检测供体特异性抗体的方法和用于实施所述方法的系统

摘要

提供了用于测定供体特异性抗体在生物样本中的存在或不存在的方法。所述方法包括在足以使受体免疫抗体(如果存在的话)结合供体细胞表面抗原(Ag)的条件下将来自供体的细胞样本与来自受体的生物样本接触以形成免疫抗体-Ag复合物，将所述混合物与在其表面上包含特异性结合免疫抗体-Ag复合物(例如，Ag或免疫抗体)的抗体的珠粒接触，在裂解条件下添加特异性结合结合于珠粒的免疫抗体-Ag复合物的可检测地标记的抗体，和检测结合于免疫抗体-Ag复合物的可检测地标记的抗体的存在或不存在以测定供体特异性抗体在受体的生物样本中的存在或不存在。还提供了用于实施主题方法的系统和试剂盒。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求对2013年3月14提交的美国临时专利申请系列第 61/782,003号(其公开内容通过引用整体并入本文)的提交日期的优先 权。

背景

每年世界上进行100,000多例实体器官移植，包括每年在美国进 行的数万例移植。尽管在免疫抑制和移植后护理方面取决了显著的改 善，但长期的移植物功能不太理想。在美国，死亡和活供体的肾移植 物的经调整的10年异体移植物存活率分别仅为约40％和60％。继发 于抗体介导的排斥(AMR)的早期和晚期移植失败是低移植物存活率 的重要原因。

针对人白细胞抗原(HLA)的抗体是存在于移植候选者或受体的 血液中的循环抗体，其为较早致敏事件(输血、先前的移植或妊娠)的 结果。移植前存在的供体特异性抗体(DSA)可引起超急性排斥和立即 移植物失功，并且可通过移植前交叉配血来评估。在最近几年，监测 针对供体特异性HLA-I类和II类错配的临床相关抗体的移植后发生 的概念一直是移植界内关注的重要领域。无论在移植前还是移植后检 测，当未进行临床治疗时，针对在供体器官上表达的抗原的抗体的存 在都导致对移植器官的免疫攻击，并且增加移植物失功和/或排斥的 风险。DSA攻击，除其它以外，异体移植物的内皮，并且可导致随 后活组织检查证明的AMR以及需要增强的免疫抑制的急性损伤。 DSA发展的进展和相应的临床事件一起损害异体移植物，从而随着 时间的推移导致慢性改变，最终削弱移植物功能和存活。

抗体介导的排斥可表现为因记忆应答或从头抗原体产生而导致 的早期急性过程，或表现为因从头抗体产生而引起的晚期和慢性过 程。在急性期中，通常预先形成导致早期急性排斥的抗体，但从头 DSA也可在早期移植后期间发生，从而导致急性排斥。具有预先形 成的DSA的患者处于显著更大的患有急性AMR的风险中，并且具 有显著更低的移植物存活率。

慢性排应是移植肾失功能(death-censoredgraftloss)的主要原因之 一。同种抗体介导的损伤和修复的反复循环导致异体移植物的微血管 系统的显著变化。具有预先形成的DSA的患者和从头发生DSA的患 者处于增加的患有慢性排斥的风险中。

概述

提供了用于测定供体特异性抗体在生物样本中的存在或不存在 的方法。所述方法包括通过在足以使受体免疫抗体(如果存在的话)结 合供体细胞表面抗原(Ag)的条件下将来自供体的细胞样本与来自受 体的生物样本组合来形成混合物以形成免疫抗体-Ag复合物，将所述 混合物与在其表面上包含特异性结合免疫抗体-Ag复合物(例如，Ag 或免疫抗原)的珠粒混合，在裂解条件下添加特异性结合结合于珠粒 的免疫抗体-Ag复合物的可检测地标记的抗体，和检测结合于免疫抗 体-Ag复合物的可检测地标记的抗体的存在或不存在，以测定供体特 异性抗体在来自受体的生物样本中的存在或不存在。还提供了用于实 施主题方法的系统和试剂盒。

附图简述

当结合附图阅读时，可根据下列详细描述最好地理解本发明。包 括在附图中的是下列图：

图1示意性举例说明用于据本公开内容的一个实施方案测定供 体特异性抗体在生物样本中的存在或不存在的方法。

图2示意性举例说明用于根据本公开内容的第二实施方案测定 供体特异性抗体在生物样本中的存在或不存在的方法。

图3显示包括同时捕获和标记DSA的DSA-FXM实验的结果。 使用区别在于每一个珠粒的内部荧光ID的HLA-I类和II类珠粒，通 过DSA-FXM测试4个样本。因HLA特异性抗体而增强荧光(阳性信 号)示于X轴上。图3，图A：HLA-I类(C-I)和II类(C-II)供体特异性 抗体(DSA)呈阴性(CI-/CII-)；图3，图B：仅C-IIDSA呈阳性(CI-/CII+)； 图3，图C：仅C-IDSA呈阳性(CI+/CII-)；和图3，图D：CI和C-II DSA都呈阳性(CI+/CII+)。

图4显示包括相继捕获和和标记DSA的DSA-FXM实验的结果。 通过DSA-FXM测试阴性AB血清(样本A)和三个阳性血清(样本B、 C和D)。样本A：C-I和C-IIDSA呈阴性；样本B：C-I和C-IIDSA 呈阳性；样本C：仅C-IDSA呈阳性并且C-IIDSA呈阴性；样本D： 仅C-IIDSA呈阳性并且C-IDSA呈阴性。

图5提供DSA-FXM实验的结果。通过FXM、DSA-FXM和 LMX-IgG针对不同细胞数目测试以不同稀释度存在的HLA-Ab阳性 血清(PPS)的混合物。结果显示DSA-FXM是用于检测DSA的最灵敏 的方法并且当与标准方法相比较时使用少得多的细胞(例如可用少至 25,000个细胞来检测DSA)。LMX-IgG在使用单抗原珠粒的Luminex 平台上确定了PPS血清中包含的HLA特异性并且显示的值是平均荧 光强度(MFI)。大于或等于1000MFI的值被认为是阳性的；500-999 MFI的值被认为可能是阳性的(不明确的)。

图6显示DSA-FXM实验的结果。通过DSA-FXM，同时利用盲 攻击和并行地利用定期流式细胞交叉配型(FXM)和在单抗原珠粒上 进行的标准Luminex抗体筛选(LMX-IgG)来测试23个CAP(美国病理 学家学会)外部能力样本。鉴定HLA-I类(C-I)和/或HLA-II(C-II)的供 体特异性抗体(DSA)，并通过LMX-IgG进一步确认大多数DSA。一 些具有低MCS的额外DSA只能用更灵敏的DSA-FXM方法检测到。 外部能力样本是具有已知的特异性的血清和细胞。在从所有参与中心 接收所有结果之前，血清的特异性对于参与者是未知的。

图7提供DSA-FXM实验的结果。7个HLA-DQDSA阳性样本 已被LMX-IgG鉴定，并且已被DSA-FXM确认。历史上，一直不可 能通过任何类型的牵涉细胞或细胞提取物的DSA测定将所有特异性 DSA检测成DQ。

图8显示DSA-FXM实验的结果。6个HLA-DPDSA阳性样本已 被LMX-IgG鉴定，并且已被DSA-FXM确认。

图9提供DSA-FXM实验的结果。3个HLA-CDSA阳性样本已 被LMX-IgG鉴定，并且已被DSA-FXM确认。

图10显示来自DSA-FXM测试法的实验性结果。图A：HLA-I 类(C-I)和II类(C-II)供体特异性抗体(DSA)呈阴性(CI-/CII-)；图B：仅 C-IDSA呈阳性(CI+/CII-)；图C：仅C-IIDSA呈阳性(CI-/CII+)；和 图D：CI和C-IIDSA呈阳性(CI+/CII+)。

图11提供117个利用已知的I类和II类DSA反应性或缺乏其的 单独的DSA-FXM测试的结果，该结果显示与已知的DSA特征谱相 关的反应性的互斥模型。

图12显示针对I类特异性DSA(B7)的FXM、DSA-FXM和 LMX-IgG单抗原珠粒测定的灵敏度比较，该比较显示即使当另两个 测试是阴性时，DSA-FXM亦可检测靶细胞上的特异性HLAI类DSA。

