水产品中孔雀石绿及隐性孔雀石绿的柱前电化学衍生一次性测定总量方法

摘要

本发明水产品中孔雀石绿及隐性孔雀石绿的柱前电化学衍生一次性测定总量方法属于把隐性孔雀石绿变为孔雀石绿的一次性测定总量方法。本发明最关键是发现了隐性孔雀石绿溶液经过电化学库仑检测器(ECD)氧化电压+650mv，隐性孔雀石绿平均98.86％变为孔雀石绿，而原有的孔雀石绿不变化，使本发明要把样品中的隐性孔雀石绿和孔雀石绿在一次测定中，用高效液相色谱仪可以测出隐性孔雀石绿和孔雀石绿的总浓度。本发明大大缩短样品前处理时间和减少试剂耗材的使用，运用电化学柱前衍生代替国标中二氧化铅的柱后衍生。具有样品前处理简单、净化效果好、衍生化率高、回收率好的特点。

说明书

技术领域

本发明属于孔雀石绿和隐性孔雀石绿的测定方法，特别是涉及把隐性孔雀石绿在柱前衍生化为孔雀石绿的一次性测定总量方法。

背景技术

孔雀石绿(MalachiteGreen，MG)是一种三苯甲烷类化学物。工业常用作丝绸、毛皮和纸张的染料。由于孔雀石绿的氧化电位与病原体组成酶的某些氨基酸相近，在细胞分裂时与其竞争而阻碍蛋白肽的形成，导致细胞分裂受到抑制，从而起到抗菌、杀虫作用。由于它杀菌效果明显、价格低廉，使用方便，曾经被许多国家将其广泛用水产养殖中防治水霉病，杀灭鱼体外寄生虫和鱼卵中的霉菌。2006年的多宝鱼食品安全事件让孔雀石绿引起社会的广泛关注。

近年研究发现，孔雀石绿及其在动物体代谢产物隐性孔雀石绿(leucomalachitegreen，LMG)分子结构中的三苯甲烷化学官能团被确证具有致畸、致癌、致突变作用，而且在鱼体内和环境中残留时间长，不容易被降解，并可通过食物链转移至哺乳动物和人类，对人体健康和生态环境产生很大的危害。同时它能溶解吸附水体中的锌，引起水生动物急性锌中毒。因此，欧美、日本、加拿大等许多国家都将其列为水产养殖禁用药物。

我国从2002年5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及化合物清单》。但是，由于孔雀石绿防霉杀菌效果明显，价格低廉易得，使用方便，同时缺少有效的替代药物，亦有人在水产养殖以及水产品运输过程中偷偷使用而屡禁不止.至今仍常被在水产品中检出。

目前，国标方法主要是高效液相色谱法和液相色谱一串联质谱法，是在提取后使用化学试剂二氧化铅，将隐性孔雀石绿转化成孔雀石绿后测定。但二氧化铅用量的不确定或装填的二氧化铅柱不均匀，氧化效率不可控，将隐性孔雀石绿转化成孔雀石绿的数量不可控制，对隐性孔雀石绿检测的精确性不高，而且随着使用时间增长而减弱导致重现性不好。

发明内容

本发明的目的是提供高效率、操作简单、高比例将隐性孔雀石绿转化成孔雀石绿后，进行隐性孔雀石绿和孔雀石绿合并量的高效液相色谱一紫外可见光检测器的一次性检测总量的方法。

本发明的内容是：

水产品中孔雀石绿及隐性孔雀石绿的柱前电化学衍生一次性测定总量方法，其步骤如下：

一、试剂

标准物质：孔雀石绿(含量98.0％)；和稳性孔雀石绿(含量98.0％)；

乙腈(色谱纯，含量大于99.9％)；

冰乙酸(色谱纯，含量大于98％)；

无水乙酸铵(色谱纯，含量大于99.9％)；

二氯甲烷(色谱纯，含量大于99％)；

酸性氧化铝固体吸附剂(粒径50-200μm)；

氯化钠(分析纯，含量大于99.8％)。

稳性孔雀石绿是无色的。

二、制备标准物质孔雀石绿的待测定溶液(简称：A待测定的标准溶液)

