>4，5~25>

真皮层的构建中采用多次接种成复层膜片技术形成细胞与细胞外基质均匀分布的多层真皮层结构，同时添加维生素C和蔗聚糖以促进成纤维细胞分泌细胞外基质形成与天然皮肤真皮层类似的结构，实现成纤维细胞分泌的细胞外基质累积及成纤维细胞的均匀分布，可促进后期真皮层的长期存活。

步骤二、表皮层的构建：

将角质形成细胞与黑色素细胞采用SK2培养液重悬成混合细胞悬液。表皮层的构建中黑色素细胞和角质形成细胞的接种比例在1:5~1:30之间，接种的细胞密度为2.5×10⁶/cm²，加入培养液SK2（DMEM/F12培养基，>3，0.3~3mg/ml；胰岛素，0.5~5ng/ml；胎牛血清，10%(v/v)；硫酸软骨素，0.1~0.6>

表皮层的构建建立于含有活性细胞的真皮层并进行浸没式培养，这样的培养方式类似于皮肤天然生发的微环境，可使表皮层在细胞-细胞、细胞-细胞外基质、细胞分泌因子-细胞的作用下进行增殖分化发育生长并进一步成熟，并在培养液中加入蔗聚糖促进真皮层和表皮层之间的连接结构的形成，可提高模型的稳定性。

步骤三、体外测试皮肤模型的体外培养：

将步骤二中液下培养后的体外测试皮肤模型置于气液面培养支架上，加入培养液SK2进行气液面培养，使液面与皮肤模型表面平齐，每天更换新鲜的培养液SK2；培养2~3天后，这样叙述合理吗更换培养液SK3（DMEM/F12，>3，0.2~2mg/ml；胰岛素，0.4~4ng/ml；胎牛血清，10%(v/v)；硫酸软骨素，0.05~0.5mg/ ml； 甲状腺素，0.001~0.005mg/ ml、腺嘌呤，5~20μg /ml；碱性成纤维细胞生长因子，0.1~0.5ng/ml；维生素C ，40~80μg/ml； 表皮生长因子，0.2~0.4ng/ml；氯化钙，50~80μg/ml）进行气液面培养，培养2~3天，每天换液；；更换培养液SK4（DMEM/F12，>3，0.3~3mg/ml；胰岛素，0.5~5ng/ml；胎牛血清，10%(v/v)；硫酸软骨素，0.1~0.6>

所形成的皮肤测试模型后期培养稳定性好，其真皮层、表皮层之间结合紧密，真皮层含有成纤维细胞和细胞外基质，表皮层层次清晰，含有基底层、棘层、颗粒层、角质层。

本发明制备的含黑色素的皮肤测试模型，其结构与天然的皮肤结构非常接近，主要含有真皮层和表皮层，真皮层通过多层细胞膜片技术并添加维生素C和蔗聚糖进行培养，形成具有体外培养稳定性的真皮层结构，培养后期在表皮层的生发和成熟过程中，含有成纤维细胞和大量细胞外基质的真皮结构可以通过细胞-细胞，细胞外基质-细胞，细胞因子-细胞的作用支持表皮层形成类似于天然皮肤的分层结构，培养液中添加的蔗聚糖能够促进真表皮连接处的IV型胶原、VII型胶原、laminin中文的表达，从而促进真表皮连接区的成熟，为表皮层结构的形成及成熟，黑色素细胞活性及功能的发挥提供良好的微环境。所制备的含黑色素的皮肤测试的模型机械性能良好，后期培养稳定性好，真表皮连接紧密，表皮层结构分化结构良好，且其中含有黑色素细胞，可发挥黑色素细胞的基本生理功能如黑色素的合成、分泌、转运等。因此，此种方法所构建的含黑色素的皮肤测试的模型，可用于各种药物及化妆品的祛斑美白功效的体外长期检测。

与现有的产品相比，本发明所制备的含黑色素的皮肤测试模型具有以下优点。

1、本发明所制备的含黑色素的皮肤测试的模型可应用于各种美白化妆品原料、药物的体外美白功效的检测，该模型不但可以用于产品在预防黑色素形成方面的作用同时可进行产品的祛除黑色素的检测。

2、本发明所制备的含黑色素的皮肤测试的模型。具有与天然的皮肤结构非常接近的细胞的分布及结构特征，其结构主要包含真皮层与表皮层，真皮层包含成纤维细胞与细胞分泌积累的大量的细胞外基质，表皮层含有角质形成细胞和黑色素细胞。体外培养构建的真皮层中的细胞外基质不易在体外降解，且其中的成纤维细胞也可分泌足够的细胞外基质，这样的真皮层可在表皮层形成过程中可起到滋养、支持作用，促进黑色素细胞生理功能的发挥及分化，如黑色素合成、转运，并支持可长期支持表皮层的功能。

