夏天无总生物碱中毕扣扣灵的去除方法、产物及应用

摘要

本发明公开了夏天无总生物碱中毕扣扣灵的去除方法、产物及应用。本发明提供了一种夏天无总生物碱中毕扣扣灵的去除方法，其包括以下步骤：步骤(1)：在溶剂中，将夏天无的超临界提取物与碱进行水解反应，得到夏天无总生物碱；步骤(2)：采用高速离心分配色谱法，将步骤(1)中得到的夏天无总生物碱进行分离，得到去除毕扣扣灵的夏天无总生物碱即可；所述的分离在高速离心分配色谱仪中进行。本发明的夏天无总生物碱中毕扣扣灵的去除方法步骤简单、时间短、去除率高、适合于大规模工业化生产，得到的夏天无总生物碱中毕扣扣灵含量低，适合于临床应用。

说明书

技术领域

本发明涉及夏天无总生物碱中毕扣扣灵的去除方法、产物及应用。

背景技术

脑血管疾病是非常严重的健康和社会问题，具有发病率高、致残率高、复发率高、死亡率高以及医疗花费比例高等特点，且仍呈上升趋势。在欧美国家，脑血管疾病是继肿瘤和心脏疾病之后的第三大死亡原因；而在中国，脑血管疾病是继肿瘤之后的第二大死亡原因。脑血管疾病的代表是脑卒中。脑卒中的80％左右属于缺血性脑卒中，是指各种原因引起的脑部血液供应障碍，或动脉血流灌注减少，或者突然血流完全中断停止供血，导致脑组织缺血、缺氧性坏死，局部脑组织发生不可逆性损害。

随着人们对急性脑卒中深入研究，抗氧化治疗在急性缺血性脑卒中治疗中的重要性越来越得到人们的关注。

夏天无为罂粟科紫堇属延胡索亚属植物伏生紫堇Corydalisdecumbens(Thunb.)Pers.的块茎。又名一粒金丹、野延胡、洞里神仙、伏地延胡索、落水珠。早在清代赵学敏《本草纲目拾遗》中便记载了本药(一粒金丹)：“一名洞里神仙，又名野延胡，江南人呼飞来牡丹”。

夏天无植物生长于丘陵或低山山坡、草地，喜生于气候温暖潮湿、向阳、排水良好、土层深厚的沙质地。主产于江西、湖南、福建、浙江、安徽等省，以江西产质量为佳。夏天无是一种常用民间中药，具有镇痛、消炎的作用，用于治疗胃痛、癌痛、坐骨神经痛、风湿性关节炎、小儿麻痹后遗症。近代药理研究发现夏天无在心脑血管疾病方面显示出较好的疗效，如治疗老年性痴呆、抗心律失常、抑制血小板聚集等。

夏天无的活性成分是生物碱。《中国药典》2010版一部也将生物碱作为夏天无的定性和定量指标。

夏天无总生物碱能抑制脑血栓形成，其对于脑缺血/再灌注造成的神经元细胞损伤的保护作用也得到了确切的证实。同时夏天无总生物碱能显著增加心肌营养性血流量，并能通过增加心、脑等重要器官供血供氧来显著提高小鼠耐缺氧能力。多方向、多靶点治疗脑卒中的作用为将夏天无总生物碱开发成治疗脑卒中中药创新药物提供了坚实的理论及实验支撑。

但是夏天无总生物碱表现出的致惊厥毒性不利于临床使用时扩大其剂量范围。夏天无总生物碱中的毕扣扣灵，又名荷包牡丹碱，该成分是已经得到确认的致惊厥剂。经筛选发现具有强烈惊厥效应，和经典惊厥剂相比，具有作用快持续时间短的特点。且目前研究证实毕扣扣灵在致惊厥过程中通过多种途径损伤神经元细胞，而脑卒中治疗中提高神经元对于缺血缺氧的耐受、抵抗作用是治疗手段之一。降低夏天无总生物碱中毕扣扣灵的含量将是提高夏天无总生物碱安全性、提高其神经保护作用的一个有效途径。

本课题组已经建立有夏天无总生物碱的超临界提取工艺，可快速、高效的得到高生物碱含量的夏天无总生物碱提取物。在此工作基础上，建立方便易行的工艺方法，将毕扣扣灵在夏天无总生物碱中的含量降低，得到毒性降低、对神经元的保护作用基本不变的夏天无总生物碱，是目前急需解决的技术难题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中夏天无总生物碱中毕扣扣灵含量高，不适合于临床应用和工业化生产等缺陷，而提供了一种夏天无总生物碱中毕扣扣灵的去除方法、产物及应用。本发明首次将FCPC这一新技术应用到夏天无总生物碱中毕扣扣灵的去除，并成功将所得工艺进行FCPC技术的放大实验，所得产品去率高，重复性好。本发明的夏天无总生物碱中毕扣扣灵的去除方法步骤简单、易于操作、时间短、去除率高、适合于大规模工业化生产，得到的夏天无总生物碱中毕扣扣灵含量低，适合于临床应用。

夏天无超临界提取方法对总生物碱提取率高，节能环保，但由于在提取过程中带入了大量挥发油和脂肪酸，导致提取物水溶性差，难以干燥完全，不利于保存以及对后续制剂开发的应用，本发明在去除毕枯枯灵的同时由于碱化剂的使用，将改善提取物的状态，呈粉末状，可以应用于片剂，胶囊剂，颗粒剂，粉针及供肌肉和静脉给药的注射剂的制备。

本发明提供一种夏天无总生物碱中毕扣扣灵的去除方法，其包括以下步骤：

步骤(1)：在溶剂中，将夏天无的超临界提取物与碱进行水解反应，得到夏天无的总生物碱；

步骤(2)：采用高速离心分配色谱法，将步骤(1)中得到的夏天无总生物碱进行分离，得到去除毕扣扣灵的夏天无总生物碱即可；所述的分离在高速离心分配色谱仪中进行。

步骤(1)可以将夏天无的超临界提取物中的毕扣扣灵转化为毕扣扣灵羧酸盐，从而得到含有毕扣扣灵羧酸盐的夏天无的总生物碱。

步骤(1)中，所述的夏天无的超临界提取物可以采用专利CN101058576A中报道的夏天无的超临界提取方法得到的夏天无的超临界提取物，也可以为通过方法一制备得到。

