一种驴特征性多肽及其在检测驴皮源性成分中的应用

摘要

本发明公开了一种驴特征性多肽及其在检测驴皮源性成分中的应用，本发明所提供的驴特征性多肽，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，该多肽为驴的胶原蛋白中所特有。此外，本发明还提供了一种检测胶类中药中驴皮源性成分的方法，包括采用胰蛋白酶或精氨酸-C酶酶切胶类中药，使特征性多肽从胶原蛋白中游离出，然后采用液相色谱-串联质谱检测，从而判断是否含有驴皮源性成分。该方法具有特征性强，灵敏度高，操作简单等优点，能准确鉴定胶类中药中是否含有驴皮源性成分。

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物物种和动物源性成分鉴定的方法，具体涉及一种驴皮 源性成分的检测方法；此外，本发明还涉及检测驴皮源性成分的特征性多肽。

背景技术

阿胶作为一种传统名贵中药，已有数千年的食用历史，具有补血滋阴，润 燥，止血的功效。中国药典规定，阿胶为马科动物驴EquusasinusL.的干燥皮或 鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。纯正的阿胶必需来自百分百的驴皮，方能保 证产品的功效。从原料生物分类学上看，驴属于奇蹄目马科驴属，包括非洲野 驴、藏野驴、中亚野驴、家驴等品种。其中中国饲养的家驴包括关中驴、德州 驴、广灵驴、佳米驴、泌阳驴、淮阳驴、庆阳驴、华北驴、新疆驴、西南驴等 众多地方品种。由于驴的畜牧价值不断下降，而其经济价值却未见提高，驴的 数量在世界范围内急剧下降，驴皮的供应也逐年紧张，价格不断上涨。市场上 出现了很多不法分子，在生产阿胶时，部分甚至全部用各种其他动物皮包括马 皮、牛皮、猪皮等，甚至脏皮、烂皮、病死动物的皮等来取代驴皮进行熬制。 这些伪品的存在严重干扰了市场正常秩序，损害消费者利益，影响正规产品的 信誉。

胶类中药一般经长时间高温蒸煮浓缩而成，主要成分非常相近且不同厂家 的生产工艺存有差异，采用红外、近红外、X-衍射等方法对胶类中药纯品进行 真伪鉴别常存在判断不准确、缺乏足够说服力等。目前已报道的比较权威的方 法主要是DNA分子鉴定方法和检测特征性肽段的液质联用方法。DNA分子鉴定 方法是鉴别动物DNA非常成熟的方法，但在胶类的熬制过程中，DNA被严重破 坏、降解，残存量极少，大大限制了该方法在胶类鉴别中的有效应用。液质联 用法测定蛋白质酶解肽的方法已经很成熟，只要找到动物源性成分稳定存在的 特征性多肽，便可用于检测；已报道的液质联用方法鉴别胶类中药的成分包括 牛皮源性成分、猪皮源性成分、龟源性成分、鹿源性成分等，虽有驴皮源性成 分检测方法的报道，但实为驴马共有成分，无法区分阿胶和马皮胶。目前仍没 有用液质联用仪检测驴皮源性成分的检测方法，这不但因为稳定存在的特征性 多肽的寻找、鉴定及确认工作本身需付出大量的努力，而且驴和马的亲缘关系 非常近，它们在生物学本质上的差异也十分有限，因此很难找到驴的特征性多 肽用于驴皮源性成分的液质联用检测方法。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种驴特征性多 肽以及一种检测胶类中药中驴皮源性成分的方法，所述方法操作简单，特征性 强，灵敏度高，能准确鉴定胶类中药中是否含有驴皮源性成分。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明的一种驴特征性多肽，其特征在于所述多肽的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

进一步的，本发明还提出了一种检测胶类中药中驴皮源性成分的方法，其 特征在于包括：将待检测的胶类中药样品用胰蛋白酶或精氨酸-C酶进行酶切 后，取酶解溶液放入液质联用仪，以待检测的胶类中药样品为基质，加入SEQID NO.1所示的驴特征多肽或阿胶纯品作为对照，采用二级质谱模式，选择三电荷 母离子m/z690.8及其子离子的离子对进行监测；如果检测出该离子的保留时间 与对照品一致，且其子离子与对照品的子离子一致，则所述样品中含有驴皮源 性成分。

在本发明所述的方法中，优选的，所述胶类中药包括阿胶、黄明胶、龟甲 胶、鹿角胶、狗骨胶以及海龙胶。

在本发明所述的方法中，优选的，所述的酶切是按照以下方法进行：取0.05g 待检测的胶类中药样品于25ml量瓶中，加入少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液，超 声使样品完全溶解，然后用1％(w/w)，pH8.0的NH₄HCO₃溶液稀释至刻度， 摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取滤液100μl加入2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37 ℃恒温酶解12h。

在本发明所述的方法中，优选的，液质联用仪检测的液相条件为：采用 2.1mm×100mm，1.8μmC₁₈反相色谱柱，流动相A为0.1％(v/v)甲酸溶液，流 动相B为乙腈，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0～40min，2％～50％B；质谱条件为： 电喷雾正离子模式进行多反应监测，选择m/z690.8→752.4，809.5，908.5作为 检测离子对进行MRM扫描。