3、本发明所制备的含黑色素的皮肤测试的模型中以醋酸纤维膜为支架，真皮层采用多次接种细胞膜片技术构建含有成纤维细胞及分泌的细胞外基质的真皮层，并添加促真表皮间连接蛋白成熟的因子，促使真表皮间连接紧密，提高黑色素皮肤模型的稳定性，使其能够进行美白化妆品原料化妆品或药物的预防及祛除黑色素的体外检测，且可用于体外长期检测。

附图说明

图1是原代培养后传代培养第3代的黑素色细胞的镜下形态照片；图片中显示的黑色素细胞具有较好的细胞状态，黑色素细胞胞核透光性好，细胞树突分支较少（树突量<3个）。

图2 是黑色素细胞进行硫酸亚铁吸收法染色结果的照片；其结果显示黑色素细胞中有黑色素颗粒形成，说明此种方法所培养的黑色素细胞具有生成黑色素的生物学功能。

图3是含黑色素的体外皮肤测试模型的外观照，a,b排——为UVB照射后的皮肤模型，c排——为正常构建的体外皮肤测试模型。a,b结果表明含黑色素的体外皮肤测试模型在UVB照射下，其表皮层成熟的黑色素细胞可产生大量的黑色素，以抵抗紫外线对其的损伤，具有与正常皮肤类似的生理功能。

图4 是采用多次接种方法构建的含黑色素细胞的体外测试皮肤模型的HE染色结果。其结果显示：此种方法所构建的真皮层，包含多层成纤维细胞及成纤维细胞可分泌大量的细胞外基质，成纤维细胞均匀分布于细胞外基质中，其结构及细胞外基质成分与天然的皮肤类似，所构建的黑色素的体外皮肤测试的模型的表皮层是包含基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层结构的结构层次分明的表皮层结构。

图5是含黑色素的体外皮肤测试的模型中表皮层结构的S-100免疫组织化学染色结果。其结果显示：黑色素细胞处于体外皮肤测试模型的底层，接近于天然皮肤结构中表皮结构中黑色素细胞的定位。

图6是含黑色素的体外皮肤测试的模型中表皮层中所生成黑色素的硫酸亚铁吸收法染色的结果。其结果显示：含黑色素的体外皮肤测试的模型的黑色素细胞在紫外照射下可生成大量的黑色素，并可从底层的黑色素细胞转运至测试模型的角质层中，说明构建的含黑色素的体外皮肤测试的模型具有在紫外刺激下分泌转运黑色素，以抵抗外界损伤的生理功能。

图7 是含黑色素的体外测试皮肤模型的体外长期培养中的稳定性比较。a、b图为含胶原真皮层的含黑色素皮肤模型分别培养2周，8周的HE染色结果；c、d图为多次膜片接种的含黑色素皮肤模型分别培养1周，2周的HE染色结果；其结果显示：含胶原的体外皮肤测试模型随着体外培养时间的延长，其表皮结构中基底层缺失，表皮结构层次不清晰，真皮层中成纤维细胞数量减少，形态变圆，真皮层厚度减小。本发明中构建的体外皮肤模型随着体外培养时间的延长在表皮层及真皮层变化细胞活性及结构无明显的变化。

图8是含黑色素的体外皮肤模型在后期黑素含量检测的结果。其结果显示：所构建的含黑色素的体外皮肤模型经过UVB的暴露后会生成黑色素，并且黑色素生成量与UVB照射剂量在一定范围内具有正相关的关系。因此可证明该含黑色素的体外皮肤模型在黑色素的生成、转运方面具有与正常皮肤类似的生理功能。

图9是采用含黑色素的体外测试模型进行美白功效检测的表观结果。Control组为不进行UVB照射的结果，UVB组为每天采用UVB照射(剂量为50mJ/cm²))，UVB+化合物组为每天采用UVB照射(剂量为50mJ/cm²))并在培养液中加入功效性原料进行功效验证，a排——为气液面0d的皮肤模型，b排——为气液面3d的皮肤模型,c排——为气液面6d的皮肤模型,d排——为气液面9d的皮肤模型。其结果显示：含黑色素的体外皮肤模型在受到外界刺激后会产生黑色素的形成，化合物的加入可抑制外界刺激后黑色素的形成。

