一种快速检测发酵液中苏氨酸含量的方法

摘要

本发明公开了一种快速检测发酵液中苏氨酸含量的方法，将样品溶液稀释后与含有NADH、PLP、乙醇脱氢酶和DTT的溶液混匀反应后，再与含有LTA的溶液反应，通过检测计算OD

说明书

技术领域

本发明涉及微生物工业，特别涉及利用基因工程改造的工业微生物生产L- 苏氨酸的领域，具体涉及一种快速检测发酵液中苏氨酸含量的方法。

背景技术

目前工业上多采用发酵法生产苏氨酸。欧美国家的苏氨酸生产水平要明显 高于我国，如德国的德固赛公司、美国的ADM公司等应用先进的分子操作技 术对菌种进行改造，使苏氨酸的产量及转化率有了巨大的提高。目前国际菌种 发酵水平为150g/L，发酵周期为36-48h，转化率高于50％。国内无论是发酵产 量还是转化率均低于国际水平。

苏氨酸高产菌的获得，一方面是采用基因工程的手段对菌株进行理性改 造，另一方面是通过物理诱变或者化学诱变后筛选产量提高的菌株，并且后者 为获得高产菌株的一种重要手段。

发酵液中苏氨酸的检测是筛选过程中主要的瓶颈之一。目前在检测发酵液 中苏氨酸含量时，主要包括纸层析法和高校液相色谱等。纸层析法使用设备较 少，成本低廉，但是每次测量需要3-4小时，并且准确率比较低，误差可达10％ 左右，因此不能迅速的提供指导实验的数据。高效液相色谱可以提供精确的实 验结果，但是该方法所采用的仪器昂贵，不能广泛推广。

另外，测定苏氨酸含量的方法还包括高氯酸电位滴定法，此法只能局限于 测定固定样品，不能进行发酵液中苏氨酸含量的测定。

因此，本领域尚需开发一种快速检测发酵液中苏氨酸含量的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够简单、快速、准确的检测发酵液中苏氨酸 含量的方法。

本发明的第一方面，提供一种检测样品中苏氨酸含量的方法，所述方法包括 以下步骤：

(i)将样品与第一反应溶液混合均匀，得到第一混合溶液；

(ii)将所述第一混合溶液置于4±1℃放置10-90min后恢复温度至15-30℃；

(iii)将第一混合溶液与第二反应溶液混合均匀得到第二混合溶液；

(iv)检测所述第二混合溶液的OD₃₄₀，每隔1-5分钟检测一次，共检测5-7次；

(v)以检测时间和对应的OD₃₄₀作图，计算斜率即为样品的OD₃₄₀降低速率；

(vi)将计算得到的OD₃₄₀的降低速率与标准曲线进行比较，得到所述发酵液中 苏氨酸含量，

其中，所述第一反应溶液含有HEPESbuffer、NADH、PLP、乙醇脱氢酶、 DTT和水；

所述第一混合溶液中含有10-500mMHEPESbuffer、100μM-1000μM NADH、10μM-100μMPLP、1U-50U乙醇脱氢酶和0.5mM-8mMDTT；

所述第二反应溶液中含有1-20ULTA，余量为水。

在另一优选例中，所述第一混合溶液中含有50-400mMHEPESbuffer、 100μM～800μMNADH、20μM～80μMPLP、1U～35U乙醇脱氢酶和0.5mM～5 mMDTT。

在另一优选例中，在步骤(i)中将样品稀释后与所述第一反应溶液混合均匀， 稀释后的样品中苏氨酸的浓度为0.1-10mM。

在另一优选例中，稀释后的样品与第一反应溶液的体积比为1:1-5。

在另一优选例中，所述第一混合溶液与所述第二反应溶液的体积比为1-5:1。

在另一优选例中，通过以下步骤获得所述标准曲线：

(a)将浓度范围为0.1mM～8mM的数个浓度不同的标准苏氨酸溶液分别与第 一反应溶液混合均匀，得到第一混合溶液；

(b)将所述第一混合溶液置于4±1℃放置10-90min后恢复温度至15-30℃；

(c)将第一混合溶液与第二反应溶液混合均匀得到第二混合溶液；

(d)检测所述第二混合溶液的OD₃₄₀，每隔1-5分钟检测一次，共检测5-7次；

(e)以测定时间和对应的OD₃₄₀为坐标作图，计算斜率为OD₃₄₀降低速率；

(f)以标准苏氨酸溶液的浓度及对应的OD₃₄₀降低速率为坐标，绘制得到所述 标准曲线，

其中，步骤(a)中所述第一反应溶液含有HEPESbuffer、NADH、PLP、乙醇 脱氢酶、DTT和水；

步骤(a)得到的所述第一混合溶液中含有10-500mMHEPESbuffer、100μM -1000μMNADH、10μM-100μMPLP、1U-50U乙醇脱氢酶和0.5mM-8mMDTT；

