一种血红蛋白类载氧药物中总磷脂含量的测定方法

摘要

本发明涉及一种血红蛋白类载氧药物中总磷脂含量的测定方法，属于医药技术领域，其包括以下步骤：A.测定操作；B.样品中总磷脂含量的计算。该血红蛋白类载氧药物中总磷脂含量的测定方法通过采用外标法代替了现有的HPLC方法测定血红蛋白类载氧药物中总磷脂含量，与现有的HPLC方法相比，其提高了检测通量，缩短了样品检测时间，降低了检测成本，减少了操作步骤，从而实现了简单、快速、灵敏地测定血红蛋白类载氧药物中总磷脂含量。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种血红蛋白类载氧药物中总磷脂含量的测定方法。

背景技术

磷脂（Phospholipid）也称磷脂类、磷脂质，是指含有磷酸的脂类，属于复合脂。磷脂组成生物膜的主要成分，分为甘油磷脂与鞘磷脂两大类，分别由甘油和鞘氨醇构成。磷脂为两性分子，一端为亲水的含氮或磷的头，另一端为疏水（亲油）的长烃基链。由于此原因，磷脂分子亲水端相互靠近，疏水端相互靠近，常与蛋白质、糖脂、胆固醇等其它分子共同构成脂双分子层，即细胞膜的结构。目前，人红细胞膜磷脂研究结果目前较为成熟，其中含量分析结果可以参考文献（参考VirtanenJA,ChengKH,SomerharjuP.Phospholipidcompositionofthemammalianredcellmembranecanberationalizedbyasuperlatticemodel.ProcNatlAcadSciUSA.1998Apr28;95(9):4964-9.）。人红细胞膜磷脂，其主要成份主要是：磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholine）、鞘磷脂（Sphingomyelin）、磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine）、磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine），这四种磷脂约占人红细胞膜磷脂97.3%。

作为新型血红蛋白类携氧载氧体，人（动物）血液来源血红蛋白类携氧药物总磷脂定量是质量控制关键指标之一。目前研究表明红细胞膜磷脂具有较复杂的生理功能，如果残余磷脂含量超标，其输注含量过高，有可能会引起输注时候的生物毒性,研究表明（参考FeolaM,SimoniJ,CanizaroPC,TranR,RaschbaumG,BehalFJ.Toxicityofpolymerizedhemoglobinsolutions.SurgGynecolObstet.1988Mar;166(3):211-22.）,以四种牛聚合血红蛋白和兔子血浆作为输注液体，给失血三分之一的5组兔子作为换血模型动物。结果发现存在磷脂乙醇胺和磷脂丝氨酸组，内毒素组以及超大聚合分子量组的输注液体，对换血模型造成提供了33%的致死率，引起血液动力学不稳定，呼吸和肾代谢不充分，提供肝脏代谢酶水平，血小板减少，白细胞减少，弥散性血管内凝血及激活备用补体激活通路；激活实验动物血液中的补体通路（参考FeolaM,SimoniJ,DobkeM,CanizaroPC.Complementactivationandthetoxicityofstroma-freehemoglobinsolutionsinprimates.CircShock.1988Aug;25(4):275-90.）；引起血管性收缩和激活血液凝血通路，从而引起血液系统的混乱（参考FeolaM,SimoniJ,TranR,LoxCD,CanizaroPC.Toxicfactorsintheredbloodcellmembrane.JTrauma.1989Aug;29(8):1065-75.）。因此，必须建立一种快速、灵敏度高的血红蛋白类载氧药物中总磷脂含量检测方法。

目前文献报道的方法多用高效液相色谱法（HPLC）通过蒸发光散射检测器（ELSD）测定单一磷脂含量（参考Rabinovich-GuilattL,DubernetC,GaudinK,etal.Phospholipidhydrolysisinapharmaceuticalemulsionassessedbyphysicochemicalparametersandanewanalyticalmethod.EurJPharmBiopharm.2005Sep;61(1-2):69-76.）。其缺点是不能快速检测血红蛋白类载氧药物总磷脂的含量，必须通过多次实验分别检测单一磷脂含量，最后加和成总磷脂含量。这样操作繁复、而且检测灵敏度达不到要求，必须要对检测样品进行一定富集。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种血红蛋白类载氧药物中总磷脂含量的测定方法，以代替现有的HPLC方法，实现简单、快速、灵敏地测定血红蛋白类载氧药物中总磷脂含量。