方法一包括以下步骤：

步骤1：以夏天无(罂粟科植物伏生紫堇)的块茎、粉碎、碱化，得到碱化后的夏天无；所述的碱化中，所述的碱与所述的夏天无的质量比值为0.001～1，优选0.001～0.1。

步骤2：将步骤1得到的碱化后的夏天无，在超临界CO₂萃取和膜分离相耦合的萃取仪中进行萃取和分离，干燥，得到夏天无总生物碱提取物。

步骤1中，所述的粉碎，优选粉碎至夏天无(罂粟科植物伏生紫堇)的粒径为10目～60目(即1.74mm～0.273mm)。所述的碱化，优选采用无机碱进行碱化，所述的无机碱优选氨水溶液、氢氧化钙、碳酸钠和碳酸氢钠中的一种或多种，进一步优选氨水溶液，所述的氨水溶液的质量浓度优选1％～10％，所述的质量浓度是指氨气的质量占氨水溶液总质量的百分比。所述的氨水溶液可以采用氨水试剂与水混合得到，所述的氨水试剂与水的体积比优选5％～10％，所述的体积比是指氨水试剂的体积与水体积的百分比。所述的氨水试剂可以为本领域中常规市售氨水试剂，所述的氨水试剂的浓度优选2％～30％。所述的无机碱优选以其水溶液的形式使用，所述的无机碱的水溶液的浓度优选1％～10％，所述的浓度是指无机碱的质量占无机碱的水溶液的总质量的百分比。

步骤2中，所述的超临界CO₂萃取和分离的时间优选0.5～5h；所述的超临界CO₂萃取和分离时采用的夹带剂优选甲醇和/或乙醇，进一步优选乙醇，所述的乙醇优选质量百分比为95％的乙醇水溶液，所述的质量百分比是指乙醇的质量占乙醇水溶液总质量的百分比。所述的“超临界CO₂萃取和膜分离相耦合的萃取仪”中的膜优选超滤膜、纳滤膜、反渗透膜或中空纤维膜，进一步优选纳滤膜；所述的纳滤膜的孔径优选1纳米～3纳米。所述的超滤膜的孔径优选纳米10纳米～40纳米。所述的反渗透膜的孔径优选1纳米～5纳米。所述的中空纤维膜的孔径优选1纳米～40纳米。

步骤2中，所述的超临界CO₂萃取和膜分离相耦合的萃取仪根据《中药提取分离新技术》一书(2010年4月，化学工业出版社出版，P353页)中记载的原理图进行组装，所述的超临界CO₂萃取和膜分离相耦合的萃取仪包括以下部件：萃取装置、分离装置、高压泵、膜装置、冷却器和气体储罐。

本发明中，所述的夏天无总生物碱提取物的制备方法优选还包括步骤3，进一步优选还包括步骤3和步骤4，再进一步优选还包括步骤3、步骤4和步骤5。

步骤3：将步骤2得到的夏天无总生物碱提取物调节pH至2～5，采用超声波萃取，然后采用超滤或微滤膜过滤，得到纯化后的夏天无总生物碱提取物的溶液。

步骤4：将步骤3得到的夏天无总生物碱提取物的溶液调节pH为8～12，过滤，固相用水洗至中性，得到进一步纯化后的夏天无总生物碱提取物；

步骤5：将步骤4得到的进一步纯化后的夏天无总生物碱提取物重结晶，得到重结晶后的夏天无总生物碱提取物。

步骤3中，所述的超声波萃取的频率优选30Hz～80Hz，所述的超声波萃取的时间优选0.5小时～3小时。所述的超滤或微滤膜的孔径优选0.3微米～0.8微米；所述的调节pH优选用酸进行调节，所述的酸优选无机酸和/或有机酸，所述的无机酸优选盐酸，所述的有机酸优选酒石酸。所述的酸优选以其水溶液的形式使用，当所述的酸以其水溶液的形式使用时，所述的酸的水溶液的质量百分浓度优选1％～10％，进一步优选1％～5％，所述的质量百分比是指酸的质量占酸的水溶液总质量的百分比。所述的酸的水溶液与所述的步骤2得到的夏天无总生物碱的提取物的体积比值优选5～10，进一步优选5～8。步骤3优选包括干燥的步骤，将所述的纯化后的夏天无总生物碱提取物的溶液干燥得到纯化后的夏天无总生物碱提取物；所述的干燥可以按照本领域中该类操作的常规方法和条件。

步骤4中，所述的pH优选为9～11。所述的调节pH优选采用无机碱进行调节，所述的无机碱优选氢氧化钠或氢氧化钾，所述的无机碱可以以其水溶液的形式使用，当所述的无机碱以其水溶液的形式使用时，所述的无机碱的水溶液的质量浓度优选3％～15％，进一步优选4％～10％，所述的质量浓度是指无机碱的质量占无机碱水溶液总质量的百分比。步骤4优选包括干燥的步骤，所述的干燥可以按照本领域中该类操作的常规方法和条件。

步骤5中，所述的重结晶可以采用本领域中该类操作的常规方法和条件。所述的重结晶采用的溶剂优选醇类溶剂和/或卤代烃类溶剂，所述的醇类溶剂优选甲醇和/或乙醇，所述的卤代烃类溶剂优选氯代烃类溶剂，所述的氯代烃类溶剂优选氯仿。步骤5优选包括干燥的步骤，所述的干燥可以按照本领域中该类操作的常规方法和条件。

方法一制得的夏天无总生物碱提取物，其中，总生物碱提取物中各组分的重量百分比分别为：原阿片碱：15％～40％；延胡索乙素：10％～40％；毕扣扣灵：0～10％(不包括0)；盐酸巴马汀：0.01％～2％；紫堇尔明：2％～10％；夏无宁碱：15％～30％；其他生物碱及提取物：1％～5％。