所述第二反应溶液中含有1-20ULTA，余量为水。

在另一优选例中，所述第一混合溶液中含有50-400mMHEPESbuffer、 100μM～800μMNADH、20μM～80μMPLP、1U～35U乙醇脱氢酶和0.5mM～5 mMDTT。

在另一优选例中，所述第一混合溶液中含有50-200mMHEPESbuffer、 100μM～500μMNADH、20μM～80μMPLP、1U～5U乙醇脱氢酶和 0.5mM～1.5mMDTT。

在另一优选例中，所述步骤b)中标准苏氨酸溶液与第一反应溶液的体积比为 1:1-5；和/或

所述步骤d)中所述第一混合溶液与第二反应溶液的体积比为1-5:1。

在另一优选例中，所述检测样本中苏氨酸含量与所述标准曲线的建立同时进 行。

在另一优选例中，所述LTA来源于铜绿假单胞菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆 菌、酿酒酵母、假丝酵母、念珠菌中的一种或两种以上。

在另一优选例中，步骤(a)配制8个浓度不同的标准苏氨酸溶液，浓度分别为 0.2mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM。

本发明的检测方法，可以简单、快速、准确地检测发酵液中苏氨酸含量， 克服现有技术中设备昂贵，操作繁琐，测量耗时等不足。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方 案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为实施例1检测结果图。

图2为实施例3的检测结果图。

图3为苏氨酸浓度与NADH降低速率曲线。

图4为双酶法检测苏氨酸含量的线性范围。

图5为M9+酵母粉培养基中苏氨酸含量及NADH降低速率曲线。

图6为LB培养基中苏氨酸含量及NADH降低速率曲线。

图7为采用本发明方法(酶偶联法)和HPLC方法检测苏氨酸含量结果图， 各时间点处第一柱(左柱)为HPLC检测结果，第二柱(右柱)为本发明酶偶联法检 测结果。

具体实施方式

本申请的发明人经过广泛而深入地研究，首次意外研发出一种快速检测发 苏氨酸含量的方法，以LTA酶作为工具酶并将NADH的降低速率与苏氨酸的 产量相偶联。L-苏氨酸醛缩酶(L-threoninealdolase，LTA)能催化L-苏氨酸生成 甘氨酸和乙醛及其逆反应，在LTA及吡哆醛磷酸盐(PLP)存在时，苏氨酸会被 分解为乙醛和甘氨酸，乙醛被乙醇脱氢酶(ADH)还原为乙醇，同时烟酰胺腺嘌 呤二核苷酸(NADH)被氧化为NAD⁺，通过OD₃₄₀nm检测NADH的变化速率确 定苏氨酸的含量。在此基础上，完成了本发明。

检测方法

本发明提供的检测样品中苏氨酸含量的方法，包括以下步骤：

(i)将样品与第一反应溶液混合均匀，得到第一混合溶液；

(ii)将所述第一混合溶液置于4±1℃放置10-90min后恢复温度至15-30℃；

(iii)将第一混合溶液与第二反应溶液混合均匀得到第二混合溶液；

(iv)检测所述第二混合溶液的OD₃₄₀，每隔1-5分钟检测一次，共检测5-7次；

(v)以检测时间和对应的OD₃₄₀作图，计算斜率即为样品的OD₃₄₀降低速率；

(vi)将计算得到的OD₃₄₀的降低速率与标准曲线进行比较，得到所述发酵液中 苏氨酸含量，

其中，所述第一反应溶液含有HEPESbuffer、NADH、PLP、乙醇脱氢酶、 DTT和水；

所述第一混合溶液中含有10-500mMHEPESbuffer、100μM-1000μM NADH、10μM-100μMPLP、1U-50U乙醇脱氢酶和0.5mM-8mMDTT；

所述第二反应溶液中含有1-20ULTA，余量为水。

所述第一混合溶液中含有50-200mMHEPESbuffer、100μM～500μM NADH、20μM～80μMPLP、1U～5U乙醇脱氢酶和0.5mM～1.5mMDTT。

