枸橼酸托法替布含量及其有关物质的反相高效液相色谱法测定方法

摘要

本发明公开了枸橼酸托法替布含量及其有关物质的反相高效液相色谱法测定方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.02mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈体积比为83:17为流动相进行等度洗脱，流速为1.0ml/min；其中所述0.02mol/L磷酸二氢钾溶液中含0.2％质量浓度的三乙胺，并且用磷酸调节PH至5.2；检测波长为290nm；柱温30℃。本发明方法采用等度洗脱，降低对仪器的要求，使压力稳定，实验结果准确、可靠；同时，采用本发明方法提高了线性范围的浓度，便于实验时供试液的配制。

说明书

技术领域

本发明涉及医药领域，具体地，涉及枸橼酸托法替布含量及其有关物 质的反相高效液相色谱法测定方法。

背景技术

枸橼酸托法替布(Tofacitinibcitrate)，是由日本武田药品工业株式会 社与美国辉瑞制药联合开发的新型用于对甲氨蝶呤治疗应答不充分或不 耐受的中至重度活动性类风湿关节炎(RA)成人患者的药，2012年11月 6日获得美国FDA批准上市，商品名为XELJANZ。

其结构如下所示：

化学名称：3-((3R，4R)-4-甲基-3-(甲基(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基) 氨基)哌啶-1-基)-3-氧代丙腈枸橼酸盐(1:1)。

托法替布为白色至类白色结晶性粉末，本品易溶于二甲基亚砜，略溶 于0.1mol/L盐酸，微溶于水和甲醇。

目前，已上市的枸橼酸托法替布剂型为片剂，规格为5mg。

关于托法替布含量及有关物质分析方法的文献报道较少，其中： CN104459004A公开了枸橼酸托法替布的含量测定及有关物质检测方法， 其中采用了反相高效液相色谱法，其流动相A：乙腈：50mmol/L乙酸铵 ＝90:10(v/v)；B相：乙腈：50mmol/L乙酸铵＝10:90(v/v)。流动相采用 梯度洗脱。色谱柱为C18，5um，250*4.6mm，流速为1.0mL/min；柱温25℃， 检测波长286nm。

1、该方法采用梯度洗脱；对仪器要求较高，易产生气泡，影响基线 噪声及漂移，同时会造成压力不稳定。

2、该方法测定含量时线性范围为15.12ug/mL～45.37ug/mL，线性范围 浓度较低，配制时较为复杂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供枸橼酸托法替布含量及有关物质 的反相高效液相色谱法测定方法，本发明方法采用等度洗脱，降低对仪器 的要求，使压力稳定，实验结果准确、可靠；同时，采用本发明方法提高 了线性范围的浓度，便于实验时供试液的配制。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：枸橼酸托法替布含量 的反相高效液相色谱法测定方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以 0.02mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈体积比为83:17为流动相进行等度洗脱， 流速为1.0ml/min；其中所述0.02mol/L磷酸二氢钾溶液中含0.2％质量浓度 的三乙胺，并且用磷酸调节PH至5.2；检测波长为290nm；柱温30℃。

进一步的，上述枸橼酸托法替布含量的反相高效液相色谱法测定方法 中，色谱柱规格用250mm长度*4.6mm内径*5um填充剂粒径。

进一步的，所述的枸橼酸托法替布含量的反相高效液相色谱法测定方 法的具体步骤是：取供试品，精密称定，用甲醇-水体积比90:10的溶液溶 解并定容制成每1ml中含供试品1mg的溶液，即制备得到供试品溶液，精 密量取10μl供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；另取枸橼酸托法替 布标准品甲醇-水体积比90:10的溶液溶解并定容制成每1ml中含枸橼酸托 法替布标准品1mg的对照溶液，精密量取10μl对照溶液注入液相色谱仪， 记录色谱图；按外标法以峰面积计算，即得。

一种枸橼酸托法替布有关物质的反相高效液相色谱法测定方法，以十 八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.02mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈体积比 为83:17为流动相进行等度洗脱，流速为1.0ml/min；其中所述0.02mol/L 磷酸二氢钾溶液中含0.2％质量浓度的三乙胺，并且用磷酸调节PH至5.2； 检测波长为290nm；柱温30℃。

进一步地，所述枸橼酸托法替布有关物质为：杂质A、杂质B、杂质 C、杂质D、和杂质E；其化学结构如下：

进一步地，上述枸橼酸托法替布有关物质的反相高效液相色谱法测定 方法中，色谱柱规格用250mm长度*4.6mm内径*5um填充剂粒径。

进一步地，所述枸橼酸托法替布有关物质的反相高效液相色谱法测定 方法具体是：取供试品，精密称定，用甲醇-水体积比90:10的溶液溶解并 制成每1ml中含供试品5mg的供试品溶液；精密量取供试品，用甲醇-水 体积比90:10的溶液稀释制成每1ml中含50μg供试品的溶液，作为对照溶 液；精密量取对照溶液10μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成 分色谱峰的峰高约为满量程的20％；再精密量供试品溶液和对照溶液各 10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍，供 试品溶液色谱图中如有杂质峰，单个杂质按下列公式计算，含量应符合下 表，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍；