准确称取标准物质孔雀石绿10mg，用乙腈溶解孔雀石绿，配制成含孔雀石绿浓度为1.0mg/L的标准物质孔雀石绿待测定溶液，既获得A待测定的标准溶液，待用色谱仪检测；

三、制备标准物质隐性孔雀石绿的待测定溶液(简称B待测定的标准溶液)

准确称取标准物质隐性孔雀石绿10mg，用乙腈溶解隐性孔雀石绿，配制成含孔雀石绿浓度为1.0mg/L的标准物质隐性孔雀石绿待测定溶液，既获得B待测定的标准溶液，待用色谱仪检测。

四、制备样品物质孔雀石绿和隐性孔雀石绿的待测定溶液(简称C待测定的样品溶液)

(1)配制溶液：

配制缓冲液：称取3.85g无水乙酸铵溶解于1000mL蒸馏水中，冰乙酸调pH至4.5；过0.45μm水系滤膜；由于孔雀石绿和隐性孔雀石绿pH4.5的条件下溶出快，分别都具有化学稳定性，用无水乙酸铵的原因是增加孔雀石绿和隐性孔雀石绿的溶出，冰乙酸为小分子有机酸，对孔雀石绿和隐性孔雀石绿的分子破坏小。

配制提取液：将乙腈∶二氯甲烷按体积比为2∶1混匀后备用；由于孔雀石绿和隐性孔雀石绿乙腈+二氯甲烷的条件下溶解性好，用标准物质孔雀石绿和标准物质稳性孔雀石绿的溶解实验，其溶解度分别都大于90％；所以用这两个物质的这个配合比例；

(2)制备样品C待测定的样品溶液

取2.0g待测样品捣碎后放于50mL离心管中，加入乙酸铵缓冲溶液3mL和提取液5mL，用涡旋混匀后，放入超声波提取器中，用超声波促进孔雀石绿和隐性孔雀石绿溶解于液体中，用超声波促溶30min，加入酸性氧化铝固体吸附剂1g，加入氯化钠1g，涡旋提取2min，于离心机上8000r/min转速离心5min，取上清液在45℃旋转蒸发至干，用2.0mL的乙腈溶解，0.45μm有机滤膜过滤，该过滤液是含有孔雀石绿和隐性孔雀石绿的待测定溶液，既C待测定的样品溶液；

加入酸性氧化铝固体吸附剂的作用是去除油脂类物质，防止被去除的油脂类物质干扰对孔雀石绿和隐性孔雀石绿测定。加入1g氯化钠可增加孔雀石绿和隐性孔雀石绿的溶出。

五、高效液相色谱仪的色谱检测条件

高效液相色谱仪的设置为：用C₁₈色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈；pH4.5状态的乙酸铵缓冲溶液＝78∶22(体积比)，流速1.0mL/min，进样量20μL，柱温35℃。

六、用A待测定的标准溶液校正孔雀石绿在高效液相色谱仪的吸收波长和测定误差a％(简称：孔雀石绿的测定误差为a％)：

(6.1)加电场测定：把孔雀石绿的标准溶液即A待测定的标准溶液用上述步骤“五”高效液相色谱仪的色谱检测条件下，先把A待测定的标准溶液流过电化学库仑检测器(ECD)氧化电压+650mv，流速1.0mL/min，再经过C₁₈色谱柱，在紫外检测器检测618nm波长下检测含孔雀石绿的浓度值；既测出A待测定的标准溶液中含孔雀石绿的浓度值；用含孔雀石绿的浓度值a1与步骤“二”中孔雀石绿的标准浓度值1.0mg/L比较，获得测定孔雀石绿的误差为a1％；

(6.2)不加电场测定：把孔雀石绿的标准溶液即A待测定的标准溶液用上述步骤“五”高效液相色谱仪的色谱检测条件下，先把A待测定的标准溶液流过电化学库仑检测器(ECD)氧化电压0.0mv，流速1.0mL/min，再经过C₁₈色谱柱，在紫外检测器检测618nm波长下检测含孔雀石绿的浓度值；既测出A待测定的标准溶液中含孔雀石绿的浓度值；用含孔雀石绿的浓度值a2与步骤“二”中孔雀石绿的标准浓度值1.0mg/L比较，获得孔雀石绿的测定误差为a2％；