方法一所述的夏天无总生物碱提取物，采用HPLC法测定，总生物碱含量为60％～100％，其中，六个主碱总含量占夏天无总生物碱提取物的95％以上。

步骤(1)中，所述的夏天无的超临界提取物，若为专利CN101058576A中报道的夏天无的超临界提取方法得到的，则夏天无总生物碱的质量百分含量为50％～100％，所述的质量百分含量是指夏天无的超临界提取物中总生物碱的质量占夏天无的超临界提取物质量的百分比。夏天无总生物碱中主要生物碱组成比例如下：原阿片碱15％～35％，延胡索乙素10％～25％，毕扣扣灵5％～15％，盐酸巴马汀0.05％～0.2％，紫堇尔明5％～15％，夏无宁碱15％～30％，其他生物碱及提取物10％～25％。

步骤(1)中，所述的溶剂可以采用本领域中该类反应水解反应的常规溶剂，本发明中特别优选醇类溶剂和/或酮类溶剂，所述的醇类溶剂优选甲醇和/或乙醇，进一步优选乙醇；所述的酮类溶剂优选丙酮。

步骤(1)中，所述的夏天无的超临界提取物与所述的溶剂的质量体积比优选0.002g/mL～0.2g/mL，进一步优选0.02g/mL～0.01g/mL。

步骤(1)中，所述的碱可以为本领域中该类水解反应的常规碱，本发明中特别优选无机碱，所述的无机碱优选氢氧化钠或氢氧化钾，所述的无机碱优选以其水溶液的形式参与反应，所述的无机碱水溶液的摩尔体积浓度优选0.1mol/L～2mol/L，进一步优选0.5mol/L～0.8mol/L，所述的摩尔体积浓度是指无机碱的摩尔数与无机碱的水溶液体积的比例。

步骤(1)中，所述的碱与所述的夏天无的超临界提取物的摩尔比优选1：3～1：6。

步骤(1)中，所述的水解反应的温度可以为本领域中该类反应的常规温度，本发明中特别优选20℃～60℃，进一步优选20℃～30℃。

步骤(1)中，所述的水解反应的进程可以采用本领域中该类反应的常规监测方法进行监测(如HPLC)，以毕扣扣灵消失时为反应的终点，优选反应时间1h～2h。

步骤(2)中，所述的高速离心分配色谱仪可以为本领域中的常规高速离心分配色谱仪，优选厂家为法国RousseletRobatel生产的型号为FCPCA或FCPCC的高速离心分配色谱仪。

步骤(2)中，所述的高速离心分配色谱仪的转速优选1200rpm/min～2000rpm/min。

步骤(2)中，所述的高速离心分配色谱仪的流速优选2.0mL/min～6.0mL/min；所述的流速是指夏天无超临界提取物与溶剂体系形成的混合液在高速离心分配色谱仪中的流动速度。

步骤(2)中，所述的高速离心分配色谱法的溶剂体系优选采用乙酸乙酯与水的混合溶剂，或者氯仿与水的混合溶剂；所述的乙酸乙酯与水的混合溶剂中乙酸乙酯与水的体积比优选1：1～5：1；所述的氯仿与水的混合溶剂中氯仿与水的体积比优选1：1～5：1。

步骤(2)中，所述的高速离心分配色谱仪的上样浓度优选20mg/mL～120mg/mL；所述的上样浓度是指夏天无超临界提取物的质量与所述的溶剂体系体积的比例。

本发明中，所述的夏天无总生物碱中毕扣扣灵的去除方法，毕扣扣灵的去除率为98％以上，其余各碱的回收率高达90％以上。

本发明中，步骤(2)优选包括以下具体步骤：

步骤①：将所述的溶剂体系充分混合，分别取上相和下相；

步骤②：以下相为固定相，上相为流动相，将步骤(1)中得到的夏天无总生物碱中的毕扣扣灵羧酸盐除去；

步骤③：收集夏天无总生物碱即可。

步骤③中，所述的收集样品优选以282nm检测波长进行收集样品。

步骤③中，优选将收集制备好的样品除去溶剂得到夏天无总生物碱，所述的除去溶剂优选在减压的条件下进行，所述的除去溶剂的压强优选-0.06Mpa～-0.1Mpa；所述的除去溶剂的温度优选30℃～60℃。

本发明还提供了上述夏天无总生物碱中毕扣扣灵的去除方法得到的夏天无总生物碱。

本发明还提供了上述夏天无总生物碱中毕扣扣灵的去除方法得到的夏天无总生物碱在制备治疗和/或预防脑缺血或再灌注造成的神经元细胞损伤的疾病的药物中的应用。

本发明中，所述的脑缺血或再灌注造成的神经元细胞损伤的疾病包括脑血栓和脑卒中。

在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明对FCPC方法去除夏天无总生物碱中毕扣扣灵的工艺进行优化，并结合实际生产条件，确定合理的工艺参数，旨为后续夏天无生物碱的活性研究提供物质基础，同时使工业化制备低毒性高活性夏天无总生物碱原料药成为可能。本发明所使用的技术“FCPC”是指高速离心分配色谱，它是一种液液分配色谱。本发明的夏天无总生物碱中毕扣扣灵的去除方法步骤简单、时间短、去除率高、得到的夏天无总生物碱中毕扣扣灵含量低，适合于临床应用，也适合于大规模工业化生产。

附图说明

图1为实施例4的夏天无总生物碱去除毕扣扣灵的FCPC(高速离心分配色谱)色谱图。

图2为夏天无总生物碱中五种生物碱(毕扣扣灵、夏无宁碱、普鲁托品、延胡索乙素和巴马汀)对照品的HPLC(高效液相色谱)谱图。

图3为夏天无超临界提取物HPLC(高效液相色谱)谱图。

图4为实施例4得到的夏天无总生物碱去除毕扣扣灵的HPLC(高效液相色谱)谱图。

图5为XTW-SFE及XTW-SFE-RB对PC12细胞LDH释放率的影响图，其中，与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

图6为XTW-SFE及XTW-SFE-RB对PC12细胞凋亡率的影响图，其中，与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

图7为XTW-SFE及XTW-SFE-RB对PC12细胞活力(％)的影响图，其中，与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，与阴性组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