单个杂质的含量计算公式：

其中：

Ai供试品溶液色谱图中杂质峰面积；

As对照溶液峰面积；

REF相对校正因子。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

1、本发明方法采用等度洗脱，降低对仪器的要求，使压力稳定，实 验结果准确、可靠。

2、提高了线性范围的浓度，便于实验时供试液的配制。本发明方法 在498μg/ml～2492μg/ml的浓度范围内，其浓度与峰面积呈良好线性关系， 线性方程为Y＝19164X+157447，相关系数R²＝0.9999。

3、原料药与片剂采用同样色谱系统进行检验，便于实验操作。

附图说明

图1为枸橼酸托法替布含量测定的图谱。

图2为杂质A、B、C、D、E与枸橼酸托法替布混合进样图谱(峰顺 序分别为杂质C、D、A、E、枸橼酸托法替布、杂质B)。

具体实施方式

实施例1：枸橼酸托法替布含量的反相高效液相色谱法测定

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以 0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(含0.2％三乙胺，用磷酸调节pH值至5.2)-乙腈 (83:17)为流动相；检测波长为290nm；柱温30℃。理论板数按托法替布峰 计算不低于3000。

取枸橼酸托法替布供试品，精密称定，用甲醇-水(90:10)溶解并定量稀 释制成每1ml中约含枸橼酸托法替布1mg的待测样品溶液，精密量取10μl 待测样品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；另取枸橼酸托法替布对照品， 同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。

实施例2：枸橼酸托法替布有关物质的反相高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以 0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(含0.2％三乙胺，用磷酸调节pH值至5.2)-乙腈 (83:17)为流动相；检测波长为290nm；柱温30℃。理论板数按托法替布峰 计算不低于3000，拖尾因子小于1.5。

取实施例1中所述的枸橼酸托法替布供试品，精密称定，用甲醇-水 (90:10)溶解并稀释制成每1ml中约含枸橼酸托法替布5mg的溶液，作为供 试品溶液。精密量取适量所述供试品溶液，用甲醇-水(90:10)稀释制成每 1ml中含枸橼酸托法替布供试品50μg的溶液，作为对照溶液。精密量取对 照溶液10μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高 约为满量程的20％；再精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl，分别注入 液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍，供试品溶液色谱图 中如有杂质峰，单个杂质按下列公式计算，含量应符合下表，各杂质峰面 积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍(1.5％)。

计算公式：

其中：

Ai供试品溶液色谱图中杂质峰面积；

As对照溶液峰面积；

REF相对校正因子。

表1各杂质相对保留时间、相对校正因子和限度

(注：当REF≤0.9时，按1.0计。)

上述方法对有关物质检出率高，精密度高，含量测定结果准确，重复 性和回收率良好，且该方法通过验证，可用于枸橼酸托法替布原料和制剂 样品的常规分析和质量控制。

实施例3对含量测定的以下项目进行验证

a)仪器精密度试验

取枸橼酸托法替布约20mg，精密称定，置20ml容量瓶中，加甲醇- 水(90:10)至近刻度处，超声处理，取出，放冷至室温，加甲醇-水(90:10) 至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液 10μl，注入液相色谱仪记录色谱图，重复进样6次，计算峰面积的RSD值。 结果见下表2。

表2含量测定仪器精密度试验结果

结论：RSD为0.07％，说明仪器精密度良好。

b)回收率试验

取枸橼酸托法替布工作对照品15.80、15.77、15.85、19.76、19.90、 20.45、23.96、24.30、24.10mg分别置20ml量瓶中，加甲醇-水(90:10) 至近刻度处，超声处理，取出，放冷至室温，加甲醇-水(90:10)至刻度， 摇匀，滤过，分别精密量取上述续滤液10μl，作为供试品溶液；另取枸橼 酸托法替布工作对照品适量，精密称定，用甲醇-水(90:10)溶解并稀释 制成每1ml中约含枸橼酸托法替布1mg的溶液，作为对照品溶液。

取上述对照品溶液和供试品溶液，分别测定，按外标法以峰面积计算， 即得，结果见下表3。

表3回收率试验结果

结论：各浓度下的平均回收率均在98.0％～102.0％之间，平均回收率 为99.8％，RSD为0.38％，说明回收率良好。

c)重复性试验

精密称取枸橼酸托法替布15.85、15.68、15.76、19.66、19.58、20.45、 23.96、23.66、23.93mg，分别置20ml容量瓶中，加甲醇-水(90:10)至近 刻度处，超声处理，取出，放冷至室温，加甲醇-水(90:10)至刻度，摇 匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：取枸橼酸托法替布工作对照品20mg，精密称定， 置20ml量瓶中，加甲醇-水(90:10)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照 品溶液。