图10是采用含黑色素的体外测试模型进行美白功效检测的黑色含量检测结果。Control组为不进行UVB照射的结果，UVB组为每天采用UVB照射(剂量为50mJ/ cm²))，UVB+化合物组为每天采用UVB照射(剂量为50mJ/cm²))并在培养液中加入功效性原料进行功效验证，其结果与表观结果较吻合显示：含黑色素的体外皮肤模型在受到外界刺激后会产生黑色素的形成，化合物的加入可抑制外界刺激后黑色素的形成。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明内容做进一步详细说明。

实施例1>一种含黑色素的体外皮肤测试模型及制备方法

所制备的皮肤测试模型主要包括真皮层和表皮层，以带有微孔的聚酯纤维素膜作为支撑膜，包含：含有多层活性成纤维细胞及分泌的细胞外基质的真皮层及含黑色素细胞的表皮层构建而成。

本实施例之皮肤测试模型的制备方法，以下述步骤如下：

一、构建中所用细胞的获取构建中所用细胞的获取

1. 原代黑色素细胞的获取及传代培养：黑色素细胞可来源于包皮环切术的正常皮肤组织，其获取及传代详见刘源的《构建含黑色素细胞组织工程皮肤的研究》（结果见附图1、2、3）；

2.角质形成细胞的获取及传代培养：角质形成细胞可来源于包皮环切术的正常皮肤组织，其获取及传代详见马英智的《人表皮干细胞的分离、纯化培养及鉴定》；

3.成纤维细胞的获取及传代：成纤维细胞可来源于包皮环切术的正常皮肤组织，其获取及传代详见马英智的《人真皮成纤维细胞的分离培养及鉴定》；

二、含黑色素的皮肤替代测试模型真皮层的构建

选择微孔直径为0.4μm的聚酯纤维素膜为支撑膜的Transwell小室（NUNC公司生产的24孔板型）进行皮肤模型的构建，先于小室底部加入200ul明胶溶液（浓度为10g/ml), 置37℃条件下孵育30min, 然后弃掉小室内的明胶溶液。采用SK1液（DMEM/F12，NaHCO₃，3mg/ml；胰岛素，5ng/ml；胎牛血清，10%(v/v)；硫酸软骨素，>6 /ml的细胞悬液，接种密度为2×10⁵/cm²成纤维细胞。置37℃细胞培养箱内培养36小时以促进其形成成纤维细胞膜。然后重复上述步骤5次，最后形成真皮层结构。

三、含黑色素的皮肤替代测试模型表皮层的构建

将步骤一中体外培养的8代的角质形成细胞与5代黑色素细胞采用SK2培养液（DMEM/F12，NaHCO₃，3mg/ml；胰岛素，5ng/ml；胎牛血清，10%(v/v)；硫酸软骨素，0.6>6/cm²，加入培养液SK2进行浸没式培养2天，每天换液，形成含黑色素细胞的表皮层结构。

四、含黑色素的皮肤替代测试模型表皮层的气液面培养

将步骤四中中未成熟的表皮结构的体外测试皮肤模型置于培养器皿内的培养支架表面，加入培养液SK2进行气液面培养，培养3天，每天换液；更换培养液SK3（DMEM/F12，NaHCO₃，3mg/ml；胰岛素，5ng/ml；胎牛血清，10%(v/v)；硫酸软骨素，0.6>3，3mg/ml；胰岛素，5ng/ml；胎牛血清，10%(v/v)；硫酸软骨素，0.6>

五、含黑色素的皮肤替代测试模型的后期鉴定

所构建的含黑色素的皮肤测试模型进行多聚甲醛溶液固定，包埋，脱水，切片，行HE染色，观察其结构。并进行S-100免疫组织化学染色观察黑色素细胞在皮肤替代测试模型中的分布（见附图5）及硫酸亚铁吸收法染色观察在皮肤替代测试模型中黑色素的形成及定位（见附图6），及其体外稳定性检测（见附图7）。

实施例2　　一种含黑色素的体外皮肤测试模型及制备方法

本实施例之皮肤测试模型与实施例2相似。其制备方法步骤如下：

一、构建中所用细胞的获取

1. 原代黑色素细胞的获取及传代培养：黑色素细胞可来源于包皮环切术的正常皮肤组织，其获取及传代详见刘源的《构建含黑色素细胞组织工程皮肤的研究》（结果见附图1、2、3）；