图8为CO₂超临界萃取和膜分离相耦合的萃取过程的示意图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

原材料和试剂

超临界萃取仪HA121-50-01-C(江苏南通华安超临界有限公司)，AgilentHP1260型高效液相色谱仪、四元梯度泵、Hpcheme色谱工作站。MSU224S-100-Duz天平(Sartorius)；高速离心分配色谱(FCPC)(Kromaton,RousseletRobatel)；SHIMDZULC-10AD泵；HD-21-2紫外检测器(上海嘉鹏科技有限公司)；SHIMDZU-7725i进样器。

用于以下实例1至13夏天无的总生物碱的制备：

取夏天无的干燥块茎，粉碎成20目～100目的药材粉末；取药材粉末一定量，加入氨水，拌至pH8～10；将药材投入萃取釜中，在萃取温度40℃～75℃，解析釜Ⅰ温度30℃～70℃，解析釜Ⅱ温度30℃～70℃时，萃取压力30MPa～50MPa下萃取，萃取过程中连续加入乙醇作为夹带剂，加入流速为260mL/h；当萃取2～3小时后，停止萃取，从解析釜Ⅰ得到总生物碱提取物，即为夏天无总生物碱提取物。以下所有实例均采用同一批样品进行，其中毕扣扣灵含量为7.81％，夏无宁碱含量为19.21％，原阿片碱含量为5.43％，延胡索乙素含量为18.12％，巴马汀含量为0.12％。

检测方法

定量称取各生物碱对照品，用流动相A(％)：B(％)＝88：12(所述的％表示体积百分比)溶解，配制各浓度如下的毕扣扣灵0.0532mg/mL，夏无宁碱0.1202mg/mL，原阿片碱0.0764mg/mL，延胡索乙素0.1254mg/mL，巴马汀0.0446mg/mL对照品溶液。夏天无总生物碱中各标准物质HPLC(高效液相色谱)谱图见图4；夏天无超临界提取物中各生物碱的HPLC(高效液相色谱)谱图见图5。

色谱条件如下：色谱柱：Discovery(5μm×250mm)。检测条件为A相：8mL三乙胺，30mL冰醋酸加至水中定容到1000mL；B相：甲醇：乙腈＝1：4；洗脱流动相比例见表1。流速：1mL/min。检测波长：282nm。

表1流动相比例

时间(min)A(％)B(％)08812508812757525

实施例1

将夏天无超临界总生物碱提取物配制成浓度分别为0.05g/mL，0.02g/mL，0.01g/mL，0.002g/mL的无水乙醇溶液。发现0.05g/mL的夏天无超临界提取物溶液含有许多油状不溶物，在加热超声的条件下也无法溶解完全。取各浓度溶液20mL，在0.05g/mL，0.02g/mL，0.01g/mL，0.002g/mL的夏天无超临界提取物无水乙醇溶液的分别加入浓度为0.5mol/LNaOH水溶液5mL～10mL，搅拌静置过夜色。次日，减压干燥，分别加入25mL双蒸水，超声混匀。室温，移于分液漏斗，用乙酸乙酯25mL萃取3次至无色。旋干后取0.05g，用流动相溶解并定容至25mL，分别注入色谱仪，进行结果分析。

在0.05g/mL浓度下，毕扣扣灵的去除率较其余几个浓度低，这可能是由于没有溶解完全造成的。其余几个浓度的去除率无显著差异。

实施例2

取3份0.5g夏天无超临界总生物碱提取物，分别溶于25mL无水乙醇，完全溶解以后，分别加0.1mol/LNaOH，0.5mol/LNaOH，0.8mol/LNaOH5mL～10mL。静置过夜，减压干燥，加入双蒸水，超声混匀。室温，移于分液漏斗，用等量乙酸乙酯萃取3次至无色。旋干后分别注入色谱仪，进行分析。当NaOH在0.5mol/L～0.8mol/L左右，反应可以进行完全，具体数据见表2。

表2碱的浓度对毕扣扣灵去除率的影响表

不同碱浓度(mol/L)样品含量0.100.500.801.52.0毕扣扣灵(％)7.815.210.780.810.830.86

实施例3

取3份0.5g夏天无超临界总生物碱提取物，分别溶于25mL无水乙醇，完全溶解以后，分别加入5mL～10mL0.5mol/NaOH，常温下反应0.5h，1h，2h旋蒸干燥，加入双蒸水，超声混匀。室温，移于分液漏斗，用等量乙酸乙酯萃取3次至无色。旋干后注入色谱仪，进行分析。当反应时间大于1h时，毕扣扣灵含量较低，反应较完全，具体数据见表3。

表3水解反应的时间对毕扣扣灵去除率的影响表

不同反应时间样品含量0.5h1h2h毕扣扣灵(％)7.814.330.750.67

实施例4

取3份0.5g夏天无超临界总生物碱提取物，分别溶于25mL无水乙醇，完全溶解以后，分别加入5mL～10mL0.5mol/NaOH,分别置于20℃，40℃，60℃水浴锅中，反应1h。旋蒸干燥，加入双蒸水，超声混匀。室温，移于分液漏斗，用等量乙酸乙酯萃取3次至无色。旋干后约分别注入色谱仪，进行分析。常温20℃下毕扣扣灵即可反应完全，但不同温度下其余各碱的回收率略有不同，具体数据见表4。

表4水解反应的温度对毕扣扣灵去除率的影响表

不同反应温度样品含量20℃40℃60℃毕扣扣灵(％)7.810.770.630.65

实施例5

取3份0.5g夏天无超临界总生物碱提取物，分别溶于25mL无水乙醇，完全溶解以后，分别加入5mL～10mL0.5mol/NaOH，常温静置2h，旋蒸干燥，加入25mL双蒸水，超声混匀。室温，移于分液漏斗，A组第一次用乙酸乙酯50mL萃取，第二第三次分别用25mL萃取。B组第一次用乙酸乙酯37.5mL萃取，第二第三次分别用25mL萃取。C组第一次用乙酸乙酯25mL萃取，第二第三次分别用25mL萃取。每组分别旋干称重，定容，注入色谱仪，HPLC分析。第一次萃取得到的浸膏各生物碱含量最高，萃取次数越多，可能由于可逆反应，水相中的盐又还原回成毕扣扣灵形式。考虑到毕扣扣灵含量以及其余各碱的含量，以及工业化生产的需要，分别以水体积2倍的有机溶剂和水体积1倍的有机溶剂萃取两次，合并有机溶剂即可。

