一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法

摘要

本发明公开了一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法。其是将海洋生物加入裂解液与蛋白酶抑制剂后进行匀浆，离心，取上清液和沉淀物；将沉淀物进行低温破碎、超高速低温离心获取蛋白质提取液；再将蛋白质提取液进行两次丙酮沉淀，对蛋白质组样品纯化，再经还原、烷基化，从海洋生物组织中获得种类全面、浓度及纯度均较高的蛋白质组学样品。本发明工艺合理，操作可靠，制备科学，应用范围广，在对蛋白质带来极小破坏的情况下最大限度回收蛋白质组，并且对基于同位素标记绝对定量的鸟枪法蛋白质组液相色谱串联质谱测定进行了特别优化，对开展海洋蛋白质组学的相关研究具有较大意义。

说明书

技术领域

本发明涉及借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料，尤其是一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法。

背景技术

蛋白质组学是在90年代初期，由MarcWikins和学者们首先提出的新名词，本质上指的是是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。更重要的是，基因组是相当稳定的实体，而蛋白质组通过与基因组的相互作用而不断发生着改变。一个生命体在其机体的不同部分以及生命周期的不同阶段，其蛋白表达可能存在巨大的差异。一个生命体在其整个生命周期中所拥有的蛋白质的全体，或者在更小的规模上，特定类型的细胞在经历特定类型刺激时所拥有的蛋白质的全体，分别被称为这个生命体或细胞类型的蛋白质组。随着人类基因组草图的完成，现在许多学者开始探索基因与蛋白质如何通过相互作用来形成其它蛋白质。

现有蛋白质组学研究大多数是对陆地生物进行的，少有海洋生物的研究报道。而海洋生物由于其特殊的生存环境，蛋白质的复杂性和耐受性与陆地生物不同，导致目前使用蛋白质组学研究的通用处理办法在对海洋生物进行蛋白质组学研究过程中，通常伴随着蛋白质组的变性，活性丧失和蛋白回收率低下。因此，研发一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作可靠、制备科学、蛋白质破坏小及回收率高的用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：

(1)样品预处理：取海洋生物于离心管中，加入裂解液，料液比1︰2～5(m/v)，加入蛋白酶抑制剂使其终浓度为0.5～1.2mM，用组织匀浆器充分打散后，离心，取上清液和沉淀物，上清液即为组织可溶性全蛋白溶液；

(2)膜蛋白提取：将步骤（1）中得到的沉淀物采用Tris-Hcl缓冲液重悬，重悬液进行低温破碎，离心，收集上清液,得到组织细胞膜蛋白的提取液；

(3)丙酮沉淀：将步骤（1）、步骤(2)中得到的上清液合并，然后在合并的上清液中加入其体积4～6倍的预冷丙酮溶液，震荡混合，-20℃条件下沉淀2～4h，离心，收集沉淀；

(4)二次丙酮沉淀：将步骤(3)中得到的沉淀中加入其体积3～5倍的预冷丙酮溶液，震荡混合，-20℃条件下沉淀1～2h，离心，收集沉淀；按上述步骤重复操作1～2次；合并沉淀；

(5)总蛋白提取：将步骤(4)中得到的合并后的沉淀在常温下干燥后，溶解于裂解液中，料液比1︰2～5(m/v)，室温作用2～4h；离心，取上清液；上清液再次离心，弃沉淀，取上清液；合并上清液，即得组织的总蛋白溶液；

(6)还原、烷基化：定量称取步骤(5)中得到的总蛋白溶液作为样品，加入其体积3～4倍的50mmol/L的NH₄HCO₃溶液，然后加入0.5mol/L的DTT至终浓度为3～4mmol/L，室温孵育30～50min；然后再加入0.5mol/L碘乙酰胺至终浓度为55～90mmol/L，室温避光孵育20～50min；再用50mmol/L的NH₄HCO₃冲洗1～3次，乙腈脱水，冻干，保存，得海洋生物蛋白组学样品。

所述的步骤(1)中的海洋生物为马尾藻、裙带菜或紫菜。

所述的步骤(1)、步骤(5)中的裂解液的配方为：50mMTris-HCl(pH7.4)、150mMNaCl、1%NP-40和0.1%SDS混合制成或为市售裂解液RLTBuffer。