图13显示针对II类特异性DSA(DR4)的FXM、DSA-FXM和 LMX-IgG单抗原珠粒测定的灵敏度比较，该比较显示即使当另两个 测试是阴性时，DSA-FXM亦可检测到靶细胞上的特异性HLAII类 DSA。

图14的图A和B显示针对95个I类DSA(图A)和100个II类 DSA(图B)的FXM比较的DSA-FXM与LMX-IgGSAB结果之间的皮 尔逊相关。图C显示使用IgGDSA作为标准的针对I类和II类的灵 敏度和特异度百分比。图D显示针对7个血清样本(6个个体)的 LMX-IgGSAB、LMX-C1qSAB、FXM和DSA-FXM的比较。与 LMX-SAB的过度反应性相关的差异。结合图15，结果显示LMX-IgG SAB给出假阳性反应(即，当FXM和DSA-FXM为阴性时DSA呈阳 性)。这促成了图15中显示的较低的特异度。

图15显示针对15个患者的FXM与DSA-FXM的比较，所述患 者中有12个通过FXM测定具有未知特异度的针对抗原的自体抗体 (下图)。这些患者中有4个(P12-P-15)具有针对HLA的自体抗体，如 通过DSA-FXM测定的(上图)。

图16显示FXM与DSA-FXM区分因DSA种类(I和/或II)而引起 的阳性反应的能力的比较。DSA-FXM标题：CI珠粒检测所有I类， CIIa检测DQ，CIIb检测所有DR和DP，但仅检测某些DQ。显示了 4个不同类型的结果。1和3类都具有阳性B细胞FXM，但案例1 归因于I类同种抗体，然而案例3归因于II类同种抗体。案例2和4 都具有阳性T和BFXM，但案例2归因于自体抗体，然而案例4归 因于I类同种抗体。

图17的图A显示针对在缓冲液中1:2稀释的和在静脉注射免疫 球蛋白(IVIG)中1:2稀释的血清中的I类DSA的DSA-FXM结果。IVIG 用于对HLA脱敏，降低抗体。常规FXM显示因第二步骤抗-IgG试 剂和IVIG与细胞表面上的未知靶的广泛反应性的存在而导致的IVIG 处理的样本相较于缓冲液(数据未显示)的增加。DSA-FXM显示IVIG 的抑制，因为检测对于HLA是特异的。因此，DSA-FXM显示处理 的功效。图B显示针对在缓冲液中1:2稀释的和在静脉注射免疫球蛋 白(IVIG)中1:2稀释的血清中的II类DSA的DSA-FXM结果。IVIG 用于对HLA脱敏，降低抗体。常规FXM显示因第二步骤抗-IgG试 剂和IVIG与细胞表面上的未知靶的广泛反应性的存在而导致的IVIG 处理的样本相较于缓冲液(数据未显示)的增加。DSA-FXM显示IVIG 的抑制，因为检测对于HLA是特异的。因此，DSA-FXM显示处理 的功效。

图18的图A显示掺有5％IVIG并在不同稀释度上通过 DSA-FXM测试的阳性DSA血清的结果。结果显示IVIG对HLAI类 DSA具有剂量依赖性抑制。图B显示掺有5％IVIG并且在不同稀释 度上通过DSA-FXM测试的阳性DSA血清的结果。结果显示IVIG对 两种HLAII类DSA具有剂量依赖性抑制。

图19显示关于来自经历IVIG脱敏处理以前瞻性地降低/消除鉴 定的潜在活供体的DSA的肾候选者的系列样本的FXM和DSA-FXM 结果。FXM结果显示因IVIG和Rituxan(治疗性抗-CD20，B细胞的 标志物)而引起的增加的MCS值，而DSA-FXM结果在即使在治疗性 抗体存在的情况下亦显示在对于移植是可接受的范围内的对IVIG和 MCS值的抑制(功效)。

定义

“供体特异性抗体”或“DSA”意指存在于受体中的特异性结合供 体抗原(例如，供体细胞表面抗原)的抗体。DSA可以是“预先形成 的”(例如，在接受来自供体的移植物或输血之前存在于受体中)和/或 从头产生的DSA(其由受体响应已怀孕或接受来自一个或多个供体的 移植物或输血而产生)。在一些情况下，DSA可以是结合患者自己细 胞的细胞表面组分的自体DSA(自体抗体)。在某些方面，DSA是补 体结合抗体(CFAb)。在某些方面，DSA是针对HLA抗原的。

主题发明的"亲和试剂"具有对靶分析物具有高结合亲和力的分 析物结合结构域、部分或组分。高亲和力意指至少约10^-4M，通常至 少约10^-6M或更高，例如10^-9M或更高的结合亲和力。亲和试剂可以 是多种不同种类的分子的任一种，只要其当以标记的亲和配体形式存 在时展现对于靶蛋白的必要结合亲和力即可。

这样，亲和试剂可以是小分子或大分子配体。小分子配体意指大 小范围在约50至约10,000道尔顿，通常地约50至约5,000道尔顿， 更通常地约100至约1000道尔顿内的配体。大分子意指大小在分子 量上为约10,000道尔顿或更大的配体。

特别吸引人的是大分子亲和配体是抗体以及其结合片段和模拟 物。当抗体是亲和配体时，它们可来源于多克隆组合物，以使相异在 于特异性的抗体的异源群体各自被相同标签标记。这样，亲和配体可 以是单克隆、寡克隆和/或多克隆抗体。亲和配体可以是抗原结合片 段或模拟物，其中这些片段和模拟物具有对于靶蛋白的必要结合亲和 力。例如，抗体片段诸如Fv、(Fab’)₂和Fab可通过裂解(例如利用蛋 白酶或化学裂解)完整抗体来制备。还吸引人的是重组产生的抗体片 段，诸如单链抗体或scFv，其中此类重组产生的抗体片段保持上述抗 体的结合特征。此类重组产生的抗体片段通常包括主题抗体的至少 VH和VL结构域，只要保持所述主题抗体的结合特征即可。主题发 明的这些重组产生的抗体片段或模拟物可使用任何方便的方法，诸如 美国专利第5,851,829和5,965,371(所述美国专利的公开内容通过引 用并入本文)中描述的方法来容易地制备。

上述抗体或其片段和模拟物可获自商业来源和/或使用方法的技 术来制备，其中产生多克隆抗体、寡克隆抗体、单克隆抗体、其片段 和模拟物，包括其重组衍生物的方法对于本领域普通技术人员来说是 已知的。

“表位”意指特定B细胞和/或T细胞对其作出应答的抗原上的部 位。该术语还可与"抗原决定簇"或"抗原决定部位"互换使用。表位可 在对于表位是独特的空间构象中包含1个或多个氨基酸，诸如3个或 更多个氨基酸。表位可包含1-10个氨基酸，诸如1-5个氨基酸，例 如1、2、3、4或5个氨基酸。测定氨基酸的空间构象的方法在本领 域中是已知的，并且包括例如，X射线衍射晶体分析法和二维核磁共 振。此外，给定的蛋白质中的表位的鉴定可使用本领域中公知的方法 来容易地实现。参见，例如，Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984) 81:3998-4002(快速合成肽以测定给定抗原中的免疫原性表位的益的 一般方法)；美国专利第4,708,871号(用于鉴定和化合合成抗原的表 位的方法)；和Geysen等，MolecularImmunology(1986)23:709-715(用 于鉴定具有对于给定抗体的高亲和力的肽的技术)。可在显示一种抗 体阻断另一种抗体对靶抗原的结合的能力的简单免疫测定中鉴定识 别相同表位的抗体。

"特异性地结合"或“特异性结合”意指抗体对特定抗原或表位的 高亲合力和/或高亲和力结合。结合其特定抗原上的表位的抗体具有 比相同抗体对不同表位(特别地可存在于与相同样本结合的或相同样 本中的分子(作为特定目标抗原)中的不同表位)的结合更大的亲合力 和/或亲和力。然而，补体结合抗体可对不同目标抗原上的各种表位 具有相同或相似的亲合力和/或亲和力。这样，“特异性地结合”或“特 异性结合”无意将给定的补体固定抗体从对不止一种目标抗原的结合 排除。特异性结合目标多肽的抗体能够以微弱但仍可检测的水平(例 如，10％或更少的显示的对目标多肽的结合)结合其它多肽。此类微 弱的结合或本底结合可以例如通过使用适当的对照来容易地与特异 性抗体对目标多肽的结合区别。