实施例6

由于酯化反应是可逆反应，且乙酸乙酯中可能含有残留的NaOH，于是再考察加入水洗萃取液对其影响。

称取0.5g样品，分别溶于25mL无水乙醇，完全溶解以后，分别加入5mL～10mL0.5mol/NaOH，常温静置2h，旋蒸干燥，加入25mL双蒸水，超声混匀。室温，移于分液漏斗，第一次用50mL乙酸乙酯萃取，第二次用25mL乙酸乙酯萃取。合并两次萃取液，分成等体积两份，一份直接减压蒸干，得样品。另一份加入移入分液漏斗加入同等体双蒸水混匀，静置分层，取有机层减压蒸干，得样品，具体数据见表5。

表5萃取方式对毕扣扣灵去除率的影响表

含量无水洗有水洗回收率无水洗有水洗毕扣扣灵(％)0.710.47毕扣扣灵(％)7.623.19

实施例7

称取0.5g样品，分别溶于25mL无水乙醇，加入0.5mol/L的氢氧化钠水溶液8mL，然后在常温的条件下反应1小时。反应完成后，将反应液减压蒸干，用同25mL水将残渣混匀。室温，移入分液漏斗，第一次用37.5mL乙酸乙酯萃取，第二次用25mL萃取。将两次萃取液混合，移于分液漏斗，加等体积的水混匀，静置分层，取有机层减压蒸干即得去除毕扣扣灵的夏天无总生物碱。毕扣扣灵的去除率为99.8％，其余各碱的回收率均大于92.5％，总生物碱含量达99％，其中，夏无宁碱34.2％，原阿片碱20.1％延胡索乙素43.5％，盐酸巴马汀1.5％。提取物干燥后呈粉末状，水溶性增加，生物利用度大大提高。

实施例8

称取0.5g样品，分别溶于25mL无水乙醇，加入0.5mol/L的氢氧化钠水溶液4mL，然后在30℃的条件下反应两小时。反应完成后，将反应液减压蒸干，用同夏天无超临界提取物无水乙醇溶液体积的水将残渣混匀。室温，移入分液漏斗，第一次用50mL乙酸乙酯萃取，第二次用25mL萃取。将两次萃取液混合，移于分液漏斗，加等体积的水混匀，静置分层，取有机层减压蒸干即得去除毕扣扣灵的夏天无总生物碱。毕扣扣灵的去除率为99.2％，其余各碱的回收率均大于92.8％，总生物碱含量达99％，其中，夏无宁碱33.8％，原阿片碱20.5％延胡索乙素43.7％，盐酸巴马汀1.4％。提取物干燥后呈粉末状，水溶性增加，生物利用度大大提高。

实施例9

称取0.5g样品，分别溶于25mL无水乙醇，加入0.5mol/L的氢氧化钠水溶液4mL，然后在在常温下反应两小时。反应完成后，将反应液减压蒸干，用同夏天无超临界提取物无水乙醇溶液体积的水将残渣混匀。室温，移入分液漏斗，第一次用50mL乙酸乙酯萃取，第二次用25mL萃取。将两次萃取液混合，移于分液漏斗，加等体积的水混匀，静置分层，取有机层减压蒸干即得去除毕扣扣灵的夏天无总生物碱。毕扣扣灵的去除率为98.9％，其余各碱的回收率均大于93.5％，总生物碱含量达99％，其中，夏无宁碱33.7％，原阿片碱20.9％延胡索乙素43.3％，盐酸巴马汀1.6％。提取物干燥后呈粉末状，水溶性增加，生物利用度大大提高。

实施例10

取夏天无超临界提取物100g，加入无水乙醇5L，配制成0.02g/mL无水乙醇溶液，加入0.8mol/L的氢氧化钠水溶液1.5L，然后在30℃的条件下反应两小时。反应完成后，将反应液减压蒸干，用5L水将残渣混匀。室温，移入分液漏斗，第一次用7.5L的乙酸乙酯萃取，第二次用等5L萃取。将两次萃取液混合，移于分液漏斗，加等体积的水混匀，静置分层，取有机层减压蒸干即得去除毕扣扣灵的夏天无总生物碱。毕扣扣灵的去除率为99.3％，其余各碱的回收率均大于94.5％。该实验为放大实验，证明该方法在放大的条件下，实验结果不受放大条件影响，去除率仍较高，实验效果好。HPLC图见图6。

对比实施例1

采用专利CN102475743A公开的方法，取前述方法制备同一批样品4g，将此夏天无总生物碱提取物溶解于10mLDMSO中，然后与4g/mL的NaOH液1mL混合，混合液澄清。将混合液于35℃下磁力搅拌30分钟后转入250mL分液漏斗中，向其中加入80mLCHCl₃，再向其中添加80mL水，震荡后静置待其分层后分出下层CHCl₃。再次向分液漏斗中加入80mLCHCl₃，震荡，静置，分层后分出下层CHCl₃，重复此操作一次。合并3次CHCl₃萃取液，减压回收溶剂，得浸膏2.0g，在这一操作过程中，CHCl₃极容易发生乳化，静置时间长，且不容易破乳，乳化层致样品损失大，回收率，经HPLC分析发现此浸膏中毕扣扣灵去除率为85％，低于本发明所能达到的98％以上。且该实验只能进行小试，大规模的中试中乳化现象更加严重，而且夏天无总生物碱的回收率低于40％，到的无法满足产业化对去除毕扣扣灵样品的需求。