2.角质形成细胞的获取及传代培养：角质形成细胞可来源于包皮环切术的正常皮肤组织，其获取及传代详见马英智的《人表皮干细胞的分离、纯化培养及鉴定》；

3.成纤维细胞的获取及传代：成纤维细胞可来源于包皮环切术的正常皮肤组织，其获取及传代详见马英智的《人真皮成纤维细胞的分离培养及鉴定》；

二、含黑色素的皮肤替代测试模型真皮层的构建

选择微孔直径为0.4μm的聚酯纤维素膜为支撑膜的Transwell小室（NUNC公司生产的24孔板型）进行皮肤模型的构建，采用 Matrigel™ Basement Membrane Matirx 基质胶（BD公司生产）进行Transwell小室底部的包被。Matrigel基质胶冻融后，用预冷的移液枪头混匀Matrigel基质成匀浆状。采用无血清DF/12培养基以1:3的比例稀释Matrigel基质。将稀释的Matrigel基质200ul加入小室底部，室温下孵育1小时。去除未结合的Matrigel，用无血清DF/12培养基轻轻地冲洗。采用SK1液（DMEM/F12，NaHCO₃，0.3mg/ml；胰岛素，0.5ng/ml；胎牛血清，10%(v/v)；硫酸软骨素，0.1mg/>6 /ml的细胞悬液，接种密度为2×10⁵/cm²成纤维细胞。置37℃细胞培养箱内培养30h以促进其形成成纤维细胞膜。然后重复上述步骤3次，最后形成真皮层结构。>

三、含黑色素色的皮肤替代测试模型表皮层的构建

将步骤一中体外培养的7代的角质形成细胞与3代黑色素细胞采用SK2培养液重悬成混合细胞悬液。其中表皮层的构建中黑色素细胞与角质形成细胞的接种比例为1:15，接种的细胞密度为5×10⁶/cm²，加入培养液SK2（DMEM/F12，>3， 3mg/ml；胰岛素，5ng/ml；胎牛血清，10%(v/v)；硫酸软骨素，0.6 mg/ ml；甲状腺素，0.005mg/ ml、腺嘌呤，24μg /ml；碱性成纤维细胞生长因子，1ng/ml；维生素C ，100μg/ml；Ficoll 70，37.5 mg/ ml；Ficoll 400，25 mg/ ml）进行浸没式培养2天，每天换液，形成含黑色素细胞的表皮层结构。>

四、含黑色素的皮肤替代测试模型表皮层的气液面培养

将步骤四中中未成熟的表皮结构的体外测试皮肤模型置于培养器皿内的培养支架表面，加入培养液SK2进行气液面培养，培养2天，每天换液；更换培养液SK3（DMEM/F12，>3，3mg/ml；胰岛素，5ng/ml；胎牛血清，10%(v/v)；硫酸软骨素，0.6 mg/ ml； 甲状腺素，0.005mg/ ml、腺嘌呤，24μg /ml；碱性成纤维细胞生长因子，1ng/ml；维生素C ，100μg/ml； Ficoll 70，37.5 mg/ ml；Ficoll 400，25 mg/ ml；表皮生长因子，0.5ng/ml；氯化钙，80μg/ml）进行气液面培养，培养2天，每天换液；更换培养液SK3使液面与皮肤表面平齐，培养2天，每天换液；更换培养液SK4（DMEM/F12，>3，3mg/ml；胰岛素，5ng/ml；胎牛血清，10%(v/v)；硫酸软骨素，0.6>

五、含黑色素的皮肤替代测试模型的后期鉴定

所构建的含黑色素的皮肤测试模型进行多聚甲醛溶液固定，包埋，脱水，切片，行HE染色，观察其结构。并进行S-100免疫组织化学染色观察黑色素细胞在皮肤替代测试模型中的分布（见附图5）及硫酸亚铁吸收法染色观察在皮肤替代测试模型中黑色素的形成及定位（见附图6），及其体外稳定性检测（见附图7）。黑色素模型构建完成后，进行UVB暴露（50mJ/cm²），然后进行采用NAOH提取法(见徐宝军《天然产物增白作用的初步筛选》)进行黑色素的提取，并用Elisa法检测黑色素含量的变化趋势，观察黑色素模型后期的反应情况（见附图8）。

六、含黑色素的皮肤替代测试模型的功效检测

采用前期构建的含黑色素的皮肤替代测试模型进行功效检测，如上所述含色黑色素的皮肤模型的构建过程，待气液面时加入待测的美白产品，并每天进行UVB照射，以促进黑色素的形成，重复此操作至培养完成时，并在培养的不同阶段拍照并观察模型的外观情况（如图9所示），待培养完成后收集样品进行黑色素的提取，并用Elisa法检测黑色素含量的变化。>

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