"可检测地标记的”抗体意指具有附接的可检测标记的抗体，其中 所述抗体能够特异性结合另一种分子，例如另一种抗体(诸如IgG抗 体)。所述可检测地标记的抗体保持结合特异性。所述可检测标记可 通过化学缀合来附接，或当标记是多肽时，其可通过基因工程技术来 附接。用于产生可检测地标记的抗体的方法在本领域中是公知的。可 检测标记可选自本领域中已知的多种此类标记，包括放射性同位素、 发色团、荧光团、荧光染料、酶(例如，辣根过氧化物酶)、接头分子 或其中或者发出可检测信号(例如，放射性、荧光、颜色)或在将标记 曝光于其底物后发射可检测信号的其它部分或化合物。各种可检测标 记/底物对(例如，辣根过氧化物酶/二氨基联苯胺、生物素/链霉抗生 物素蛋白、荧光素酶/荧光素)、用于标记抗体的方法以及使用标记的 二抗检测抗原的方法在本领域中是公知的。参见，例如，Harlow和 Lane，编辑(UsingAntibodies：ALaboratoryManual(1999)ColdSpring HarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.)。

“分离的”意指存在于与化合物天然存在于其中的环境不同的环 境中的目标化合物。“分离的”意指包括存在于样本内的针对目标化合 物充分富集的和/或其中目标化合物被部分或充分纯化的化合物。术 语“分离的”包括其中化合物无至少一些其通常在其天然状态与之结 合的材料伴随的情况。例如，关于多肽，术语“分离的”通常指完全或 部分缺乏在自然界中通常与其结合的序列的氨基酸分子；或如其在自 然中存在的一样，但具有与其连接的异源序列的序列。

如本文中所用，“纯化的”意指引述的材料包含按重量计至少约 75％的总蛋白，至少约80％是优选的，至少约90％是特别优选的。如 本文中所用，术语“基本上纯的”是指从其天然环境取出的并且至少 60％不含，优选75％不含，最优选90％不含在自然界中与其结合的其 它组分的化合物。

如本文中所用，“来自受体的生物样本”是指从受体分离的组织或 液体的样本，所述样本在本发明的说明书中通常是指可含有供体特异 性抗体的样本，在任选的处理后，可在体外测定中分析所述样本。目 标样本包括，但不限于，血液、血浆、血清、血细胞、尿、唾液、活 检组织和粘液。样本还包括体外细胞培养成分的样本，包括但不限于 因细胞和组织在培养基中的生长而产生的条件培养基，例如，重组细 胞和细胞组分。

“人白细胞抗原”或“HLA”意指主要组织相容性复合物(MHC)内 的基因，其横跨染色体6的短臂上约350万个碱基对。MHC被分成 含有I类、II类和III类基因的3个单独区域。在人中，I类HLA复 合物长度为约2000kb并且含有约20个基因座。在I类区域中，存在 编码命名为HLA-A、HLA-B和HLA-C的良好表征的I类MHC分子 的基因。另外，存在由HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-J、 HLA-X和MIC基因座编码的非经典I类基因。II类区域含有由 HLA-DRB1、3、4、5、HLA-DQA、HLA-DQB和HLA-DPA、HLA-DPB 基因座编码的6个基因家族。这些基因编码命名为HLA-DRB1、3、 4、5、DQ和DP的经典的II类MHC分子的α和β链。在人中，已 在II类中鉴定了由DM、DN和DO基因座编码的非经典基因。III类 区域含有超过36个与免疫应答相关的基因座的异源集合。

术语“确定”、“测量”、“评价”、“评估”和“测定”可互换使用并且 包括定量和定性测定。

术语“固体基底”是指其中可将抗原和/或抗体固定在其上的固体 支持物。示例性固体基底包括多孔板、膜，包括硝酸纤维素膜和聚乙 烯膜、细胞和细胞膜、珠粒、微粒、微球体、微珠等。本发明的方法 可利用微粒、微球体、微珠或任何材料例如二氧化硅、金、胶乳、聚 合物诸如聚苯乙烯、聚砜、聚乙基或水凝胶的珠粒来进行。另外，微 粒、微球体、珠粒或微珠可具有磁性。

术语“补体固定抗体”是指特异性结合抗原或病原体并且起始免 疫系统的补体级联的抗体，所述补体级联提供具有抗原的靶(例如， 细胞)或病原体从生物体的清除。一般地，补体固定抗体是被补体因 子补体因子C1q、补体因子C3经由替代途径等识别和特异性结合的 IgM或IgG抗体。

进一步指出的是，权利要求可被撰定来排除可以是任选的任何元 素。因此，该陈述意欲用作与权利要求要素的描述联合使用此类排他 性术语如“唯一地”、“仅仅”等或使用“否定”限制的在先基础。

详述

提供了用于测定供体特异性抗体在生物样本中的存在或不存在 的方法。所述方法包括通过在足以使受体免疫抗体(如果存在的话)结 合供体细胞表面抗原(Ag)的条件下将来自供体的细胞样本与来自受 体的生物样本组合来形成混合物以形成免疫抗体-Ag复合物，将所述 混合物与在其表面上包含特异性结合免疫抗体-Ag复合物(例如，Ag 或免疫抗原)的珠粒接触，在裂解条件下添加特异性结合结合于珠粒 的免疫抗体-Ag复合物的可检测地标记的抗体，和检测结合于免疫抗 体-Ag复合物的可检测地标记的抗体的存在或不存在，以测定供体特 异性抗体在来自受体的生物样本中的存在或不存在。还提供了用于实 施主题方法的系统和试剂盒。

在更详细地描述本发明之前，应理解，本发明不限于所描述的特 定实施方案，因此当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅为 了描述特定实施方案的目的，并且无意是限定性的，因为本发明的范 围将仅由所附权利要求限制。

当提供值的范围时，应理解，该范围的上限和下限之间的每一个 居间数值(至下限单位的十分之一，除非本文另外清楚地规定)也被明 确地公开。规定的范围内的任何规定的值或居间值与该规定的范围中 的任何其它所述值或居间值之间的每一个较小的范围包括在本发明 中。这些较小范围的上下限可独立地被包括在所述范围中或不包含在 所述范围中，并且其中任一个限值、两个限值中没有一个限值或两个 限值都包括在较小范围内的每一个范围也包含在本发明内，服从于所 述范围内的任何特别排除的限值。在该规定的范围包括该限值的一者 或两者的情况下，排除所包含的限制中的一个或两个的范围也包括在 本发明内。

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与如 由本发明所属的领域中的普通技术人员通常理解的含量义相同的含 义。尽管在实施或测试本发明中能使用与本文描述的那些方法和材料 相似或相等的任何方法和材料，但是现在描述一些潜在的和示例性方 法和材料。本文中提及的任何和所有出版物通过引用并入本文以公开 和描述与出版物结合引用的方法和/或材料。应理解，本公开内容替 代并入的出版物的任何公开内容，直至存在矛盾为止。

必须指出的是，如本文中和所附权利要求中所用，除非另外明确 规定，否则单数形式"一个(a)"、"一种(an)"和"该(the)"包括复数参照物。 因此，例如，"电极"包括多种此类电极，并且"信号"包括参考一个或 多个信号等。

还要指出的是，权利要求可被撰定来排除可以是任选的任何元 素。因此，该陈述意欲用作与权利要求要素的描述联合使用此类排他 性术语如“唯一地”、“仅仅”等或使用“否定”限制的在先基础。

本文中所论述的出版物仅针对它们在本申请提交日之前的公开 内容而提供。此处的任何信息都不应解释为承认本发明不能因为是在 先发明而先于这些出版物。另外，所提供的公开日可能不同于实际的 公开日，这可能需要独立地进行确认。在这类出版物可能规定与本公 开内容的明确或暗含的定义发生冲突的术语的定义的情况下，以本公 开内容为准。

如在阅读本公开内容后对于本领域普通技术人员是很显然的，本 文中描述的和举例说明的单个实施方案的每一个具有可容易地与其 它几个实施方案的任一个的特征分开或组合的分立的组分和特征而 不背离本发明的范围或精神。可以以所引用事件的顺序或以逻辑上可 能的任何其它顺序进行任何引用的方法。