用于以下实例11至实施例14夏天无超临界提取物的制备：

取夏天无的干燥块茎，粉碎成20～100目的药材粉末；取药材粉末一定量，加入氨水，拌至pH8～10；将药材投入萃取釜中，在萃取温度40～75℃，解析釜Ⅰ温度30～70℃，解析釜Ⅱ温度30～70℃，萃取压力30～50MPa下萃取，萃取过程中连续加入乙醇作为夹带剂，加入流速为260mL/h；当萃取2～3小时后，停止萃取，从解析釜Ⅰ得到的夏天无总生物碱提取物，作为进一步研究的样品。以下所有实施例中的所用夏天无的总生物碱为同一批样品，各碱含量如下：毕扣扣灵9.26％，夏无宁碱14.79％，普鲁托品21.49％，延胡索乙素23.18％，巴马汀0.09％。

样品前处理

在夏天物超临界提取物中加入1mol/L氢氧化钠溶液进行反应，反应完成后，将反应液，在-0.1MPa压强下，在50℃温度下，减压除去溶剂，即得进样样品。夏天无总生物碱中五种生物碱(毕扣扣灵、夏无宁碱、普鲁托品、延胡索乙素和巴马汀)对照品的HPLC(高效液相色谱)谱图见图2；夏天无超临界提取物HPLC(高效液相色谱)谱图见图3。

检测方法

定量称取各生物碱对照品，用流动相A(％)：B(％)＝88：12(所述的％表示体积百分比)溶解，配制各浓度如下的毕扣扣灵0.0532mg/mL，夏无宁碱0.1202mg/mL，普鲁托品0.0764mg/mL，延胡索乙素0.1254mg/mL，巴马汀0.0446mg/mL对照品溶液。

色谱条件如下：色谱柱：Discovery(5μm×250mm)。检测条件为A相：8mL三乙胺，30mL冰醋酸加至水中定容到1000mL；B相：甲醇：乙腈＝1：4；洗脱比例见表1。流速：1mL/min。检测波长：282nm。

表1流动相比例

时间(min)A(％)B(％)08812508812757525

FCPC操作方法

分别将各种溶剂按其比例加入分液漏斗中，剧烈震荡使各溶剂充分混合，平衡后，分别取为上相和下相，使用前用超声脱气30分钟。在Ascending模式下，用低转速，高流速(流速8ml/min，600rpm，)将FCPC柱内充满固定相(下相)。待充满固定相后，在各以descending和ascending模式下，流速8ml/min,转速600rpm泵入2min以排除气泡，再将仪器调回ascending模式，调节参数至需要的流速和转数开始泵入流动相，直至两相平衡，即可进样。

Ascending模式：以密度较大的下相作为固定相，密度较小的上相作为流动相。

Descending模式：以密度较小的上相作为固定相，密度较大的上相作为流动相。

实施例15

将碱化后的超临界夏天无生物碱提取物，选取选定三个因素进样量20mg/mL，50mg/mL，80mg/mL，转速1200r/min，1600r/min，2000r/min，流速1mL/min，2mL/min，3mL/min的三个水平以毕扣扣灵去除率为评价指标进行正交L₉3³实验。对毕扣扣灵去除率的影响为：转速>流速>进样浓度。

实施例16

选定氯仿：水体积比为2：1系统为分离系统，按其比例分别将各种溶剂加入分液漏斗中，剧烈震荡各溶剂充分混合，平衡后，分别取上相和下相。在Ascending模式下，流速8.0mL/min，600rpm，将FCPC柱内充满下相(固定相，64ml)；改变模式，在Descending模式下，流速8.0mL/min，600rpm，充入下相64mL。在Ascending模式下，将碱化后的超临界夏天无生物碱提取物用上相或下相溶解配制成浓度为50mg/mL的样品溶液进样，在1600r/min，3mL/min，仪器参数下进行对毕扣扣灵的分离。在该条件下可以使毕扣扣灵的去除率达到98.42％，而其余各碱的回收率达到90％以上,总生物碱含量达99％。提取物干燥后呈粉末状，水溶性增加，生物利用度大大提高。

实施例17

选定氯仿：水体积比1：1系统为分离系统，按其比例分别将各种溶剂加入分液漏斗中，剧烈震荡各溶剂充分混合，平衡后，分别取上相和下相。在Ascending模式下，流速8.0mL/min，600rpm，将FCPC柱内充满下相(固定相，64mL)；改变模式，在Descending模式下，流速8.0mL/min，600rpm，充入下相64mL。在Ascending模式下，将碱化后的超临界夏天无生物碱提取物用上相或下相溶解配制成浓度为80mg/mL的样品溶液进样，在1200r/min，2mL/min，仪器参数下进行对毕扣扣灵的分离。在该条件下可以使毕扣扣灵的去除率达到98.29％，而其余各碱的回收率达到90％以上，总生物碱含量达99％。提取物干燥后呈粉末状，水溶性增加，生物利用度大大提高。

实施例18

选定乙酸乙酯：水＝3：1系统为分离系统，按其比例分别将各种溶剂加入分液漏斗中，剧烈震荡各溶剂充分混合，平衡后，分别取上相和下相。在Ascending模式下，流速8.0mL/min，600rpm，将FCPC柱内充满下相(固定相，64mL)；改变模式，在Descending模式下，流速8.0mL/min，600rpm，充入下相64mL。在Ascending模式下，将碱化后的超临界夏天无生物碱提取物用上相或下相溶解配制成浓度为30mg/mL的样品溶液进样，在1600r/min，4mL/min，仪器参数下进行对毕扣扣灵的分离。在该条件下可以使毕扣扣灵的去除率达到98.94％，而其余各碱的回收率达到90％以上，总生物碱含量达99％。提取物干燥后呈粉末状，水溶性增加，生物利用度大大提高。FCPC图见图1，HPLC图见图4。

实施例19

最佳工艺，根据FCPC转鼓体积(50ml与200ml)，将上样量进行线性放大。以320mg，流速8mL/min,转速600mL/min进行三次重复实验。通过FCPC分离后，能得到去除BI的夏天无总生物碱约260mg.三次重复实验毕扣扣灵去除率均达98％以上。其余各碱的回收率均大于90％。