精密量取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色 谱图，按外标法以峰面积计算各份样品的含量，即得。结果见下表4。

表4重复性试验结果

结论：RSD为0.38％，表明重复性良好。

d)中间精密度试验

在不同的时间，不同的试验人员，按照“重复性试验”方法，按外标法 以峰面积计算各份样品的含量并计算RSD。结果见下表5。

表5中间精密度试验结果

结论：RSD为0.26％，表明本品测定方法中间精密度良好。

e)专属性试验

溶剂空白：取甲醇-水(90:10)作为溶剂空白样品溶液。

酸碱空白：取1mol/L盐酸溶液2ml，置100ml量瓶中，加入1mol/L 氢氧化钠溶液2ml中和，用甲醇-水(90:10)定容至刻度，摇匀，作为酸 碱空白溶液。

氧化空白：取30％双氧水5ml，置100ml量瓶中，用甲醇-水(90:10) 定容至刻度，摇匀，作为氧化空白溶液。

样品：取枸橼酸托法替布约100mg，精密称定，置100ml量瓶中，加 甲醇-水(90:10)溶剂并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

酸破坏：取枸橼酸托法替布约100mg，精密称定，置100ml量瓶中， 加1mol/L盐酸溶液2ml，振摇使充分润湿，100℃水浴2h，取出，放冷， 加1mol/L氢氧化钠溶液2ml中和，加甲醇-水(90:10)稀释至刻度，摇匀， 滤过，取续滤液，即得。

碱破坏：取枸橼酸托法替布约100mg，精密称定，置100ml量瓶中， 加1mol/L氢氧化钠溶液2ml，振摇使充分润湿，100℃水浴2h，取出，放 冷，加1mol/L盐酸溶液2ml中和，加甲醇-水(90:10)稀释至刻度，摇匀， 滤过，取续滤液，即得。

氧化破坏：取枸橼酸托法替布约100mg，精密称定，置100ml量瓶中， 加30％双氧水溶液5ml，振摇使充分润湿，放置10min，加甲醇-水(90:10) 溶液适量，用甲醇-水(90:10)定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即 得。

高温破坏：取枸橼酸托法替布约100mg，精密称定，置100ml量瓶中， 加水5ml，振摇使充分润湿，100℃水浴2h，取出，放冷，加甲醇-水(90:10) 溶液适量，用甲醇-水(90:10)定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即 得。

光照破坏：取枸橼酸托法替布约100mg，精密称定，置100ml白色量 瓶中，加入甲醇-水(90:10)适量，用甲醇-水(90:10)定容至刻度，摇匀， 置光照度为4500lx±500lx的强度下，照射1天，即得。

精密吸取上述溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见下表 6。

表6专属性破坏实验

结论：专属性空白实验显示，溶剂空白、酸碱空白均未出峰，氧化空 白色谱图中有双氧水峰，保留时间在3min之前，对主峰和新产生的峰没 有干扰；专属性破坏试验结果显示，热、氧化、碱对枸橼酸托法替布含量 测定几乎没影响。酸和光对枸橼酸托法替布含量测定影响很大，主峰面积 下降，产生了新杂质，新杂质与主峰分离效果好。

f)线性与范围

取枸橼酸托法替布工作对照品24.9、49.7、74.7、99.9、124.6mg分别 置50ml量瓶中，用甲醇-水(90:10)溶解并稀释至刻度，摇匀，分别测定。 以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归处理，计算回归方程 及相关系数。结果见下表7。

表7含量线性试验结果

结论：表明进样量为10μl时，枸橼酸托法替布498μg/ml～2492μg/ml 的浓度范围内，其浓度与峰面积呈良好线性关系。

g)溶液稳定性试验

取枸橼酸托法替布原料约20mg，精密称定，置20ml量瓶中，加甲醇 -水(90:10)溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液；室温放置，分别于0、 1、2、4、8小时取样，测定并计算RSD(％)值，结果见下表8。

表8溶液稳定性试验结果

结论：RSD为0.16％，表明测定溶液室温放置8小时，稳定性良好。

h)耐用性

取本品适量，加甲醇-水(90:10)溶解并稀释成每1ml含枸橼酸托法 替布1mg的溶液，作为供试品溶液，同法制备对照品溶液，精密吸取上述 两种溶液各10μl注入到高效液相色谱仪中进行测定，记录色谱峰，用外标 法计算含量，计算含量RSD。结果见下表9。

表9耐用性测定结果

注：选定条件为0.02mol/L磷酸二氢钾(pH5.2)-乙腈(83:17)；波 长:290nm；柱温:30℃；流速:1.0ml/min。

结论：试验结果表明，当液相条件(流动相比例、流速、波长)发生小 的改变时，含量RSD为0.25％，说明含量测定影响较小，且分离效果较好。 但保留时间发生变化，以流动相比例发生改变影响最大，常规检测中流动 相比例应控制。

实施例4含量测定方法学验证总结(见表10)

表10

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的 限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等 同变化，均落入本发明的保护范围之内。