方法

如上所概述的，本发明的方面包括用于测定供体特异性抗体在生 物样本中的存在或不存在的方法。所述方法包括通过在足以使受体免 疫抗体(如果存在的话)结合供体细胞表面抗原(Ag)的条件下将来自供 体的细胞样本与来自受体的生物样本组合来形成混合物以形成免疫 抗体-Ag复合物，将所述混合物与在其表面上包含特异性结合免疫抗 体-Ag复合物(例如，Ag或免疫抗原)的珠粒接触，在裂解条件下添加 特异性结合结合于珠粒的免疫抗体-Ag复合物的可检测地标记的抗 体，和检测结合于免疫抗体-Ag复合物的可检测地标记的抗体的存在 或不存在，以测定供体特异性抗体在来自受体的生物样本中的存在或 不存在。所述方法的各个步骤和方面现将在下文中进行更详细描述。

“供体”意指细胞样本的来源(例如，人来源)。供体可与受体不同 (例如，当DSA可以是同种抗体时)，或供体与受体可以相同(例如， 当DSA可以是自体抗体时)。在某些方面，供体可以是向有此需要的 受体捐赠细胞(例如，血细胞)、组织(例如，角膜、皮肤、骨、心脏瓣 膜、腱、股骨和/或隐静脉、淋巴结、脾等)、器官(例如，肾、心脏、 肝、胰腺、肺、肠等)及其任意组合的候选者。目标供体包括人供体、 非人灵长类动物供体、哺乳动物供体(例如，猪)、非哺乳动物供体和 任何其它目标供体类型。

如本文中所用，来自供体的“细胞样本”是获自供体的包括至少一 个细胞的样本。所述至少一个细胞可以是有核细胞(例如，淋巴细胞 或外周血单核细胞(PBMC))或缺乏细胞核的细胞(例如，红细胞或血小 板)。在某些方面，所述细胞样本是获自供体的的样本，其包括选自 淋巴细胞(例如，T细胞和/或B细胞)、PBMC、红细胞、血小板及其 任意组合的细胞。根据某些实施方案，来自供体的细胞样本来自供体 的组织(例如，淋巴结、脾、角膜、皮肤、骨、心脏瓣膜、腱、股骨 和/或隐静脉等)，来自供体的器官(例如，肾、心脏、胰腺、肺、肝、 肠、眼等)，或此类组织和/或器官的任意组合。可在用于本公开内容 的方法之前将所述细胞样本经历纯化过程。例如，所述细胞样本可以 是基本上纯的淋巴细胞、外周血血单核细胞(PBMC)、红细胞和/或血 小板的样本，所述样本不含可干扰主题方法的混合、接触和/或检测 步骤的组分的。在某些方面，所述方法包括从供体获得细胞样本。

根据某些实施方案，来自供体的细胞样本包括0.001x10⁶至2.0x 10⁶个细胞。在某些方面，来自供体的细胞样本包括1x10⁶个或更少 的细胞，诸如0.5x10⁶个或更少的细胞，0.4x10⁶个或更少的细胞， 0.3x10⁶个或更少的细胞，0.2x10⁶个或更少的细胞，0.1x10⁶个或 更少的细胞，或0.5x10⁵个或更少的细胞。在某些方面，来自供体的 细胞样本包括25,000至200,000个细胞。

“受体”意指生物样本的来源。受试者可与供体不同(例如，在DSA 可以是同种抗体的情况下)，或受体与供体可以相同(例如，在DSA 可以是自体抗体的情况下)。在某些方面，受体(例如，人受体)可以是 接受来自受体的细胞(例如，血细胞)、组织(例如，角膜、皮肤、骨、 心脏瓣膜、腱、股骨和/或隐静脉等)、器官(例如，肾、心脏、胰腺、 肺、肝、肠、眼等)或其任意组合(例如，以改善医疗病况)的候选者， 或可能已接受来自供体的细胞、组织或器官。目标受体包括人受体、 非人灵长类动物受体、哺乳动物受体、非哺乳动物受体和任何其它目 标受体类型。

来自受体的“生物样本”可以是来自受体的包括或可包括供体特 异性抗体(DSA)的任何生物样本。根据某些实施方案，来自受体的生 物样本选自血清、血浆、血液、唾液、组织及其任意组合。在某些方 面，所述生物样本是100μL或更少的自血清、血浆、血液、唾液及 其任意组合，诸如90μL或更少、80μL或更少、70μL或更少、60μL 或更少、50μL或更少、40μL或更少、30μL或更少、20μL或更少、 或10μL或更少的血清、血浆、血液、唾液及其任意组合。根据一个 实施方案，来自受体的生物样本是30μL或更少的血清、血浆、血液、 唾液及其任意组合。在某些方面，主题方法包括从受体获得生物样本。

通过将来自供体的细胞样本与来自受体的生物样本混合来形成 混合物在足以使受体免疫抗体(例如，DSA)(如果存在的话)结合供体 细胞表面抗原(Ag)以形成免疫抗体-Ag复合物的条件下发生。根据某 些实施方案，所述受体免疫抗体是同种抗体。在其它方面，所述受体 免疫抗体是自体抗体。足以使受体免疫抗体(例如，DSA)(如果存在的 话)结合供体细胞表面抗原(Ag)的条件可通过选择适当的缓冲液(例 如，PBS、TBS等)、去垢剂(例如，Tween)、蛋白质(例如，BSA)、pH、 温度、持续时间等来提供。用于允许抗体对它们的靶抗原的特异性结 合的条件描述于例如Coligan,等，编辑，CurrentProtocolsin Immunology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY(1994-2013)中。在某些方面， 将来自供体的细胞样本(例如，0.2x10⁶个细胞)和来自受体的生物样 本(例如，50μL来自受体的血清)在室温下在适当的缓冲液中孵育约 20分钟，以允许受体免疫抗体结合供体细胞表面抗原。在某些方面， 在室温下进行混合、接触和/或检测步骤。

在某些方面，所述供体特异性抗体是实际的供体特异性抗体。

根据某些实施方案，所述供体细胞表面抗原是HLA抗原，以使 所述供体特异性抗体是抗-HLA抗体。在某些方面，所述供体特异性 抗体是抗-HLAI类和/或抗-HLAII类抗体。根据某些实施方案，所述 供体特异性抗体结合选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、 HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA、HLA-DQB、 HLA-DPA和HLA-DPB的供体细胞表面抗原。

所述供体特异性抗体(如果存在的话)可以是补体结合抗体 (CFAb)。在某些方面，本发明的方法不仅包括测定供体特异性抗体在 生物样本中的存在和/或不存在，而且还包括确定DSA是CFAb还是 非-CFAb。可以例如使用特异性结合CFAb(和/或非-CFAb)的直接或间 接标记的结合剂来将DSA鉴定为CFAb。根据某些实施方案，所述结 合剂是分离的补体成分C1q。可用可与复合物中的任何其它荧光标记 相区别的荧光标记来直接或间接标记C1q。在某些方面，将分离的 C1q缀合于生物素(“Bio-C1q”)，并且可通过添加荧光标记的链霉抗生 物素蛋白(例如，缀合有R-藻红蛋白的链霉抗生物素蛋白(SA-PE))来 检测所述C1q。根据上述实施方案中，如果DSA是补体固定抗体， 则C1q蛋白结合Ag-AbDSA，并且可在所述方法的下游检测步骤(例 如，在流式细胞仪中)过程中在复合物(与结合于DSA的差别地可检 测地标记的抗体一起)中检测到直接或间接标记的C1q，这表明所述 DSA是CFAb。