效果实施例1半数致死量(LD₅₀)试验

将毕扣扣灵，夏天无超临界提取物(XTW-SFE)和去除毕扣扣灵夏天无超临界提取物(XTW-SFE-RB)分别以无水乙醇溶解后，与羟丙基倍他环糊精(HP-β-CD)的无水乙醇溶液混合后搅拌，最后减压回收溶剂得粉末状可溶于水的生物碱包合物。清洁级昆明种小鼠，每剂量组10只小鼠，雌雄各半，体重18g～22g，(给药前禁食16h，自由饮水。用水溶解样品等体积(10mL/kg)不等浓度一次性灌胃。给药后立即观察和记录中毒症状和死亡情况，持续观察7天，计算LD₅₀、LD₅₀的95％平均可信限(SLD₅₀)。得到XTW-SFE、毕扣扣灵和XTW-SFE-RB的LD₅₀分别为100.5mg/kg、18.6mg/kg和422.1mg/kg，SLD₅₀分别为86.9mg/kg～116.5mg/kg、17.1mg/kg～20.3mg/kg和369.9mg/kg～480.9mg/kg，具体见表2。

表2夏天无超临界提取物(XTW-SFE)、毕扣扣灵和去除毕扣扣灵夏天无超临界提取物(XTW-SFE-RB)的LD50和SLD50的测试结果表

由以上结果可以验证，毕扣扣灵为主要的到致惊厥成分，去除毕扣扣灵的夏天无超临界提取物毒性大大降低，从而保证夏天无作为临床用药的安全性。

效果实施例2

以H₂O₂引起的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)细胞损伤为模型，通过测定细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放率、MTT和细胞凋亡率，观察XTW-SFE、XTW-SFE-RB样品对H₂O₂引起PC12细胞损伤的保护作用。

细胞消化、计数、配制成浓度为1×10⁵个/mL的细胞悬液，细胞培养板中每孔加入2mL细胞悬液(每孔1×10⁵个细胞)；细胞培养板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时；用完全培养基稀释受试样品至所需浓度，每孔加入500μL相应的含药培养基，37℃，5％CO₂培养箱内孵育1h；用完全培养基稀释H₂O₂至25μmol/L，每孔加入500μL相应的含药培养基，同时设立阴性对照组、模型对照组。LDH根据南京凯基生物技术有限公司LDH试剂盒方法测定。测定波长为440nm。实验结果见图5(与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01)。图5结果分析：由图5可见，加入H₂O₂后，与阴性对照组相比，模型组细胞培养液中的LDH漏出量明显升高，说明细胞膜损伤严重，漏出大量LDH，造模成功。XTW-SFE3.125、12.5mg/mL溶度组能显著降低细胞PC12的LDH释放率，与模型对照组相比均具有显著性差异，P<0.01。XTW-SFE-RB三个浓度组与模型对照组相比，LDH释放率显著降低：0.78125mg/mL(P<0.05)；3.125、12.5mg/mL(P<0.01)。XTW-SFE-RB12.5mg/mL浓度组的PC12的LDH释放率与阴性对照组接近，说明细胞膜损伤较轻，具有极好的保护细胞膜的作用。

细胞置于37℃培养箱内继续培养24h，药物作用完后，用0.25％胰酶(不含EDTA)消化收集细胞；用PBS缓冲溶液洗涤细胞二次(离心，2000rpm，5min)收集5×10⁵细胞；加入500μL的BindingBuffer(复性缓冲液)悬浮细胞；加入5μLAnnexinV-FITC(膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素)混匀后，加入5μLPropidiumIodide(碘化丙啶)，混匀；室温、避光、反应5～15min；用流式细胞仪检测(Ex＝488nm；Em＝530nm)细胞凋亡的情况。实验结果见图6(与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01)。图6实验结果分析：模型对照组和阴性对照组相比，H₂O₂导致细胞PC12凋亡率明显，提示H₂O₂诱导PC12细胞凋亡造模成功。XTW-SFE0.78125、3.125、12.5mg/mL各溶度组能显著降低细胞PC12的细l胞凋亡率，XTW-SFE12.5mg/mL浓度组PC12的凋亡率仅为模型对照组的三分之一。XTW-SFE-RB的三个浓度均可使PC12细胞凋亡率显著降低，且随XTW-SFE-RB浓度的增加逐渐降低，差异有统计学意义。这些结果表明XTW-SFE、XTW-SFE-RB能显著降低H₂O₂诱导的PC12细胞凋亡率。所述的PBS缓冲溶液pH为7.4，1LPBS缓冲溶液的配法为：磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)1.44g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.24g，氯化钠(NaCl)8g，氯化钾(KCl)0.2g，溶于800mL蒸馏水，用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1000mL。

效果实施例3MTT法测定PC12细胞活力

将PC12细胞进行实验分组，每组设置6孔，同时平行设置3孔空白对照。加药后分别继续培养24h，弃上清，加入5mg/mL的MTT10L放入培养箱中继续培养4h，终止培养后，小心弃上清，每孔加入DMSO100L摇床震荡10min以终止反应并充分溶解甲瓒颗粒，然后用全自动酶标仪进行比色，波长设为490nm，记录各组OD值(OD测＝OD实–OD空)。阴性组细胞活力记为100％，模型组及给药组细胞活力为其OD值与阴性组OD值的比值。实验重复3次。实验结果见图7(与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与阴性组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01)。图7结果分析：XTW-SFE的三个剂量组均可显著提高H₂O₂损伤PC12细胞的活力(三个剂量组P都小于0.01)。XTW-SFE-RB的三个剂量组中只有两个剂量组能显著提高H₂O₂损伤PC12细胞的活力(3.13g/mL，P＜0.05；12.50g/mL，P＜0.01)。

下列实施例中采用的超临界CO₂萃取和膜耦合的萃取仪按照图8所示的示意图进行装配。实施例20～实施例24为夏天无总生物碱提取物的制备。

实施例20：夏天无总生物碱提取物的制备

取夏天无的干燥块茎，粉碎，得到粒度为10目～40目的药材粉末；取药材粉末300g，加入体积比为6％氨水作为碱化剂(所述的体积比是指氨水试剂的体积占氨水溶液总体积的百分比，氨水试剂的质量浓度为25％～28％，所述的质量浓度是指氨气的质量占氨水试剂总质量的百分比)，用量为夏天无药材重量的50％，浸润2h；将药材投入超临界CO₂萃取和膜耦合(孔径为0.8微米的超滤膜)的萃取仪中，以甲醇为夹带剂，萃取30分钟后，停止萃取，得到总生物碱提取物，干燥，即得。高效液相色谱法测定总生物碱含量为98.47％。经HPLC测定，其重量百分比组成包括：原阿片碱：34.89％，延胡索乙素：24.56％，毕扣扣灵：3.51％，盐酸巴马汀：1.84％，夏无宁碱：19.77％，紫堇尔明：9.58％，其他碱含量4.32％。