当a1％＝a2％，或当(a1％-a2％)/100的误差小于千分之一，用a1％和a2％的平均值作为a％；当a％小于百分之一后，进行下一步测定。

七、用B待测定的标准溶液测出了隐性孔雀石绿被氧成孔雀石绿后，用高效液相色谱仪的测定误差b％(简称：隐性孔雀石绿的测定误差为b％)：

加电场测定：把隐性孔雀石绿的标准溶液即B待测定的标准溶液用上述步骤“五”高效液相色谱仪的色谱检测条件下，先把B待测定的标准溶液流过电化学库仑检测器(ECD)氧化电压+650mv，流速1.0mL/min，把隐性孔雀石绿被还原成孔雀石绿，再经过C₁₈色谱柱后，用紫外检测器检测618nm波长下检测转化成的孔雀石绿的浓度值；用转化成的孔雀石绿的浓度值与步骤“二”中隐性孔雀石绿的标准浓度值1.0mg/L比较，获得隐性孔雀石绿的测定误差为b％。

把含有隐性孔雀石绿的溶液先流过电化学库仑检测器(ECD)氧化电压+650mv，流速1.0mL/min，，就能把这种溶液中的隐性孔雀石绿氧化变为孔雀石绿是本发明中的核心发明技术，即本发明中的发明点。并且这种氧化方法，能使隐性孔雀石绿平均98.86％变为孔雀石绿，隐性孔雀石绿的测定误差为b％平均98.86％。这样，使本发明要把样品中的隐性孔雀石绿和孔雀石绿在一次测定中，可以测出隐性孔雀石绿和孔雀石绿的总浓度c(mg/L)有了实验依据。

在我们的氧化实验中，选用+650mv是多次实验的结果，多次实验证明，含有隐性孔雀石绿的溶液先流过电化学库仑检测器(ECD)氧化电压+650mv时，隐性孔雀石绿氧化变为孔雀石绿的效果最好。

八、测定C待测定的样品溶液中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的总浓度c(mg/L)；

在加电场条件下测定：样品C待测定的样品溶液用步骤“五”高效液相色谱仪的色谱检测条件下，C待测定的样品溶液经过电化学库仑检测器(ECD)氧化电压+650mv，流速1.0mL/min，孔雀石绿含量不变化，隐性孔雀石绿被氧化成孔雀石绿，再经过C₁₈色谱柱后，用紫外检测器检测在618nm波长下检测，测定出C待测定的样品溶液中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的总浓度c(mg/L)。

根据步骤“六”(6.1)加电场能测定标准溶液孔雀石绿的实验结果，并还有步骤“七”加电场能测定出标准溶液隐性孔雀石绿被氧成孔雀石绿的实验结果，说明本步骤“八”加电场能测定出样品溶液中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的总浓度c(mg/L)。

九、测定C待测定的样品溶液中孔雀石绿和的浓度d(mg/L)；

在不加电场条件下测定：样品C待测定的样品溶液用步骤“五”高效液相色谱仪的色谱检测条件下，C待测定的样品溶液经过电化学库仑检测器(ECD)氧化电压0.0mv，流速1.0mL/min，孔雀石绿含量不变化，隐性孔雀石绿含量也不变化，再经过C₁₈色谱柱与其他物质分离后，用紫外检测器检测在618nm波长下检测，测定出C待测定的样品溶液中孔雀石绿的含量为d(mg/L)，d(mg/L)中不含有隐性孔雀石绿的量。

由于不加电场条件，隐性孔雀石绿不能变为孔雀石绿。则在本步骤“九”中，不加电场条件，只能测出孔雀石绿和的浓度d(mg/L)。

十、计算样品中测定孔雀石绿和的隐性孔雀石绿浓度为e(mg/L)：

样品中孔雀石绿的实际浓度为f＝d×100÷a(mg/L)

样品中隐性孔雀石绿的实际浓度为g＝(c-d)×100÷b(mg/L)

样品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的实际浓度为e＝f+g(mg/L)；

用样品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的实际浓度为e(mg/L)换算成2.0g待测样品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的实际量。