在另一优选例中，所述第一混合溶液中含有100mMHEPESbuffer、300μM NADH、50μMPLP、3U乙醇脱氢酶和1mMDTT。

在另一优选例中，所述HEPESbuffer的pH值为7.8-8.2，较佳地为8.0。

在另一优选例中，所述第二反应溶液中含有2-15ULTA，余量为水。

在另一优选例中，在步骤(i)中将样品稀释后与所述第一反应溶液混合均匀， 稀释后的样品中苏氨酸的浓度为0.1-10mM。

在另一优选例中，稀释后发酵液中苏氨酸的浓度为0.5-5mM。

在另一优选例中，稀释后的样品与第一反应溶液的体积比为1:1-5。

在另一优选例中，所述稀释后的样品与第一反应溶液的体积比为1:1.5-3，较 佳地为1:2。

在另一优选例中，所述第一混合溶液与所述第二反应溶液的体积比为1-5:1。

在另一优选例中，所述第一混合溶液与所述第二反应溶液的体积比为1-3：1， 较佳的为1.5:1。

在另一优选例中，所述第一反应溶液与所述第二反应溶液的体积比为1:0.5-2， 较佳地为1:0.5-1.5，更佳地为1:1。

本发明中，通过以下步骤获得所述标准曲线：

(a)将浓度范围为0.1mM～8mM的数个浓度不同的标准苏氨酸溶液分别与第 一反应溶液混合均匀，得到第一混合溶液；

(b)将所述第一混合溶液置于4±1℃放置10-90min后恢复温度至15-30℃；

(c)将第一混合溶液与第二反应溶液混合均匀得到第二混合溶液；

(d)检测所述第二混合溶液的OD₃₄₀，每隔1-5分钟检测一次，共检测5-7次；

(e)以测定时间和对应的OD₃₄₀为坐标作图，计算斜率为OD₃₄₀降低速率；

(f)以标准苏氨酸溶液的浓度及对应的OD₃₄₀降低速率为坐标，绘制得到所述 标准曲线，

其中，步骤(a)中所述第一反应溶液含有HEPESbuffer、NADH、PLP、乙醇 脱氢酶、DTT和水；

步骤(a)得到的所述第一混合溶液中含有10-500mMHEPESbuffer、100μM -1000μMNADH、10μM-100μMPLP、1U-50U乙醇脱氢酶和0.5mM-8mMDTT；

所述第二反应溶液中含有1-20ULTA，余量为水。

在另一优选例中，所述标准苏氨酸溶液，浓度范围为0.2mM～6mM。

在另一优选例中，步骤(a)配制8个浓度不同的标准苏氨酸溶液，浓度分别为 0.2mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM。

所述第一混合溶液中含有50-200mMHEPESbuffer、100μM～500μM NADH、20μM～80μMPLP、1U～5U乙醇脱氢酶和0.5mM～1.5mMDTT。

在另一优选例中，所述第一混合溶液中含有100mMHEPESbuffer、300μM NADH、50μMPLP、3U乙醇脱氢酶和1mMDTT。

在另一优选例中，所述第二反应溶液中含有2-15ULTA，余量为水。

所述步骤b)中标准苏氨酸溶液与第一反应溶液的体积比为1:1-5。

所述步骤d)中所述第一混合溶液与第二反应溶液的体积比为1-5:1。

在另一优选例中，所述步骤b)中所述标准苏氨酸溶液与第一反应溶液的体积 比为1:1.5-3，较佳地为1:2。

在另一优选例中，所述步骤d)中所述第一混合溶液与所述第二反应溶液的体 积比为1-3：1，较佳的为1.5:1。

在另一优选例中，标准曲线获得过程中，所述第一反应溶液与所述第二反应 溶液的体积比为1:0.5-2，较佳地为1:0.5-1.5，更佳地为1:1。

所述检测样本中苏氨酸含量与所述标准曲线的建立同时进行。

本发明中，检测样本中苏氨酸含量与所述标准曲线的建立同时进行，具体地， 同时进行步骤(i)和(a)，同时进行步骤(ii)和(b)，同时进行步骤(iii)和(c)，同时进行 步骤(iv)和(d)。

本发明中，所述LTA来源于铜绿假单胞菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿 酒酵母、假丝酵母、念珠菌中的一种或两种以上。，LTA的获得没有特别的限 制，可以采用本领域已知的各种方法。在一优选例中，采用以下方法获得LTA：