在形成混合物后，将所述混合物与包含特异性结合抗体-Ag复合 物的供体细胞表面抗原(例如，HLA抗原)的抗体的珠粒接触。取决于 目标供体细胞表面抗原，此类珠粒可以是商购可得的。另外，可使用 本领域中已知的缀合策略将期望类型的珠粒(例如，琼脂糖、胶乳、 聚苯乙烯、磁性或其它类型的珠粒)缀合于结合目标抗原的抗体。参 见，例如，G.T.Hermanson,“BioconjugateTechniques”AcademicPress， 第2版，2008。此外，包括用于将目标抗体缀合于珠粒的试剂和说明 书的试剂盒是商购可得的(例如，抗体偶联试剂盒(Life Technologies,Carlsbad,CA))。所述珠粒可以是具有0.1至20微米， 诸如0.5至10微米，例如，5微米或更小(例如，2.5至5微米)的平 均珠粒直径的微珠。通常在足以使珠粒上包含的抗体特异性结合已与 受体免疫抗体(例如，DSA)结合的供体细胞表面抗原(例如，HLA抗 原)的条件下进行所述接触。提供此类条件可包括选择适当的缓冲剂 (例如，PBS、TBS等)、去后剂(例如，Tween)、蛋白质(例如，BSA)、 pH、温度、持续时间等。用于允许抗体对它们的靶抗原特异性结合 的条件描述于例如Coligan，等，编辑，CurrentProtocolsinImmunology, JohnWiley&Sons,Inc.,NY(1994-2013)中。任选地，在混合与接触步 骤之间洗涤所述混合物。

所述接触步骤导致免疫抗体-Ag复合物，其包括被受体免疫抗体 (例如，DSA)(例如存在的话)；和存在于珠粒上的抗体结合的供体细 胞表面抗原。细胞样本的供体细胞也通过保留在供体细胞表面上的复 合物的供体细胞表面抗原与该复合物结合。在接触步骤后，在裂解条 件下添加特异性结合所述复合物(例如，复合物的受体免疫抗体(例 如，DSA))的可检测地标记的抗体。任选地，在接触步骤与在裂解条 件下添加可检测地标记的抗体之间进行一个或多个洗涤步骤。所述裂 解条件足以裂解与复合物结合的细胞，从而将复合物从供体细胞释 放，从而有助于复合物的下游分析(例如，通过流式细胞术)。在某些 方面，所述裂解条件包括施用包含示踪剂、去垢剂、蛋白酶抑制剂和 BSA的裂解缓冲液。

所述可检测地标记的抗体和裂解条件可通过在接触步骤后向混 合物中添加“裂解混合物”来提供，其中所述裂解混合物在裂解缓冲液 中包含可检测地标记的抗体。可使用任何适当的裂解缓冲液，其可包 括Tris-HCl、EDTA、EGTA、SDS、脱氧胆酸盐、TritonX、NP-40 的一种或多种和/或任何其它所需的裂解缓冲液组分。所述裂解缓冲 液使免疫抗体-Ag复合物保持完整。根据本公开内容的某些方面裂解 缓冲液是非变性的。所述免疫抗体-Ag复合物现包括结合于供体细胞 表面抗原的珠粒结合的抗体、结合于供体细胞表面抗原的受体免疫抗 体(例如，DSA)(如果存在的话)和结合于受体免疫抗体(例如，DSA)(如 果存在的话)的可检测地标记的抗体。可测量来自复合物的可检测地 标记的抗体的可检测信号，所述信号与来自受体的生物样本中的受体 免疫抗体(例如，DSA)的量成比例相关。

如上所示，本公开内容的方法包括检测(例如，定量检测)结合于 免疫抗体-Ag复合物的可检测地标记的抗体的存在或不存在，以测定 供体特异性抗体在来自受体的生物样本中的存在或不存在。所使用的 检测策略可根据存在于可检测地标记的抗体上的可检测标记的类型 而变化。用于实施主题方法的可检测标记包括，但不限于，荧光团、 生色团、酶、接头分子、生物素分子、电子供体、电子受体、染料、 金属或放射性核素。

根据某些实施方案，所述可检测地标记的抗体被荧光标记，并且 包括选自吲哚羰花青(C3)、吲哚羰花青(C5)、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、 Cy7、德克萨斯红、太平洋蓝、俄勒冈绿488、Alexafluor-355、Alexa Fluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor-555、Alexa Fluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor647、AlexaFluor660、Alexa Fluor680、AlexaFluor700、JOE、丽丝胺、罗丹明绿、BODIPY、异 硫氰酸荧光素(FITC)、羧基荧光素(FAM)、别藻蓝蛋白(APC)、藻红 蛋白(PE)、罗丹明、二氯罗丹明(dRhodamine)、羧基四甲基罗丹明 (TAMRA)、羧基-X-罗丹明(ROX)、LIZ、VIC、NED、PET、SYBR、 PicoGreen和RiboGreen的荧光团。

当可检测地标记的抗体被荧光标记时，所述检测可包括检测一个 或多个荧光发射。荧光发射可以任何有用的形式来检测。在某些方面， 所述检测包括将免疫抗体-Ag复合物(其包括珠粒)流过流式细胞仪。

当所述检测包括将受体免疫抗体-Ag复合物流过流式细胞仪时， 根据需要，将所述流式细胞仪构造来通过将复合物暴露于激发光，随 后在一个或多个检测通道中测量每一个复合物的荧光来检测和独特 地鉴定复合物。激发光可来自一个或多个光源，并且可以是窄频或宽 频的。激发光源的实例包括激光、发光二极管和弧光灯。用于鉴定复 合物的检测通道中发射的荧光可在利用单光源激发后测量，或可在用 不同的光源激发后单独地测量。在某些方面，将混合物从其流过的流 式细胞仪包括荧光激发和检测能力，以使可检测地标记的抗体的荧光 标记和与复合物的其它组分结合的任何其它任选的荧光标记各自是 可检测的，并且在通过流式细胞仪查询复合物后是可辨别的。

流式细胞仪还包括数据获取、分析和记录工具，诸如计算机，其 中多数据通道记录来自每一个检测器的由每一个复合物，当其通过传 感区时，发射的光散射和荧光的数据。分析系统的目的是分类和计数 复合物，其中每一个复合物本身表示为一组数据化参数值。可将流式 细胞仪在所选择的参数上设置至触发值。"触发值"是指用于检测参数 的预设阈值。其通常用作用于检测复合物通过激光束的工具。超过所 选择的参数的阈值的事件的检测触发复合物的光散射和荧光数据的 获得。未获得引起低于阈值的反应的被测定的复合物或介质中的其它 组分的数据。触发参数可以是由复合物通过光束引起的前向光散射的 检测。流式细胞仪随后检测和收集复合物的光散射和荧光数据。

如上所述，复合物的流式细胞术分析产生关于复合物的定性和定 量信息。当需要时，上述分析产生混合物中的目标复合物的计数。因 此，流式细胞术分析提供了关于一个或多个不同类型的复合物在混合 物中的数量。

可以任何方便的时间量同时进行混合、接触和检测步骤。根据某 些实施方案，在12小时或更短，诸如11小时或更短，10小时或更 短，9小时或更短，8小时或更短，7小时或更短，6小时或更短，5 小时或更短，4小时或更短，3小时或更短，2小时或更短的时间内 进行本公开内容的方法。

根据某些实施方案，本公开内容的方法包括生成表明供体特异性 抗体是否存在于来自受体的生物样本中的报告。如果DSA存在，则 所述报告可包括关于来自受体的生物样本中的DSA的量的信息。报 告可通过计算机生成，在该情况下任选地将报导显示于计算机的远程 输出设备。

在某些实施方案中，本公开内容的方法用于检测结合存在于来自 供体的细胞样本中的细胞上的供体HLA抗原(例如，HLAI类和/或 HLAII类抗原)的DSA。根据一个实施方案中，通过将包括含有HLA 抗原的供体细胞的细胞样本与来自受体的血清或血浆接触(以使能够 特异性结合供体HLA的任何DSA可结合于供体HLA)来形成混合物。 可在接触步骤之前，洗涤所得的含有DSA-HLA复合物的混合物1次 或多次(例如，3次)。根据该实施方案中，接触步骤包括添加涂覆有 抗-HLA抗体的微珠，以使附接于珠粒的抗-HLA抗体结合于供体细 胞表面上的供体HLAI类和/或II类分子的恒定区。可洗涤现包括结 合于供体HLA抗原的捕获珠粒的所得复合物1次或多次(例如，3次)， 随后继续进行所述方法。根据该实施方案，在裂解条件下添加荧光标 记的抗-IgG抗体(例如，PE-抗-IgG抗体)，以使抗-IgG抗体结合复合 物的DSA。供体细胞的裂解有利于复合物与存在于复合物中的其它 材料分离。随后，可检测来自荧光标记的抗-IgG抗体的荧光，任选地 定量所述荧光，以测定DSA在结合供体HLA的受体血清或血浆中的 存在(和任选地量/浓度)或不存在。在某些方面，所述方法用于查询受 体血清/血浆的DSA的存在或不存在，所述DSA结合HLAI类和/或 II类例如HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-HLA-DRB1、HLA-DRB3、 HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA、HLA-DQB、HLA-DPA和 HLA-DPB。