所述的步骤(1)中的蛋白酶抑制剂为PMSF或Cocktail。

所述的步骤(2)中的Tris-Hcl缓冲液的配方为：50mMTris-HCL、1mMEGTA和1mMPMSF混合制成，调节pH值为7.4。

所述的步骤(2)中的低温破碎为液氮研磨破碎或置于冰盒上，超声破碎。

所述的超声破碎是控制超声破碎仪功率50～100w，超声0.8s，关闭0.8s，超声破碎时间1～5min。

本发明所提供的用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法，其是将海洋生物加入裂解液与蛋白酶抑制剂后进行匀浆，离心，取上清液和沉淀物；将沉淀物进行低温破碎、超高速低温离心获取蛋白质提取液；再将蛋白质提取液进行两次丙酮沉淀，对蛋白质组样品纯化，再经还原、烷基化，从海洋生物组织中获得种类全面、浓度及纯度均较高的蛋白质组学样品。本发明采用低温破碎的方法，破碎彻底，并且不损害蛋白质的天然结构；本发明能够有效避免核酸污染以及外源离子引入，以确保蛋白质样品的纯度。本发明最终产物尤其适用于胰酶水解后同位素标记进行液相色谱串联质谱分析，适用于进行蛋白质双向电泳、高效液相层析（HPLC）以及蛋白质组质谱鉴定等蛋白质组学研究；本发明工艺合理，操作可靠，制备科学，应用范围广，在对蛋白质带来极小破坏的情况下最大限度回收蛋白质组，并且对基于同位素标记绝对定量的鸟枪法蛋白质组液相色谱串联质谱测定进行了特别优化，对开展海洋蛋白质组学的相关研究具有较为重大的意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法，其经过下列工艺步骤：

(1)样品预处理：取马尾藻于离心管中，加入裂解液，料液比1︰3(m/v)，加入蛋白酶抑制剂PMSF使其终浓度为1.0mM，用组织匀浆器充分打散后，采用低温离心机控制温度4℃，控制转速10000g，离心20min，取上清液和沉淀物，上清液即为组织可溶性全蛋白溶液；其中，裂解液是采用：50mMTris-HCl(pH7.4)、150mMNaCl、1%NP-40和0.1%SDS混合制成；

(2)膜蛋白提取：将步骤（1）中得到的沉淀物采用Tris-Hcl缓冲液重悬，重悬液进行液氮研磨破碎，然后采用低温离心机控制温度4℃，控制转速10000g，离心15min，收集上清液,得到组织细胞膜蛋白的提取液；其中，Tris-Hcl缓冲液是采用：50mMTris-HCL、1mMEGTA和1mMPMSF混合制成，调节pH为7.4；

(3)丙酮沉淀：将步骤（1）、步骤(2)中得到的上清液合并，然后将合并后的上清液中加入其体积5倍的预冷丙酮溶液，震荡混合，-20℃条件下沉淀3h，再采用低温离心机控制温度4℃，控制转速10000g，离心15min，收集沉淀；

(4)二次丙酮沉淀：将步骤(3)中得到的沉淀中加入其体积4倍的预冷丙酮溶液，震荡混合，-20℃条件下沉淀1.5h，再采用低温离心机控制温度4℃，控制转速10000g，离心15min，收集沉淀；按上述步骤重复操作2次；合并沉淀；

(5)总蛋白提取：将步骤(4)中得到的合并后的沉淀在常温下干燥后，溶解于裂解液中，料液比1︰3(m/v)，室温作用3h；再采用离心机控制转速10000g，离心15min，取上清液；上清液再次采用离心机控制转速10000g，离心15min，弃沉淀，取上清液；合并上清液，即得组织的总蛋白溶液；其中，裂解液是采用：50mMTris-HCl(pH7.4)、150mMNaCl、1%NP-40和0.1%SDS混合制成；

(6)还原、烷基化：定量称取步骤(5)中得到的总蛋白溶液作为样品，加入其体积3.5倍的50mmol/L的NH₄HCO₃溶液，然后加入0.5mol/L的DTT至终浓度为3.5mmol/L，室温孵育45min；然后再加入0.5mol/L碘乙酰胺至终浓度为70mmol/L，室温避光孵育45min；再用50mmol/L的NH₄HCO₃冲洗2次，乙腈脱水，冻干，保存，得海洋生物蛋白组学样品。

本实施例所提供的海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法，其工艺合理，操作可靠，制备科学，应用范围广，在对蛋白质带来极小破坏的情况下最大限度回收蛋白质组，并且对基于同位素标记绝对定量的鸟枪法蛋白质组液相色谱串联质谱测定进行了特别优化。

实施例2

一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法，其经过下列工艺步骤：

(1)样品预处理：取裙带菜于离心管中，加入裂解液，料液比1︰5(m/v)，加入蛋白酶抑制剂Cocktail使其终浓度为1.2mM，用组织匀浆器充分打散后，采用低温离心机控制温度4℃，控制转速8000g，离心15min，取上清液和沉淀物，上清液即为组织可溶性全蛋白溶液；其中，裂解液采用的是生工生物公司生产销售的裂解液RLTBuffer；

(2)膜蛋白提取：将步骤（1）中得到的沉淀物采用Tris-Hcl缓冲液重悬，重悬液进行置于冰盒上，控制超声破碎仪功率100w，超声0.8s，关闭0.8s，超声破碎1min，然后采用低温离心机控制温度4℃，控制转速15000g，离心5min，收集上清液,得到组织细胞膜蛋白的提取液；其中，Tris-Hcl缓冲液是采用：50mMTris-HCL、1mMEGTA和1mMPMSF混合制成，并调节pH为7.4；