本发明所采用的技术方案为：

一种血红蛋白类载氧药物中总磷脂含量的测定方法，包括以下步骤：

A.精确量取供试样品适量于玻璃试管内，待供试样品中的有机溶剂挥发完全后，加入适量优级纯高氯酸进行消解反应，将样品中的总磷脂转变为无机磷，待消解完全后，得消解液；取适量所述消解液并加入适量的纯化水及所述无机磷显色液反应完全，得到反应液，通过紫外分光光度计测定所述反应液以及作为空白的相应溶剂的吸光度。

B.样品中总磷脂含量的计算：取磷酸二氢钾标准液稀释成不同的浓度作为外标标准液，并以紫外分光光度计测得的各外标标准液的吸光度制作外标标准曲线，以步骤A中测得的所述反应液液的吸光度对照外标标准曲线计算出1ml所述反应液中的无机磷含量，根据下列公式Ⅰ计算出样品中总磷脂的测定含量；

取适量磷脂酰乙醇胺标准液作为内标物加入到供试样品中，重复上述步骤A，通过回收试验得到该测量方法的回收率，根据下列公式Ⅱ计算出样品中总磷脂含量；

公式Ⅰ：样品中总磷脂的测定含量=1ml反应液中的无机磷含量×26.31；

公式Ⅱ：样品中总磷脂含量=样品中总磷脂的测定含量/回收率。

通过步骤A的测定操作，将供试样品溶液经过加热消解，使样品中的所有有机磷完全转变为无机磷后，得消解液；取适量消解液并加入适量的纯化水及无机磷显色液，待转化的无机磷与无机磷显色液反应完，以便是无机磷在紫外分光光度计中显色完全，再通过紫外分光光度计测定供试样品溶液以及作为空白的相应溶剂的吸光度，紫外分光光度计的波长为560-690nm，从而测定出样品中总磷脂全部转变成无机磷后的吸光度。步骤B中的优级纯高氯酸为市售的优级纯高氯酸，其质量浓度为70%~72%。

通过步骤B，以磷酸二氢钾标准液稀释成不同的浓度的外标标准液，通过测定的各外标标准液的吸光度绘制出外标标准曲线，将步骤B中测得的供试样品溶液的吸光度与外标标准曲线对照，计算出步骤B中1ml反应液中的无机磷的含量，根据公式Ⅰ计算出样品中总磷脂的测定含量。

为了避免测量方法所产生的误差，以磷脂酰乙醇胺标准液作为内标物加入到所述供试样品溶液中，通过回收试验得到该测量方法的回收率，并通过公式Ⅱ，最终得到样品中总磷脂含量。

上述测定方法采用外标法测定血红蛋白类载氧药物总磷脂的含量，通过一次检测得到血红蛋白类载氧药物总磷脂的含量，而避免HPLC方法检测血红蛋白类载氧药物总磷脂的含量时必须通过多次实验，分别检测单一磷脂含量，最后加和成总磷脂含量，因此提高了检测通量，缩短了样品检测时间，降低了检测成本，具有良好的经济效应。

而且外标法比HPLC法的测量结果更加准确，灵敏度更高，因此本发明的测定方法可以简单、快速、灵敏地测定血红蛋白类载氧药物中总磷脂含量。

进一步，所述紫外分光光度计的波长为560-690nm。

通过对磷酸二氢钾标准溶液全波长扫描，测得无机磷在560-690nm波长处均由吸收，因此，紫外分光光度计的波长为560-690nm，以便于测定反应液中无机磷的吸光度。