根据本公开内容的实施方案的方法在图1中进行了示意性举例 说明。根据该实施方案，通过流式细胞仪或Luminex器检测免疫抗体 -Ag复合物。在反应中，将供体细胞与受体血清组合。供体特异性抗 体(DSA)(如果存在的话)特异性结合供体细胞上的抗原(Ag)以形成 DSA-Ag复合物。在裂解条件下，通过缀合有针对与DSA-Ag复合物 中相同的Ag的抗体的珠粒特异性捕获DSA-Ag复合物。利用荧光标 记的第二抗体，通过流式细胞仪或Luminex器检测捕获的DSA-Ag。

根据本公开内容的第二实施方案的方法在图2中进行了示意性 举例说明。根据该实施方案，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测 免疫抗体-Ag复合物。在反应中，将供体细胞与受体血清组合。供体 特异性抗体(DSA)(如果存在的话)特异性结合供体细胞上的抗原(Ag) 以形成DSA-Ag复合物。在细胞裂解后，DSA-Ag复合物通过针对与 DSA-Ag复合物中相同的Ag的抗体被特异性捕获在基底上。连接有 第二抗-IgG抗体的酶结合DSA，并且在酶与底物反应时DSA是可检 测的。本公开内容还提供了该方法的变型(例如，发光测定)。

系统

还提供了用于进行本公开内容的方法的系统。本公开内容的系统 包括样本流体系统，其包括处理器和可操作地连接于处理器的在其上 具有存储的编制程序的计算机可读介质。当通过处理器执行时，所述 存储的编制程序使处理器按程序，通过在足以使受体免疫抗体(如果 有的话)结合供体细胞表面抗原(Ag)的条件下将来自供体的细胞样本 与来自受体的生物样本组合来形成混合物以形成免疫抗体-Ag复合 物。当通过处理器执行时，所述存储的编制程序还使处理器按照程序， 将混合物与在其表面上包含特异性结合免疫抗体-Ag复合物的抗体 的珠粒接触，和在裂解条件下添加特异性结合免疫抗体-Ag复合物的 可检测地标记的抗体。主题系统还包括被构造来测定样本的结合于免 疫抗体-Ag复合物的可检测地标记的抗体的存在或不存在，以测定供 体特异性抗体的存在或不存在。在某些方面，将流式细胞仪以流控方 式偶联于样本流体子系统。

处理器可以是用于报告存储的编制程序的任何适当的处理器。根 据某些实施方案，处理器按程序在子系统将混合物与在其表面上包含 特异性结合免疫抗体-Ag复合物的抗体的珠粒接触之前，使样本流体 子系统洗涤混合物。可选地，或另外地，处理器可按程序在子系统将 混合物与包含特异性结合免疫抗体-Ag复合物的抗体的珠粒接触之 后，但在流式细胞仪测定样本的结合于复合物的可检测的标记的存在 或不存在之前，使样本流体子系统洗涤混合物。

计算机可读介质可以是计算机可读信号介质或计算机可读存储 介质。计算机可读存储介质可以是，例如，但不限于电子、磁性、光 学、电磁、红外线或半导体系统、装置或设备，或上述的任何适当组 合。计算机可读存储介质的更具体实例(非穷举列表)可包括下列实 例：具有一个或多个导线电连接、便携式计算机磁盘、硬盘、随机存 取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦除可编程只读存储器 (EPROM或闪存)、光纤、便携式光盘只读存储器(CD-ROM)、光存储 设备、磁存储设备或上述的任何适当的组合。计算机可读存储介质可 以是任何有形介质，所述介质可含有或存储由本公开内容的系统的样 本流体子系统使用的或与所述样本流体子系统结合使用的程序。

来自供体的细胞样本、供体细胞表面抗原、来自受体的生物样本、 受体免疫抗体(例如，抗-HLADSA)、在其表面上包含特异性结合免 疫抗体-Ag复合物的抗体的珠粒、可检测地标记的抗体、缓冲液、结 合和裂解条件以及流式细胞仪可以是如上文中针对本公开内容的方 法所描述的。

本公开内容的系统可被构造来在方便的时间量中检测DSA的存 在或不存在。根据某些实施方案，主题系统被构造来在12小时或更 短，诸如11小时或更短，10小时或更短，9小时或更短，8小时或 更短，7小时或更短，6小时或更短，5小时或更短，4小时或更短， 3小时或更短，2小时或更短的时间内检测DSA在受体的生物样本中 的存在或不存在。

试剂盒

还提供了包括用于进行本公开内容的方法的一种或多种试剂的 试剂盒。根据一个实施方案，提供了试剂盒，其包括多种在其表面上 包含特异性结合免疫抗体-Ag复合物的抗体的珠粒、特异性地结合免 疫抗体-Ag复合物的可检测地标记的抗体，和使用多种珠粒和可检测 地标记的抗体测定来自供体的细胞样本和来自受体的生物样本以测 定供体特异性抗体在生物样本中的存在或不存在的说明书。主题试剂 盒还可包括其它有用的组分，诸如裂解缓冲液、对照血清或血浆、对 照细胞样本等。在其表面上包含特异性结合免疫抗体-Ag复合物的珠 粒和特异性结合免疫抗体-Ag复合物的可检测地标记的抗体可以是 如上文中针对本公开内容的方法所描述的。

可在单独的管中提供包含在主题试剂盒中的试剂，或者可在单个 管中提供两种或更多种试剂。根据一个实施方案，在单独的管中提供 珠粒和可检测地标记的抗体。在某些方面，在裂解缓冲液中提供可检 测地标记的抗体。

根据一个实施方案，在计算机可读介质上提供包含在主题试剂盒 中的指令，所述指令，当由处理器执行时，使处理器按程序测定来自 供体的细胞样本和来自受体的生物样本以测定DSA在生物样本中的 存在或不存在。

效用

主题方法、系统和试剂盒用于其中期望检测受体的生物样本中的 供体特异性抗体的任何应用。目标受体包括，但不限于，有此需要的 或已接受来自器官或组织供体的器官(例如，肾、肝、心脏等)或组织 植物物的人受体。目标应用包括基于检测和/或定量受体的生物样本 中的DSA的水平的移植后风险评估和/或稀释后监测。

本公开内容的方法区分与供体细胞反应的抗体和与供体细胞上 的HLA分子反应的抗体。先前的流式交叉配型技术是有缺陷的，因 为它们不能进行该重要的区分，其中阳性流式交叉配型结果可能与抗 体与HLA的相互作用完全无关。

主题方法提供可被广泛用于开发许多不同的DSA测定的平台。 来自受体的任何类型的生物样本和任何目标靶细胞可用于确定DSA 存在还是不存在。与现有方法相比较，所述主题方法允许受体抗体以 它们的无任何修饰的天然构型和以高检测特异度和高通量结合供体 抗原。此外，所述方法可在比现有DSA检测法更少的时间内完成， 并且需要更少的供体细胞。由与目标靶抗原无关的抗体引起的本底信 号通过包括结合于目标抗原的DSA的复合物的特异性抗体介导的固 相捕获来消除。

实施例

如可从上文提供的公开内容理解的，本公开内容具有广泛的应 用。因此，提出下列实施例以为本领域普通技术人员提供如何产生和 使用本发明的完整公开内容和描述，所述实施例无意限定被当作本发 明的内容的范围,也不旨在表示下文的实验是所执行的全部或唯一实 验。然而，本领域普通技术人员将容易认识到可被改变或修改以产生 基本上相似的结果的多个非关键参数。已经做出努力以确保关于数字 (例如量、温度等)的正确性，但是应该占有一些错误和偏差。

实施例1：DSA-FM测试法

下列方法可用于实施主题方法的一个实施方案(称为供体特异性 抗体流式细胞交叉配型(“DSA-FXM”))。本示例性方法包括同时捕获 和标记,并且可以2小时或更短时间内完成。