(3)丙酮沉淀：将步骤（1）、步骤(2)中得到的上清液合并，然后将合并后的上清液中加入其体积6倍预冷的丙酮溶液，震荡混合，-20℃条件下沉淀2h，再采用低温离心机控制温度5℃，控制转速15000g，离心5min，收集沉淀；

(4)二次丙酮沉淀：将步骤(3)中得到的沉淀中加入其体积5倍预冷的丙酮溶液，震荡混合，-20℃条件下沉淀1h，再采用低温离心机控制温度5℃，控制转速15000g，离心5min，收集沉淀；按上述步骤重复操作1次；合并沉淀；

(5)总蛋白提取：将步骤(4)中得到的合并后的沉淀在常温下干燥后，溶解于裂解液中，料液比1︰5(m/v)，室温作用2h；再采用离心机控制转速15000g，离心5min，取上清液；上清液再次采用离心机控制转速15000g，离心5min，弃沉淀，取上清液；合并上清液，即得组织的总蛋白溶液；其中，裂解液采用的是生工生物公司生产销售的裂解液RLTBuffer；

(6)还原、烷基化：定量称取步骤(5)中得到的总蛋白溶液作为样品，加入其体积4倍的50mmol/L的NH₄HCO₃溶液，然后加入0.5mol/L的DTT至终浓度为3mmol/L，室温孵育30min；然后再加入0.5mol/L碘乙酰胺至终浓度为90mmol/L，室温避光孵育20min；再用50mmol/L的NH₄HCO₃冲洗3次，乙腈脱水，冻干，保存，得海洋生物蛋白组学样品。

本实施例所提供的制备处理方法，其工艺合理，操作可靠，制备科学，应用范围广，在对蛋白质带来极小破坏的情况下最大限度回收蛋白质组。

实施例3

一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法，其经过下列工艺步骤：

(1)样品预处理：取紫菜于离心管中，加入裂解液，料液比1︰2(m/v)，加入蛋白酶抑制剂PMSF使其终浓度为0.5mM，用组织匀浆器充分打散后，采用低温离心机控制温度4℃，控制转速10000g，离心15min，取上清液和沉淀物，上清液即为组织可溶性全蛋白溶液；其中，裂解液采用：50mMTris-HCl(pH7.4)、150mMNaCl、1%NP-40和0.1%SDS混合制成；

(2)膜蛋白提取：将步骤（1）中得到的沉淀物采用Tris-Hcl缓冲液重悬，重悬液进行置于冰盒上，控制超声破碎仪功率50w，超声0.8s，关闭0.8s，超声破碎5min，然后采用低温离心机控制温度4℃，控制转速12000g，离心10min，收集上清液,得到组织细胞膜蛋白的提取液；其中，Tris-Hcl缓冲液是采用：50mMTris-HCL、1mMEGTA和1mMPMSF混合制成，调节pH为7.4；

(3)丙酮沉淀：将步骤（1）、步骤(2)中得到的上清液合并，然后将合并后的上清液中加入其体积4倍的预冷丙酮溶液，震荡混合，-20℃条件下沉淀4h，再采用低温离心机控制温度0℃，控制转速12000g，离心10min，收集沉淀；

(4)二次丙酮沉淀：将步骤(3)中得到的沉淀中加入其体积3倍的预冷丙酮溶液，震荡混合，-20℃条件下沉淀2h，再采用低温离心机控制温度0℃，控制转速12000g，离心10min，收集沉淀；按上述步骤重复操作2次；合并沉淀；

(5)总蛋白提取：将步骤(4)中得到的合并后的沉淀在常温下干燥后，溶解于裂解液中，料液比1︰2(m/v)，室温作用4h；再采用离心机控制转速12000g，离心10min，取上清液；上清液再次采用离心机控制转速12000g，离心10min，弃沉淀，取上清液；合并上清液，即得组织的总蛋白溶液；其中，裂解液采用的是生工生物公司生产销售的裂解液RLTBuffer；

(6)还原、烷基化：定量称取步骤(5)中得到的总蛋白溶液作为样品，加入其体积3倍的50mmol/L的NH₄HCO₃溶液，然后加入0.5mol/L的DTT至终浓度为4mmol/L，室温孵育50min；然后再加入0.5mol/L碘乙酰胺至终浓度为55mmol/L，室温避光孵育50min；再用50mmol/L的NH₄HCO₃冲洗1次，乙腈脱水，冻干，保存，得海洋生物蛋白组学样品。

本实施例所提供的海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法，其工艺合理，操作可靠，制备科学，在对蛋白质带来极小破坏的情况下最大限度回收蛋白质组，并且对基于同位素标记绝对定量的鸟枪法蛋白质组液相色谱串联质谱测定进行特别优化。