进一步，所述紫外紫外分光光度计的波长为634nm。

无机磷的最大吸收峰位于634nm波长处，因此，紫外分光光度计的波长优选为560-690nm。

进一步，步骤A中的所述供试样品中的有机溶液的挥发温度为60~105℃，并在通风橱内进行。

为了使供试样品中的有机溶液能够尽快挥发，有机溶液的挥发温度为60~105℃，并在通风橱内进行，而且通过通风橱可以防止有机溶液挥发对环境污染，提高试验的安全性。

进一步，步骤A中的所述消解反应在160℃油浴加热条件下进行。

消解反应的温度优选为160℃，可以采用油浴加热，是试管内的反应液达到160℃。

进一步，血红蛋白类载氧药物中总磷脂含量的检测灵敏度下限为0.4933ppm。

通过分析，该测定方法的最低检测限度为0.4933ppm，因此具有较高的灵敏度。

进一步，所述的测定方法还包括步骤A中的所述供试样品和所述无机磷显色液的制备以及步骤B中的所述磷酸二氢钾标准液和所述磷脂酰乙醇胺标准液的制备；所述供试样品的制备包括萃取液的制备，所述无机磷显色液的制备包括吐温20溶液和储存液的制备，所述储存液的制备包括孔雀石绿溶液的制备和钼酸铵溶液的制备；

所述供试样品的制备：在样品中加入萃取液，振荡混匀后在常温下进行离心，离心后移除血红蛋白可见上下层透明液面，采用虹吸法移除上清液，得到下层总磷脂萃取液作为供试样品，4℃备用；

所述萃取液的制备：将氯仿与甲醇混合，配制成萃取液；

所述无机磷显色液的制备：将储存液与吐温20溶液按体积比3：1混合，配制成无机磷显色液；所述无机磷显色液现配现用；

所述吐温20溶液的制备：精密称取吐温20适量，用超纯水溶解，配制成重量含量为1.5%的吐温20溶液；

所述储存液的制备：将孔雀石绿溶液与钼酸铵溶液按体积比3：1混合后过滤，室温避光保存2~3周，得到储存液；

所述孔雀石绿溶液的制备：精密称取孔雀石绿适量，用超纯水溶解，配制成重量含量为0.4%的孔雀石绿溶液；

所述钼酸铵溶液的制备：精密称取钼酸铵适量，用5mol/L的盐酸溶解，配制成重量含量为4.2%的钼酸铵溶液；

所述磷酸二氢钾标准液的制备：精密称取磷酸二氢钾标准品适量，用超纯水溶解，配制成2μg/ml的磷酸二氢钾标准液；

所述磷脂酰乙醇胺标准液的制备：精密称取磷脂酰乙醇胺标准品适量，用所述萃取液溶解后，配制成浓度为0.5mg/ml的磷脂酰乙醇胺标准液。

通过溶液的制备步骤完成测定中所需各溶液及供试样品的制备，便于在测定过程中直接取用，节约实验时间。

进一步，所述萃取液的制备中，所述样品与所述萃取液的体积比为1:1~8。

进一步，所述样品与所述萃取液的体积比为1:4~8，且所述萃取液的为预冷萃取液，预冷温度为-20℃。

萃取液中，氯仿与甲醇的体积比为1：1~8。在制备供试样品时，离心后，为了便于移除血红蛋白，优选地，氯仿与甲醇的体积比为1:4~8，并经过低温冷冻处理，预冷温度优选为-20℃。

进一步，步骤A中的所述磷酸二氢钾标准品为经过干燥处理的磷酸二氢钾标准品。

磷酸二氢钾标准品容易吸潮，为了使制备的磷脂酰乙醇胺标准液准确，保证测量结果的精确，在磷脂酰乙醇胺标准液的制备前，需要对磷酸二氢钾标准品进行干燥处理，以除去多余的水份，因此，有利于测量结果的精确。

本发明的有益效果为：

本发明所提供的血红蛋白类载氧药物中总磷脂含量的测定方法通过采用外标法代替了现有的HPLC方法测定血红蛋白类载氧药物中总磷脂含量，与现有的HPLC方法相比，其提高了检测通量，缩短了样品检测时间，降低了检测成本，减少了操作步骤，从而实现了简单、快速、灵敏地测定血红蛋白类载氧药物中总磷脂含量。