首先，制备排列待测试的FXM样本的96孔布局格式。第二， 按照板布局将0.2x10⁶(在体积上少于250μl)供体细胞分配在96孔板 中的所有预先选定的孔中。以2,000xg离心3分钟。轻叩板并在翻转 板之前在叠纸塔上印迹2次。通过轻轻涡旋重悬浮细胞。按照板布局 向预先选定的孔中添加50μl/孔的每一种血清。轻轻涡旋板并在室温 培养箱(22℃)中孵育20分钟。在孵育过程中制备裂解缓冲液(对于每 一个孔，PE-抗-hIgG和裂解缓冲液于23μl的总体积中)。孵育后，向 每一个孔中添加250μl的3％HBSA，并如先前一样旋转板。轻叩板 并在翻转板之前在叠纸塔上印迹2次。重复洗涤步骤另外2次，每一 次洗涤通过添加250μl的3％HBSA来进行。

在最后一次洗涤(第3次洗涤)时向每一个孔添加5μl捕获珠粒混 合物，如先前一样使用250μl的3％HBSA再次洗涤。向每一个孔添 加23μl裂解混合物(细胞裂解缓冲液和荧光抗体)并轻轻涡旋板。用 一张箔覆盖板，通过轻轻振荡在黑暗中孵育板30分钟。如下在孵育 过程中制备DSA-FXM洗涤缓冲液：制备10mlDSA-FXM洗涤缓冲 液，向9.5ml1XTBS洗涤缓冲液添加0.5ml去垢剂，通过将管颠倒 5次进行混合。

通过向每一个孔添加250μlDSA-FXM洗涤缓冲液洗涤2次，如 先前一样进行洗涤。添加250μlDSA-FXM洗涤缓冲液并如先前一样 洗涤。将珠粒重悬浮于每一个具有200μl流动固定液的孔中，轻轻涡 旋板。将板置于流式细胞柿饼上，并获取珠粒。实验结果示于图3、 图5-9、图11-14和图16中。

对于图3中显示的实验，通过DSA-FXM(同时捕获和标记实施方 案)测试4个样本，并且HLA-I类与II类珠粒的区别在于每一个珠粒 上的荧光ID。因HLA特异性抗体而产生的递增荧光(阳性信号)示于 X轴(FL1通道)上。图3，图A：HLA-I类(C-I)和II类(C-II)供体特异 性抗体(DSA)都呈阴性CI-/CII-)；图3，图B：仅C-IIDSA呈阳性 (CI-/CII+)；图3，图C：仅C-IDSA呈阳性(CI+/CII-)；和图3，图D： CI和C-IIDSA都呈阳性(CI+/CII+)。

如图5中所示，通过FXM、DSA-FXM和LMX-IgG针对不同的 细胞数目测试不同稀释度的HLA-Ab阳性血清(PPS)的汇集物。结果 显示DSA-FXM是用于检测DSA的最灵敏的方法，并且当与标准方 法比较时，使用少得多的细胞(例如可用少至25,000个细胞检测 DSA)。LMX-IgG使用单抗原珠粒在Luminex平台上确定了PPS血清 中包含的HLA特异性，并且显示的值是平均荧光强度(MFI)。

如图6中所示，通过DSA-FXM，同时利用盲攻击和并行地利用 定期流式细胞交叉配型(FXM)和在单抗原珠粒上进行的标准Luminex 抗体筛选(LMX-IgG)来测试23个外部能力CAP样本(美国病理学家学 会)。鉴定HLA-I类(C-I)和/或HLA-II(C-II)的供体特异性抗体(DSA)， 并通过LMX-IgG进一步确认大多数DSA。一些具有低MCS的额外 DSA只能用更灵敏的DSA-FXM法检测到。外部能力样本是具有已 知的特异性的血清和细胞。在从所有参与中心接收所有结果之前，血 清的特异性对于参与者是未知的。图7中所示的数据表明7个 HLA-DQDSA阳性样本已被LMX-IgG鉴定并且已被DSA-FXM确 认。如图8中所示，6个HLA-DPDSA阳性样本已被LMX-IgG鉴定 并且已被DSA-FXM确认。如图9中所示，3个HLA-CDSA阳性样 本已被LMX-IgG鉴定并且已被DSA-FXM确认。

如图11中所示，测试从LMX-IgGSAB测试了解其DSA特异性 的117个血清的集合(包括HLA分型试剂、阴性对照和临床样本)。 获得唯一的阳性或阴性反应。当将DSA-FXM的结果与FXM和 LMX-IgGSAB结果相比较时，DSA-FXM对于I类(图12)和II类(图 13)具有比另外的测试的任一种更优的灵敏度。图14，图A和B分别 给出95个I类和100介II类DSA的总体相关性。图14，图C概述 了相较于LMX-IgGSAB测定的DSA-FXM的灵敏度和特异度。如图 14的图D中显示的，图14的图C比较中获得的降低的特异度归因于 LMX-IgGSAB测定中的假阳性反应而非DSA-FXM测定中的假阴性 反应。

如图15中所，T和B细胞FXM测定在自体抗体存在的情况下 产生非特异性(即，不归因于HLA，未知的靶)阳性结果，然而 DSA-FXM明确地区分针对HLA的自体抗体和区分自体抗体是针对I 类还是II类的。

如图16中所示，DSA-FXM能够区分归因于I类和/或II类同种 抗体以及归因于目前的FXM法一般不能区分的自体抗体的流式细胞 术结果。对于FXM看到的相似结果(例如，案例1和3或2和4)当通 过DSA-FXM测试时具有完全不同的解释。可将DSA-FXM与通过 LMX-IgGSAB获得的特异性I类和/或IIDSA特征谱发生关系，以提 供关于移植前或移植后排斥的风险的预后，然而FXM结果不能。

如图17中对于I类(图A)和II类(图B)所显示的，DSA-FXM能 够显示相较于缓冲液，IVIG处理对种类特异性DSA的抑制。这与在 IVIG输注之前和之后在体内看到的类似。

如图18中对I类(图A)和II类(图B)所显示的，DSA特异性血清 显示也预测体内功效的由IVIG产生的剂量依赖性抑制。

如图1中所示，使用来自经历IVIG脱敏处理以前瞻性地降低/ 消除鉴定的潜在活供体的DSA的肾候选者的系列样本进行FXM和 DSA-FXM。FXM结果显示因IVIG输注的人为行为而导致的增加的 MCS值(即，变得更加阳性)。所述人为行为归因于用作测定的信号的 第二步骤抗体(抗-人IgG)。因为所有IVIG产物是纯化的IgG，因此 FXM结果显示归因于IVIG而非DSA的假阳性增加。Rituxan(治疗性 抗-CD20，B细胞的标志物)也因为B细胞表面上的CD20而在B细 胞FXM中增加MCS值。尽管这不是人为的，但FXM被设计来检测 HLA抗体，而非天然细胞特异性靶。DSA-FXM结果，相反地，即使 在治疗性(抗-CD20)抗体存在的情况下亦显示在对于移植是可接受的 范围内的对IVIG和MCS值的抑制(功效)。

结果计算

使用DSA-FXM分析电子表格记录和进行计算。测定患者血清及 阳性对照的中值信道偏移(MCS)。关于MCS的计算：MCS＝患者血清 (或阳性对照)的中位信道值(MCV)减去阴性对照的中位信道值 (MCV)。在电子表格和计算机上将结果记录为MCS。根据FXM截断 值生成报告以界定阴性或阳性DSA-FXM。

结果和解释

通过来自针对5个不同来源的靶细胞(新鲜/冷冻的PBMC、冷冻 的淋巴结和冷冻的脾细胞)的预先测试的AB男性血清(通常约20个) 的结果(MCS)测定FXM的截断值。通过从AB血清MCV扣除阴性对 照MCV来计算每一个测试的AB血清的MCS；和从所有获得的 MSC(N＝138)计算DSA-FXMMCS的平均值。如下设置DSA-FXM截 断值的标准：MCS值<AB阴性MCS+3SD被解释为“阴性的”；MCS 值>＝AB阴性MCS+3SD被解释为“阳性的”。HLA-IDSA-FXM阳性： MCS>＝61。HLA-IIDSA-FXM阳性：MCS>＝60。