以铜绿假单胞菌基因组为模板PCR得到lta基因，并将其连接到pET28载 体(购自美国invitrogen公司)转化BL21(DE3)菌株，加入异丙基硫代半乳糖苷 IPTG进行诱导表达，表达2h后离心收菌，加入LysisBuffer(含有PMSF和DTT) 后进行超声破碎，上清与已平衡的His纯化树脂过夜结合后，加入WashBuffer 重复洗涤3-4次后加入EluteBuffer洗脱蛋白。由于纯化的LTA蛋白含有高浓 度的咪唑(250mM)，因此需进行透析处理。将洗脱液置于透析袋中放入盛有透 析液的烧杯中，4℃透析过夜。将透析好的LTA蛋白溶液加入30％的甘油并分 装为200μl/管后置于-20℃备用。

在另一优选例中，采用以下方法获得标准曲线：

先配制一系列不同浓度的标准苏氨酸溶液，加入第一反应溶液混合均匀后 得到第一混合溶液，所述第一反应溶液中含有HEPESbuffer(pH8.0)、NADH、 50μMPLP、乙醇脱氢酶(ADH)和DTT。

将第一混合溶液于4℃放置30min-1h后恢复室温，加入适量的LTA后放 入酶标仪内，每隔2min读取一次OD₃₄₀数值，共读取3～7次。以时间为横坐标， 以OD₃₄₀读数为纵坐标，计算吸光值回归曲线的斜率，即为吸光值降低速率 (OD₃₄₀降低速率)。

以标准苏氨酸溶液的浓度与其对应的吸光值OD₃₄₀降低速率为坐标，绘制 标准曲线。

所配制的标准苏氨酸溶液浓度在0.2mM～6mM之间。

所述第一混合溶液中NADH浓度为100μM～1000μM，PLP浓度为 10μM～100μM，乙醇脱氢酶浓度为1U～50U，DTT浓度为1mM～5mM。较佳地， 在第一混合溶液中，含有100mMHEPESbuffer(pH8.0)、300μMNADH、50μM PLP、3U乙醇脱氢酶(ADH)和1mMDTT。

所述读取OD_340nm时间为6min～20min。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书 所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可 以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明， 所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

与现有技术相比本发明所具有的优点如下：

1检测通量高。所谓“高通量”(Highthroughputscreening,HTS)是指利用可 批量操作的工具及可进行自动化分析的操作系统执行实验的过程，并通过快速 灵敏的检测器采集实验数据并进行批量处理分析的一种方法。本法是一种以 LTA酶作为工具酶并将NADH的降低速率与苏氨酸的产量相偶联的检测方法。 本法可以在200μL的微孔中进行，利用96孔板和酶标仪可以实现高通量的操 作，能够满足工业生产时上批量样品检测的要求。

2检测费用低。本发明提供的测定方法中所需的设备和试剂均为实验室常 备且价格低廉。与高效液相色谱(HPLC)或者氨基酸分析仪等相比，此法省去了 昂贵的衍生试剂及设备使用费等费用，并且高通量操作时可进一步降低样品的 检测费用。

3检测时间短。本方法一次测定时间约为一个小时，利用96孔板一次实 验即可得到大量样品的结果。本法同时测定标准样品(简称为标品)和样品，样 品中苏氨酸的含量通过读数即可。另外此法只需要对样品进行简单的离心取上 层发酵液即可，与常用的纸层析法或者高效液相色谱(HPLC)相比，此法大大缩 短了检测样品所需要的时间，从而能够快速的获得实验结果并指导后续实验。

4操作步骤简单，所需试剂无毒性，对实验设备及操作人员要求低，可以 快速掌握。本方法中涉及的药品和试剂均对人体无毒无害，且多道移液器、离 心机、酶标仪及数据的处理软件Excel等均为实验室较常用的技能，只需简单 地培训即可在短时间内掌握。

5实验数据准确，平行性好。通过该方法测定的发酵液中苏氨酸的含量与 HPLC测定的结果进行比较后发现基本一致，差值接在操作误差之内，且样品 之间重复性良好，同一样品数次测量的差值保持在5％之内，对生产具有比较 高的指导意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实 验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork: ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所 建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

检测M9培养基中苏氨酸的含量

M9培养基的配方如下：

首先配置5×M9盐溶液：Na2HPO4·7H2O12.8g，KH2PO43.0g，NaCl0.5g， NH4Cl1.0g，加双蒸水200mL溶解，121℃灭菌15分钟。