附图说明

图1为磷酸二氢钾标准溶液的全波长扫描图；

图2为磷酸二氢钾标准溶液于玻璃比色皿中测得的反应动力曲线图。

具体实施方式

实施例1

孔雀石绿溶液的制备：精密称取孔雀石绿0.4mg，用Pall超纯水100ml溶解，配制成重量含量为0.4%的孔雀石绿溶液。

钼酸铵溶液的制备：精密称取钼酸铵1.008g，用5mol/L的盐酸溶解，配制成重量含量为4.2%的钼酸铵溶液。

吐温20溶液的制备：精密称取0.375g吐温20，用Pall超纯水25ml溶解，配制成重量含量为1.5%的吐温20溶液。

储存液的制备：将所述孔雀石绿溶液与所述钼酸铵溶液按体积比3：1混合后过滤，室温避光保存2~3周，得到储存液。

无机磷显色液的制备：将所述储存液与所述吐温20溶液按体积比3：1混合，配制成无机磷显色液；所述无机磷显色液现配现用。

磷酸二氢钾标准液的制备：精密称量磷酸二氢钾1.000g于10ml小烧杯盛中，然后放置在烘箱内于110℃干燥1小时至恒重。快速精密称量干燥后的磷酸二氢钾0.5492g，用超纯水溶解定容至250ml（0.5mg/ml）；再用移液器吸取1ml，加入249ml超纯水，最终配制成250ml浓度为2μg/ml的磷酸二氢钾标准液。

磷脂酰乙醇胺标准液的制备：精密称取磷脂酰乙醇胺标准品5.0mg，用10ml所述萃取液溶解后，配制成浓度为0.5mg/ml的磷脂酰乙醇胺标准液；

萃取液的制备：将氯仿与甲醇按体积比2：1混合，配制成萃取液。

供试样品溶液的制备：取100μl样品于EP管内，将在-20℃预冷的萃取液加入到EP管内混匀，EP管内所加萃取液与样品的体积比分别为8:1。然后经涡旋震荡30秒后，将EP管在室温下放入台式冷冻离心机内离心5分钟，离心机的转速为5000rpm。将离心后的溶液用移液器吸头移除血红蛋白，可见上下层透明液面，然后用虹吸法去除上清液，剩余下层总磷脂萃取液，制备得到供试样品溶液，并在4℃保存备用。

实施例2

样品与萃取液体积比选择试验：在普通室温下，样品与萃取液体积比1:4和1:8时，容易造成血红蛋白溶液样品迅速蛋白质变性，从而可能会影响抽提效果。因此，将制备好的萃取液提前放入深低温冰箱中预冻30min。

样品与萃取液体积比为1:1、1:2、1:4、1:8时，体积比为1:1和1:2的实验中，随着温度恢复成室温，血红蛋白溶液呈粉红色，血红蛋白没有剧烈聚合变性；而体积比为1:4和1:8的实验中，随着温度恢复成室温，血红蛋白溶液呈暗红色，血红蛋白聚合变性。在室温进行离心操作，离心机转速为5000rpm，离心时间为5min。离心后，体积比为1:1和1:2的实验中，血红蛋白离心不易挑出，管壁有微量残留；而体积比为1:4和1:8的实验中，血红蛋白因离心力作用，血红蛋白压缩成圆饼状，易挑出，管壁无残留，因此，优选地，样品与萃取液的体积比为1:4~8，且该萃取液为经过预冷的萃取液，预冷温度优选为-20℃。

实施例3

磷酸二氢钾标准溶液全波长扫描和反应动力曲线：于石英比色皿中量取300μl磷酸二氢钾标准溶液，然后加入100μl优级纯高氯酸以及无机磷显色液2ml，用Ultrospec6300pro紫外可见分光光度计从200-900nm全波长扫描，扫描波长间隔为1nm，扫描速度为2649nm/min；从开始加入无机磷显色液起，以后每间隔5min做一次全波长扫描，记录时间为0min、5min、10min、15min、20min。测定结果如图1所示，反应测定波长在560-690nm波长都是可以用于测定的，而最大吸收峰对应于634nm波长，因此在使用Ultrospec6300pro紫外可见分光光度计检测供试样品溶液和磷酸二氢钾标准溶液的吸光度时，优选波长为634nm。