本发明的优点：

本研究用高效液相色谱，把待测定的样品溶液流过电化学库仑检测器(ECD)氧化电压+650mv，流速1.0mL/min，就能把隐性孔雀石绿被氧化成孔雀石绿，从而可以一次性的测定出样品溶液中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的总浓度c(mg/L)。使其在水产品等中测定这两个有毒物的总量变得非常方便。并且本发明还提供了修正孔雀石绿和隐性孔雀石绿的总浓度c(mg/L)误差，获得样品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的实际准确浓度为e(mg/L)的方法。

本发明比现有技术测定样品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的实际准确浓度，本发明大大缩短样品前处理时间和减少试剂耗材的使用，运用电化学柱前衍生代替国标中二氧化铅的柱后衍生。具有样品前处理简单、净化效果好、衍生化率高、回收率好的特点。

本发明最关键是发现了隐性孔雀石溶液经过电化学库仑检测器(ECD)氧化电压+650mv，流速1.0mL/min后，隐性孔雀石绿平均98.86％变为孔雀石绿，而原有的孔雀石绿不变化，使本发明要把样品中的隐性孔雀石绿和孔雀石绿在一次测定中，可以测出隐性孔雀石绿和孔雀石绿的总浓度c(mg/L)有了依据。

具体实施方式

实施例1、水产品中孔雀石绿及隐性孔雀石绿的柱前电化学衍生一次性测定总量方法

水产品中孔雀石绿及隐性孔雀石绿的柱前电化学衍生一次性测定总量方法，其步骤如下：

一、试剂

标准物质：孔雀石绿(含量98.0％)；和稳性孔雀石绿(含量98.0％)；

乙腈(色谱纯，含量大于99.9％)；

冰乙酸(色谱纯，含量大于98％)；

无水乙酸铵(色谱纯，含量大于99.9％)；

二氯甲烷(色谱纯，含量大于99％)；

酸性氧化铝固体吸附剂(粒径50-200μm)；

氯化钠(分析纯，含量大于99.8％)。

二、制备标准物质孔雀石绿的待测定溶液(简称：A待测定的标准溶液)

准确称取标准物质孔雀石绿10mg，用乙腈溶解孔雀石绿，配制成含孔雀石绿浓度为1.0mg/L的标准物质孔雀石绿待测定溶液，既获得A待测定的标准溶液，待用色谱仪检测。

三、制备标准物质隐性孔雀石绿的待测定溶液(简称B待测定的标准溶液)

准确称取标准物质隐性孔雀石绿10mg，用乙腈溶解隐性孔雀石绿，配制成含孔雀石绿浓度为1.0mg/L的标准物质隐性孔雀石绿待测定溶液，既获得B待测定的标准溶液，待用色谱仪检测。

四、制备样品物质孔雀石绿和隐性孔雀石绿的待测定溶液(简称：C待测定的样品溶液)

(1)配制溶液：

配制缓冲液：称取3.85g无水乙酸铵溶解于1000mL蒸馏水中，冰乙酸调pH至4.5；过0.45μm水系滤膜；

配制提取液：将乙腈∶二氯甲烷按体积比为2∶1混匀后备用。

(2)制备样品C待测定的样品溶液

取2.0g待测样品捣碎后放于50mL离心管中，加入乙酸铵缓冲溶液3mL和提取液5mL，用涡旋混匀后，放入超声波提取器中，用超声波促进孔雀石绿和隐性孔雀石绿溶解于液体中，用超声波促溶30min，加入酸性氧化铝固体吸附剂1g，加入氯化钠1g，涡旋提取2min，于离心机上8000r/min转速离心5min，取上清液在45℃旋转蒸发至干，用2.0mL的乙腈溶解，0.45μm有机滤膜过滤，该过滤液是含有孔雀石绿和隐性孔雀石绿的待测定溶液，既C待测定的样品溶液。

五、高效液相色谱仪的色谱检测条件

高效液相色谱仪的设置为：用C₁₈色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈；pH4.5状态的乙酸铵缓冲溶液＝78∶22(体积比)，流速1.0mL/min，进样量20μL，柱温35℃。