再按照下面的配方配置M9培养基：5×M9盐溶液200mL，1M的MgSO4 2mL，20％的葡萄糖溶液20mL，1M的CaCl20.1mL，加灭菌双蒸水至1000mL。

配置反应液SolutionⅠ和SolutionⅡ。(SolutionⅠ和SolutionⅡ的配方为每 个样品所需量)

SolutionⅠ(80μl)：包含HEPES、NADH、ADH、PLP、DTT和H₂O

SolutionⅡ(80μl)：包含LTA(3U)，余量为H₂O

标品及样品：

取一定量的样品或标品并加H₂O将其补足为40μl。其中标品用去离子水溶 解，样品为含有未知苏氨酸浓度的M9培养基。

将苏氨酸标品稀释到的终浓度为0.2mM，0.5mM，1mM，2mM，3mM，4mM， 5mM，6mM，并将样品中苏氨酸浓度稀释在1～4mM之间，加入SolutionⅠ及 样品或标品于96孔板中，用排枪混匀，反应体系中包含HEPES(150mM)、 NADH(200μM)、ADH(3U)、PLP(20μM)、DTT(1mM)。4℃下静置 30min后取出回复到室温。

将LTA从-20℃取出后冰上融化。按照SolutionⅡ的配方加入适量H₂O混 匀后将其回复至室温。将SolutionⅡ加入到96孔板。

打开酶标仪设定好程序后，将96孔板放入酶标仪内，程序设置为：自动 混匀5次，每次3s，37℃温育2min后开始读数，每隔2min读一个数值，共读 7次。以测定时间和OD₃₄₀值为坐标绘图，计算斜率为OD₃₄₀降低速率。

用Excel对每个微孔的数据进行处理，以苏氨酸标品的浓度为横坐标，以 对应的OD₃₄₀降低速率为纵坐标绘制标准曲线，结果如图1所示。

根据样品的OD₃₄₀降低速率和标准曲线，读取样品中苏氨酸的浓度值，并 根据稀释倍数换算样品中初始苏氨酸的含量。

实施例2

检测LB培养基中苏氨酸的含量

LB培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L。

配置反应液SolutionⅠ和SolutionⅡ(SolutionⅠ和SolutionⅡ的配方为每个 样品所需量)。

SolutionⅠ(80μl)：包含HEPES、NADH、ADH、PLP、DTT和H₂O

SolutionⅡ(80μl)：包含LTA(6U)，余量为H₂O

标品及样品：取一定量的样品或标品并加H₂O将其补足为40μl。其中标品 用去离子水溶解，样品为含有未知苏氨酸浓度的LB培养基。

将苏氨酸标品稀释到终浓度为0.2mM，0.5mM，1mM，2mM，3mM，4mM， 5mM，6mM，并将样品中苏氨酸浓度稀释在1～4mM之间，加入SolutionⅠ及 样品或标品于96孔板中，用排枪混匀，反应体系中包含HEPES(250mM)、 NADH(500μM)、ADH(10U)、PLP(50μM)和DTT(2.5mM)。4℃下静 置30min后取出回复到室温。

将LTA从-20℃取出后冰上融化。按照SolutionⅡ的配方加入适量H₂O混 匀后将其回复至室温。将SolutionⅡ加入到96孔板。

打开酶标仪设定好程序后，将96孔板放入酶标仪内，程序设置为：自动 混匀5次，每次3s，37℃温育2min后开始读数，每隔2min读一个数值，共读 7次。以测定时间和OD₃₄₀值为坐标绘图，计算斜率为OD₃₄₀降低速率。

用Excel对每个微孔的数据进行处理，以苏氨酸标品的浓度为横坐标，以 对应的OD₃₄₀降低速率为纵坐标绘制标准曲线。根据样品的OD₃₄₀降低速率和 标准曲线，读取样品中苏氨酸的浓度值，并根据稀释倍数换算样品中初始苏氨 酸的含量。

实施例3

检测苏氨酸发酵液中苏氨酸的含量

苏氨酸发酵液的配方如下：

葡萄糖70g/L，(NH₄)₂SO₄10g/L，KH₂PO₄2g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L， FeSO₄·7H₂O5mg/L，MnSO₄·4H₂O5mg/L，甲硫氨酸800mg/L，pH调为6.0

配置反应液SolutionⅠ和SolutionⅡ。(SolutionⅠ和SolutionⅡ的配方为每 个样品所需量)