用Ultrospec6300pro紫外可见分光光度计进行反应动力曲线模式测定，扫描间隔为2min/次，扫描时间长度1个小时。测量结果如图2所示，可见20分钟后两条曲线均趋于平稳，说明无机磷与无机磷显色液反应完全，因此使用Ultrospec6300pro紫外可见分光光度计的测定时间选择在加入无机磷显色液20分钟以后进行。

实施例4

供试样品溶液中总磷脂含量的测定方法：取实施例1中制备的各供试样品溶液的一半体积置于玻璃试管内，在60℃放入通风橱内使溶液中有机溶剂挥发完全，然后取出试管冷却后加入1ml优级纯高氯酸，并于160℃在油浴锅内进行消解，使样品中的总磷脂中的有机磷成份转变为无机磷。待消解完全后，得到消解液。

在试管内加入纯化水至0.3ml，再加入上述消解液0.085ml-0.095ml以及无机磷显色液2ml，得到反应液，20分钟后通过Ultrospec6300pro紫外可见分光光度计测定出供试样品溶液的吸光度（OD样品）。

取0.3ml纯水于试管中，并加入0.1ml优级纯高氯酸以及无机磷显色液2ml作为空白，通过Ultrospec6300pro紫外可见分光光度计测定出供试样品溶液的吸光度（OD空白）。

实施例5

样品中总磷脂含量的计算

外标标准曲线绘制：将实施例1中配制的2μg/ml的磷酸二氢钾标准溶液,等比稀释成6份，各取300μl，并加入0.1ml优级纯高氯酸以及无机磷显色液2ml。稀释后的磷酸二氢钾标准溶液中的无机磷的量分别为0.6μg、0.3μg、0.15μg、0.075μg、0.0375μg、0.01875μg，并通过Ultrospec6300pro紫外可见分光光度计测定相应的每份稀释后的磷酸二氢钾标准溶液的吸光度（OD标准液）。根据空白的吸光度和每份稀释后的磷酸二氢钾标准溶液的吸光度绘制外标标准曲线。

外标标准曲线的绘制为现有方法，根据△OD=OD标准液-OD空白；△OD=OD样品-OD空白，作出散点图，得到外标标准曲线。同时，根据线性回归方程：y=a*ln(x)+b，R2=C，其中a，b根据每次试验不同可能为不同的常数，当C值大于0.980时，说明标准曲线可以使用。本实施例中测得a=1.0215；b=0.0421；R²=0.9953＞0.980，且接近1，因此，在选择实验浓度范围内的磷酸二氢钾标准液吸光度与浓度呈良好的线性关系，可以采用外标标准曲线对照并计算样品中总磷脂的测定含量。

将实施例4中测得的供试样品溶液的吸管度与外标标准曲线对照，并计算得到1ml反应液中的无机磷含量，根据下列公式Ⅰ计算出样品中总磷脂的测定含量；取适量所述磷脂酰乙醇胺标准液作为内标物加入到所述供试样品溶液中，得到该测量方法的回收率，根据下列公式Ⅱ计算出样品中总磷脂含量；

公式Ⅰ：样品中总磷脂的测定含量=1ml反应液中的无机磷含量×26.31；

公式Ⅱ：样品中总磷脂含量=样品中总磷脂的测定含量/回收率。

实施例6

回收率和精密度：计算测定方法回收率为86.86±3.51%（n=3），当回收率大于80%时，说明该测定方法可行。另外，计算工艺流程中总磷脂在各个步骤中去除情况。结果如下表1所示：

实施例7

检测限度：通过计算或外推法得到检测限度的估算值，可对一系列接近或等于检测限度样品的逐个分析来论证这个估算值，将磷酸二氢钾标准品等梯度分别稀释到0.02μg/ml、0.04μg/ml、0.06μg/ml、0.08μg/ml、0.10μg/ml，多次测定空白的吸光度以及5个梯度浓度的磷酸二氢钾标准品的吸光度，测量结果如下表2（“Mean”指平均数，“SD”指标准偏差，“RSD”指相对标准偏差）所示：

根据表2可知，0.02μg/ml浓度不符合规定；0.04μg/ml、0.06μg/ml、0.08μg/ml、0.10μg/ml浓度符合规定。因此，得知外标标准曲线的检测限度的下限为0.0625μg/ml，其样品中总磷脂含量的检查限度的下限为0.4933ppm。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。