采用本发明的方法，能够快速检测胶类中药中是否含有驴皮源性成分，虽 然该驴特征多肽(SEQIDNO.1所示)的肽链中间含有精氨酸，但其特殊的空 间结构，阻碍了胰蛋白酶或精氨酸-C酶的酶切，从而保留了完整的肽链；尽管 胶类中药中胶原蛋白多肽有一定水解与破坏，但本发明基于其主要成分胶原蛋 白中的差异性多肽，其含量高，采用液质联用仪完全能够达到检测目的，不但 能够将亲缘关系较近的驴源性成分和马种源性成分进行区分，而且能对驴皮源 性成分进行定量。

本发明考察了大量的不同驴种的驴皮熬制成的胶，这些驴种包括关中驴、 德州驴、广灵驴、晋南驴、佳米驴、泌阳驴、淮阳驴、庆阳驴、华北驴、新疆 驴、西南驴等；同时也考察了大量的不同马种的马皮熬制成的胶，这些马种包 括蒙古马、伊利马、西南马、云南马、百色马、贵州马、三河马、巴里坤马等， 证明本发明中的驴特征性多肽在各种驴皮及所熬制的胶中均含有，而在各种马 皮及所熬制的胶中均不含有，进一步证明了方法的可靠性。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发 明作进一步的详细描述，其中：

图1是纯品胶MRM扫描模式下选择离子对m/z690.8→752.4，809.5，908.5 监测的质谱图；

图2是加入5％阿胶的混合胶MRM扫描模式下选择离子对m/z690.8→752.4， 809.5，908.5监测的质谱图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实例进行详细描述。优选实例中没有注 明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件进行。

实施例1各种纯品胶中驴特征性多肽的检测

1、材料和试剂

材料：各种纯品胶类中药，包括阿胶、马皮胶、黄明胶、猪皮胶、龟甲胶、 鹿角胶、狗骨胶、海龙胶，分别用驴皮、马皮、牛皮、猪皮、龟甲、鹿角、狗 腿骨、海龙煎煮获得。

试剂：碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯，购自中国药品生物制品 检定研究院)。

2、检测方法

(1)取0.05g待测胶类中药样品于25ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液，超声使样品完全溶解，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀释至刻 度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取滤液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl， 37℃恒温酶解12h。

(2)取5μl酶解溶液放入液质联用仪检测。液相条件：C₁₈反相色谱柱 (2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相A为0.1％(v/v)甲酸溶液，流动相B为乙 腈，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0～40min，2％～50％B。质谱条件：电喷雾正 离子模式(ESI⁺)进行多反应监测，选择m/z690.8→752.4，809.5，908.5作为检 测离子对进行MRM扫描。

3、结果

结果见图1，18.3min处只有阿胶中检出相应的离子峰，其他均没有检出， 可见该法能够特异性检测驴皮源性成分，而与其他各种动物源性成分包括马、 牛、猪、龟、鹿等进行区分。

实施例2胶类中药中驴皮源性成分的检测

1、材料和试剂

材料：混合胶样品由实施例1中的纯品胶样品分别加入5％(w/w)阿胶制 成，包括含5％(w/w)阿胶的马皮胶、含5％(w/w)阿胶的黄明胶、5％(w/w) 阿胶的猪皮胶、含5％(w/w)阿胶的龟甲胶、含5％(w/w)阿胶的鹿角胶、含 5％(w/w)阿胶的狗骨胶、含5％(w/w)阿胶的海龙胶。

试剂：碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯，购自中国药品生物制品 检定研究院)。

2、检测方法

(1)取0.05g待测样品于25ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液， 超声使样品完全溶解，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀释至刻度，摇 匀，微孔滤膜过滤，精密量取滤液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒 温酶解12h。

(2)取5μl酶解溶液放入液质联用仪检测。液相条件：C₁₈反相色谱柱 (2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相A为0.1％(v/v)甲酸溶液，流动相B为乙 腈，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0～40min，2％～50％B。质谱条件：电喷雾正 离子模式(ESI⁺)进行多反应监测，选择m/z690.8→752.4，809.5，908.5作为检 测离子对进行MRM扫描。

3、结果

结果见图2，18.3min处加入5％阿胶的混合胶样品中均检出相应的离子峰， 而实施例1中的马皮胶、黄明胶、猪皮胶、龟甲胶、鹿角胶、狗骨胶以及海龙 胶中均没有检出相应的离子峰。可见该法能够特异性检测混入驴皮源性成分的 胶类中药。

综上所述，针对驴的胶原蛋白序列中包含其专属性多肽 His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Val-Gly-Ser-Val-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Va l-Gly-Pro-Arg(SEQIDNO.1所示)，经胰蛋白酶或精氨酸-C酶酶切从胶原蛋白 中游离出，采用液相色谱-串联质谱，可检测胶类中药中的驴皮源性成分。

需要说明的是，以上实施例仅用以说明发明的技术方案而非限制，尽管通 过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域技术人员对本 发明作的各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落 在本发明的范围内。