SolutionⅠ(80μl)：包含HEPES、NADH、ADH、PLP、DTT和H₂O

SolutionⅡ(80μl)：包含LTA(12U)，余量为H₂O

标品及样品：取一定量的样品或标品并加H₂O将其补足为40μl。其中标品 用去离子水溶解，样品为含有未知苏氨酸浓度的苏氨酸发酵培养基。

将苏氨酸标品稀释到终浓度为0.2mM，0.5mM，1mM，2mM，3mM，4mM， 5mM，6mM，并将样品中苏氨酸浓度稀释在1～4mM之间，加入SolutionⅠ及 样品或标品于96孔板中，用排枪混匀，反应体系中包含HEPES(400mM)、 NADH(800μM)、ADH(30U)、PLP(80μM)和DTT(4mM)。4℃下静 置30min后取出回复到室温。

将LTA从-20℃取出后冰上融化。按照SolutionⅡ的配方加入适量H₂O混 匀后将其回复至室温。将SolutionⅡ加入到96孔板。

打开酶标仪设定好程序后，将96孔板放入酶标仪内，程序设置为：自动 混匀5次，每次3s，37℃温育2min后开始读数，每隔2min读一个数值，共读 7次。以测定时间和OD₃₄₀值为坐标绘图，计算斜率为OD₃₄₀降低速率。

用Excel对每个微孔的数据进行处理，以苏氨酸标品的浓度为横坐标，以 对应的OD₃₄₀降低速率为纵坐标绘制标准曲线。根据样品的OD₃₄₀降低速率和 标准曲线，读取样品中苏氨酸的浓度值，并根据稀释倍数换算样品中初始苏氨 酸的含量。

实验结果如图2所示。结果表明M9培养基对此方法无明显的影响，所有 的偏差都在可接受范围之内，M9培养基中成分明确，为葡萄糖和部分盐离子， 因此，可以利用此方法检测M9培养基中苏氨酸的含量。

实施例4

线性实验

为了确定本发明的双酶法检测苏氨酸的范围，按照实施例1的方法对不同 浓度的苏氨酸(0～70mM)标品进行检测，结果如图3和图4所示。

结果表明苏氨酸的含量在0mM～70mM范围内与NADH的降低速率相关性 良好，且苏氨酸的含量在0～6mM范围内与NADH的降低速率具有良好的线性 关系。

实施例5

灵敏度实验

本实施例考察双酶法检测苏氨酸的灵敏度。

分别收集了利用M9+酵母粉培养基和LB培养基培养大肠杆菌的上层发酵 液，并将其稀释成不同浓度，按照实施例3的方法利用双酶法进行检测，结果 分别如图5和图6所示。

结果表明，本发明双酶法可以检测出发酵液中0.05mM苏氨酸的差异。本 发明方法具有很高的灵敏度，可以检测出微小的差异。

实施例6

抗干扰实验

将常用的培养基中的盐离子及其他复合成分对上述方法的准确性影响进 行了研究。在体系中添加2mM苏氨酸，以不添加任何干扰成分作为对照组， 分别添加表1中各种成分后作为实验组，将对照组测定的苏氨酸结果的相对值 设为100，实验组的测定结果与对照组进行比较后得出相对值。

实验结果如表1所示。

表1组分对双酶法结果的影响

相对值在100±5范围内时，可以认为是实验误差，添加的物质对此方法 没有影响，超过此范围后认为对此方法有影响。由上述检测结果可知，大多数 常用培养基中的组分对本发明方法没有影响，本发明的方法具有较强的抗干扰 能力。

常用的培养基中M9培养基由于含有葡萄糖，SO₄^2-，Mg²⁺，Na⁺，NH₄⁺， Cl^-，H₂PO₄^-等对上述方法没有影响的盐离子，因此本发明的方法特别适用于以 M9培养基培养的菌株发酵得到的发酵液中的苏氨酸含量的测定。

实施例7

利用酶偶联法与HPLC测定结果比较

本实施例从70L发酵罐中每隔2小时取出样品，利用本发明的酶偶联法(也 可称为双酶法)和已知的HPLC两种方法对苏氨酸的含量进行测定并进行比对， 结果如图7所示。为了方便比较，将不同时间点的HPLC的结果设定为100％， 酶偶联法测定的结果与HPLC比较后的结果在图中显示。

通过比较两种方法的结果发现，双酶法测定值/HPLC测定值在88％～128％ 内浮动，两种方法的结果基本一致，表明双酶法具有较高的准确性。

综上所述，本发明双酶法是一种快速精确、能够用于工业生产中高通量的 检测发酵液中苏氨酸含量的方法，具有良好的应用前景。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。