实施例21：夏天无总生物碱提取物的制备

取夏天无的干燥块茎，粉碎，得到粒度为20目～40目的药材粉末；取药材粉末300g，加入体积比为10％氨水作为碱化剂(所述的体积比是指氨水试剂的体积占氨水溶液总体积的百分比，氨水试剂的质量浓度为25％～28％，所述的质量浓度是指氨气的质量占氨水试剂总质量的百分比)，用量为夏天无药材重量的60％，浸润1h；将药材投入超临界CO₂萃取和膜耦合(采用孔径为2纳米的纳滤膜)的萃取仪中，以质量百分比为95％乙醇为夹带剂(所述的质量百分比是指乙醇的质量占乙醇水溶液总质量的百分比)，萃取时间1.5h，高效液相色谱法测定总生物碱含量为98.95％。经HPLC测定，其重量百分比组成包括：原阿片碱：30.52％，延胡索乙素：28.93％，毕扣扣灵：0.01％，盐酸巴马汀：0.09％，夏无宁碱：25.64％，紫堇尔明：9.73％，其他碱含量4.03％。

实施例22：夏天无总生物碱提取物的制备方法

取夏天无的干燥块茎，打粉，得到粒度为10目～20目的药材粉末；取药材粉末200g，加入体积比为7％氨水溶液作为碱化剂(所述的体积比是指氨水试剂的体积占氨水溶液总体积的百分比，氨水试剂的质量浓度为25％～28％，所述的质量浓度是指氨气的质量占氨水试剂总质量的百分比)，用量为夏天无药材重量的50％，浸润3h；将药材投入超临界CO₂萃取和膜耦合(采用孔径为0.1微米的中空纤维膜)的萃取仪中，以质量百分比为95％乙醇为夹带剂(所述的质量百分比是指乙醇的质量占乙醇水溶液总质量的百分比)，萃取时间40分钟，得到的总生物碱用质量百分比为1％盐酸水溶液300mL(所述的质量百分比是指氯化氢的质量占盐酸水溶液总质量的百分比)，超声(超声频率为80H_Z)萃取2h，1.0μm滤膜滤过，加入质量百分比为8％氢氧化钾溶液调pH10～11(所述的质量百分比是指氢氧化钾的质量占氢氧化钾总质量的百分比)，过滤得沉淀，高效液相色谱法测定总生物碱含量为98.88％。经HPLC测定，其重量百分比组成包括：原阿片碱：35.68％，延胡索乙素：19.36％，毕扣扣灵：4.64％，盐酸巴马汀：0.61％，夏无宁碱：28.71％，紫堇尔明：8.75％，其他碱含量1.13％。

实施例23：夏天无总生物碱提取物的制备方法

取夏天无的干燥块茎，打粉，得到粒度为20目～40目的夏天无药材粉末；取夏天无药材粉末300g，加入体积比10％氨水作为碱化剂(所述的体积比是指氨水试剂的体积占氨水溶液总体积的百分比，氨水试剂的质量浓度为25％～28％，所述的质量浓度是指氨气的质量占氨水试剂总质量的百分比)，用量为夏天无药材重量的50％，浸润2.5h；将药材投入超临界CO₂萃取和膜耦合(采用孔径为1纳米的复合纳滤膜)的萃取仪中，以质量百分比为95％乙醇为夹带剂(所述的质量百分比是指乙醇的质量占乙醇水溶液总质量的百分比)，萃取1小时后，即得。用质量百分比为1％盐酸水溶液500ml，超声(超声频率60H_Z)萃取1h，0.45μm滤膜滤过，加入质量百分比为10％氢氧化钠溶液调pH9～10(所述的质量百分比是指氢氧化钾的质量占氢氧化钾总质量的百分比)，过滤得沉淀，高效液相色谱法测定总生物碱含量为98.68％。经HPLC测定，其重量百分比组成包括：原阿片碱：20.68％，延胡索乙素：32.16％，毕扣扣灵：8.84％，盐酸巴马汀：0.50％，夏无宁碱：28.71％，紫堇尔明：6.75％，其他碱1.04％。

实施例24：夏天无总生物碱提取物的制备方法

取夏天无的干燥块茎，打粉，得到粒度为30目～40目的夏天无药材粉末；取夏天无药材粉末8000g，加入体积比为10％氨水作为碱化剂(所述的体积比是指氨水试剂的体积占氨水溶液总体积的百分比，氨水试剂的质量浓度为25％～28％，所述的质量浓度是指氨气的质量占氨水试剂总质量的百分比)，用量为夏天无药材重量的70％，浸润24h；将药材投入超临界CO₂萃取和膜耦合(采用孔径为15纳米反渗透膜)的萃取仪中，以质量百分比为95％乙醇为夹带剂(所述的质量百分比是指乙醇的质量占乙醇水溶液总质量的百分比)，萃取时间1h，干燥，即得。再用质量百分比为2％盐酸水溶液300mL(所述的质量百分比是指氯化氢的质量占盐酸水溶液总质量的百分比)，超声(超声频率80H_Z)萃取0.5h，孔径为0.1微米的滤膜滤过，加入质量百分比为10％氢氧化钠溶液调pH9～10(所述的质量百分比是指氢氧化钠的质量占氢氧化钠总质量的百分比)，过滤得沉淀，用甲醇重结晶，高效液相色谱法测定总生物碱含量为99.88％。经HPLC测定，其重量百分比组成包括：原阿片碱：29.28％，延胡索乙素：23.83％，毕扣扣灵：8.52％，盐酸巴马汀：1.90％，夏无宁碱：29.71％，紫堇尔明：4.62％，其他碱2.02％。