六、用A待测定的标准溶液校正孔雀石绿在高效液相色谱仪的吸收波长和测定误差a％(简称：孔雀石绿的测定误差为a％)：

(6.1)加电场测定：把孔雀石绿的标准溶液即A待测定的标准溶液用上述步骤“五”高效液相色谱仪的色谱检测条件下，先把A待测定的标准溶液流过电化学库仑检测器(ECD)氧化电压+650mv，流速1.0mL/min，再经过C₁₈色谱柱，在紫外检测器检测618nm波长下检测含孔雀石绿的浓度值；既测出A待测定的标准溶液中含孔雀石绿的浓度值；用含孔雀石绿的浓度值a1与步骤“二”中孔雀石绿的标准浓度值1.0mg/L比较，获得测定孔雀石绿的误差为a1％。

(6.2)不加电场测定：把孔雀石绿的标准溶液即A待测定的标准溶液用上述步骤“五”高效液相色谱仪的色谱检测条件下，先把A待测定的标准溶液流过电化学库仑检测器(ECD)氧化电压0.0mv，流速1.0mL/min，再经过C₁₈色谱柱，在紫外检测器检测618nm波长下检测含孔雀石绿的浓度值；既测出A待测定的标准溶液中含孔雀石绿的浓度值；用含孔雀石绿的浓度值a2与步骤“二”中孔雀石绿的标准浓度值1.0mg/L比较，获得孔雀石绿的测定误差为a2％；

当a1％＝a2％，或当(a1％-a2％)/100的误差小于千分之一，用a1％和a2％的平均值作为a％；当a％小于百分之一后，进行下一步测定。

七、用B待测定的标准溶液测出了隐性孔雀石绿被氧成孔雀石绿后，用高效液相色谱仪的测定误差b％(简称：隐性孔雀石绿的测定误差为b％)：

把隐性孔雀石绿的标准溶液即B待测定的标准溶液用上述步骤“五”高效液相色谱仪的色谱检测条件下，先把B待测定的标准溶液流过电化学库仑检测器(ECD)氧化电压+650mv，流速1.0mL/min，把隐性孔雀石绿被还原成孔雀石绿，再经过C₁₈色谱柱后，用紫外检测器检测618nm波长下检测转化成的孔雀石绿的浓度值；用转化成的孔雀石绿的浓度值与步骤“二”中隐性孔雀石绿的标准浓度值1.0mg/L比较，获得隐性孔雀石绿的测定误差为b％。

八、测定C待测定的样品溶液中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的总浓度c(mg/L)；

在加电场条件下测定：样品C待测定的样品溶液用步骤“五”高效液相色谱仪的色谱检测条件下，C待测定的样品溶液经过电化学库仑检测器(ECD)氧化电压+650mv，流速1.0mL/min，孔雀石绿含量不变化，隐性孔雀石绿被氧化成孔雀石绿，再经过C₁₈色谱柱后，用紫外检测器检测在618nm波长下检测，测定出C待测定的样品溶液中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的总浓度c(mg/L)。

九、测定C待测定的样品溶液中孔雀石绿和的浓度d(mg/L)；

在不加电场条件下测定：样品C待测定的样品溶液用步骤“五”高效液相色谱仪的色谱检测条件下，C待测定的样品溶液经过电化学库仑检测器(ECD)氧化电压0.0mv，流速1.0mL/min，孔雀石绿含量不变化，隐性孔雀石绿含量也不变化，再经过C₁₈色谱柱与其他物质分离后，用紫外检测器检测在618nm波长下检测，测定出C待测定的样品溶液中孔雀石绿的含量为d(mg/L)，d(mg/L)中不含有隐性孔雀石绿的量。

十、计算样品中测定孔雀石绿和的隐性孔雀石绿浓度为e(mg/L)：

样品中孔雀石绿的实际浓度为f＝d×100÷a(mg/L)

样品中隐性孔雀石绿的实际浓度为g＝(c-d)×100÷b(mg/L)

样品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的实际浓度为e＝f+g(mg/L)；

用样品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的实际浓度为e(mg/L)换算成2.0g待测样品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的实际量。