材料和方法

对于FXM法，将0.1x10⁶个PBMC细胞分配至96孔板的每一 个孔中，以1,300xg离心3分钟。轻叩板以除去上清液；将细胞重悬 浮于50μl测试血清中，并在室温培养箱(22℃)中孵育20分钟。在孵 育后，洗涤细胞4次，每一次使用250μl的3％HBSA。添加100μl 含有0.5μg的FITC-抗人IgG(JacksonImmunoResearchLaboratories, Inc.；WestGrove,PA,USA)、0.2μgPerCP-CD3和PE-CD19(BD Biosciences,SanJose,CA,USA)的检测剂混合物。在于室温下孵育另 外30分钟后，洗涤细胞2次，每次使用250μl的3％HBSA，随后将 细胞重悬浮于200μl0.2％的PBS中的多聚甲醛中。在BDFACSCanto II流式细胞仪(BDBiosciences,SanJose,CA,USA)上获得细胞。利用 BDFACSDiva^TM软件分析获得的数据。

对于LMX-IgG方法，按照制造商的说明书(OneLambda,Canoga Park,CA,USA)进行实验。结果显示在不同浓度下通过DSA-FXM都 检测到HLAI类和IIDSA(图5)。

实施例2：DSA-FXM测试

可选地将下列方法用于实施称为供体特异性抗体流式细胞交叉 配型(“DSA-FXM”)的主题方法的一个实施方案。本示例性方法包括相 继捕获和标记。

首先，制备排列FXM设置的96孔布局格式。第二，按照所述 板布局将0.2x10⁶个(体积小于250μl)供体细胞分配在96孔板中的所 有预先选定的孔中。以2,000xg离心3分钟。轻叩板以除去上清液。 轻轻涡旋板，按照所述板布局将50μl/孔的每一个血清添加至预先选 定的孔。轻轻涡旋板并在室温培养箱(22℃)中孵育20分钟。孵育后， 将250μl的3％HBSA添加至每一个孔，并如先前一样旋转。轻叩板， 在翻转板之前将其在叠纸塔上印迹2次。重复洗涤步骤另外2次，每 一次洗涤通过添加250μl的3％HBSA来进行。

在最后一次洗涤(第3次洗涤)时向每一个孔添加5μl含有HLA-I 类和II捕获珠粒的捕获珠粒混合物，如先前一样使用250μl的3％ HBSA再次洗涤。向每一个孔添加23μl裂解混合物并轻轻涡旋板。 用一张箔覆盖板，通过轻轻振荡在黑暗中孵育板30分钟。如先前一 样，洗涤珠粒2次，每一次使用250μlDSA-FXM洗涤缓冲液。用100 ul的洗涤缓冲液中的荧光抗-IgG重悬浮珠粒，将在室温下将板再孵 育另外30分钟。如先前一样洗涤珠粒2次，每一次使用250μl的 DSA-FXM洗涤缓冲液，将所述珠粒重悬浮于含有200μl流动固定液 的每一个孔中，并轻轻地涡旋板。将板置于流式细胞仪上并获得珠粒。 如上所述进行FXM和LMX-IgG法。实验结果示于图4中。如图4 中所示，通过DSA-FXM(相继捕获和标记)测试阴性AB血清(样本A) 和3个阳性血清(样本B、C和D)。样本A：C-I和C-IIDSA呈阴性； 样本B：C-I和C-IIDSA呈阳性；样本C：仅C-IDSA呈阳性，并且 C-IIDSA呈阴性；样本D：仅C-IIDSA呈性，并且C-IDSA呈阴性。

实施例3：DSA-FXM测试

可选地将下列方法用于实施称为供体特异性抗体流式细胞交叉 配型(“DSA-FXM”)的主题方法的一个实施方案。本示例性方法包括相 继捕获和标记。

首先，制备排列FXM设置的96孔布局格式。第二，按照所述 板布局将0.2x10⁶个(体积小于250μl)供体细胞分配在96孔板中的所 有预先选定的孔中。以2,000xg离心3分钟。轻叩板以除去上清液。 轻轻涡旋板，按照所述板布局将50μl/孔的每一个血清添加至预先选 定的孔。轻轻涡旋板并在室温培养箱(22℃)中孵育20分钟。孵育后， 将250μl的3％HBSA添加至每一个孔，并如先前一样旋转。轻叩板， 在翻转板之前将其在叠纸塔上印迹2次。重复洗涤步骤另外2次，每 一次洗涤通过添加250μl的3％HBSA来进行。

添加100μl的荧光抗-IgG以重悬浮细胞，并用一张箔覆盖板； 通过轻轻振荡在黑暗中孵育板30分钟。如先前一样洗涤细胞2次， 每一次使用250μl的DSA-FXM洗涤缓冲液。将细胞重悬浮于25μl 裂解缓冲液，向每一个孔中添加5μl含有HLA-I类和II类捕获珠粒 的捕获珠粒混合物。在室温下孵育板进行另外30分钟。如先前一样 洗涤珠粒2次，每次使用250μl的DSA-FXM洗涤缓冲液，并将珠粒 重悬浮于含有200μl流动固定液的每一个孔中，并轻轻地涡旋板。将 板置于流式细胞仪上并获取珠粒。如上所述进行FXM和LMX-IgG 方法。实验结果示于图10和图11中：图10，图A：HLA-I类(C-I) 和II类(C-II)供体特异性抗体(DSA)呈阴性(CI-/CII-)；图10，图B： 仅C-IDSA呈阳性(CI+/CII-)；图10，图C：仅C-IIDSA呈阳性 (CI-/CII+)；和图10，图D：CI和C-IIDSA呈阳性(CI+/CII+)。

实施例4：自动-DSA-FXM测试

通过FXM，同时利用实施例1中描述的DSA-FXM法针对受体 自已的PBMC细胞测试来自15个受体的自体血清。实验结果示于图 15中：在15个自体交叉配型中，通过DSA-FXM和FXM检测，3 个呈阴性，4个呈阳性；通过FXM检测，仅8个呈阳性，并且证明 通过FXM检测的DSA不是针对HLA抗原的DSA。

实施例5：静脉注射免疫球蛋白(IVIG)脱敏DSA-FXM测试

通过实施例1中描述的DSA-FXM测试法评价IVIG对HLA-DSA 的抑制作用。实验结果示于图17-19中。

对于图17中显示的实验，将5％IVIG掺入两份HLADSA阳性 血清并且通过DSA-FXM体外测试。IVIG对HLAI类和II类DSA的 抑制作用是可测量的。

如图18中所示，将5％IVIG掺入不同稀释度的阳性DSA血清 并且通过DSA-FXM测试其。结果显示IVIG对HLAI类和II类DSA 具有剂量依赖性抑制。

通过DSA-FXM和FXM针对潜在的(但不相容的)活供体细胞测 试来自在IVIG脱敏处理下的肾候选者的一系列样本。如图19中所示， IVIG对HLA-DSA的抑制作用可通过DSA-FXM观察到，但不能通 过FXM观察到。Rituxan(治疗性抗-CD20)对通过DSA-FXM测试产 生的测试结果没有干扰。

虽然为了清楚地理解，已通过举例说明和实例稍许详细地描述了 上述发明，但根据本发明的教导，对于本领域技术人员来说很显然的 是，在不背离所附权利要求的精神和范围下可对本发明进行某些改变 和更改。还应理解，本文中使用的术语仅为了描述特定实施方案并且 无意是限定的，本发明的范围只受所附权利要求限定。

因此，前述仅仅示出了本发明的原则。应理解，本领域普通技术 人员将能够设计不同的安排，其尽管未被本文明确地描述或显示，但 使本发明的原则具体化，且包含在其精神和范围内。而且，本文叙述 的所有实施例和条件措辞都主要旨在帮助读者理解由发明者贡献的 本发明的原则和概念以促进本领域发展，并且不应理解为对这类具体 叙述的实施例和条件的限制。而且，叙述本发明的原则、方面和实施 方案的本文的所有陈述和其具体实施例都旨在涵盖其结构和功能二 者的等同形式。此外，期望此类等同物包括目前已知的等同物和未来 开发的等同物，即无论结构如何，进行相同功能的开发的任何元件。 因而，本发明的范围无意限定于本文中显示和描述的示例性实施方 案。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。