一种靶向型九聚精氨酸及其在核糖核酸干扰中的应用

摘要

一种靶向型九聚精氨酸及其在核糖核酸干扰中的应用，结构如下：R-R-R-R-R-R-R-R-R-X-Y，其中R代表L-构型的精氨酸，X为连接基团，Y为靶向分子，X-Y连接在九聚精氨酸的N端或C端，其中X为含一至十个碳的烷基、低聚或多聚乙二醇、二硫键、酰胺键、酯键或醚键，Y为叶酸、透明质酸、链状RGD肽、环状RGD肽、RVG肽、TAT肽、MPG肽、EB1肽、EGFR抗体或HER2抗体。该靶向型九聚精氨酸可实现对小干扰核糖核酸和微小核糖核酸的静电包裹进而实现这两类核糖核酸的细胞内靶向运输。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种靶向型九聚精氨酸及其在核糖核酸干扰 中的应用。

背景技术

在哺乳动物细胞中，核糖核酸干扰(RNAinterference,RNAi)是一种广泛和基础的生物 过程，并在生理病理过程中起着决定性的作用。在RNAi过程中，小分子非编码RNA，如内 源性的微小核糖核酸(microRNA,miRNA)和外源性的小干扰核糖核酸(smallinterferingRNA, siRNA)可通过碱基互补配对的原则使它们的靶信使核糖核酸(mRNA)被降解或抑制它们 的翻译，这种广泛的对靶基因表达的调控过程与疾病的发生发展密切相关。因而，siRNA和 miRNA近年来已经被视为可通过RNAi实现治疗目的的一类新型的先导药物。然而，由于 siRNA和miRNA的负电性及不稳定性，siRNA和miRNA的细胞内运输仍然需要额外的载体 实现，这就要求所用的载体具有优良的生物相容性、可降解性及运输操作过程的简便性。另 外，在运输过程中如何实现siRNA和miRNA的靶向运输仍然是一个重要的需要解决的问题。

九聚精氨酸是一类具有优良生物相容性的、正电性的阳离子多肽，已被证实具有较好的 细胞膜通透性。本发明中，发明人发现了可在九聚精氨酸的末端接入靶向细胞膜表面受体的 分子，利用靶向型九聚精氨酸实现小干扰核糖核酸和微小核糖核酸的细胞内靶向运输，并进 而利用核糖核酸干扰达到治疗目的。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种靶向型九聚精氨酸及其在核糖核酸干扰中的应用，可 实现对小干扰核糖核酸和微小核糖核酸的静电包裹进而实现这两类核糖核酸的细胞内靶向运 输。

技术方案：一种靶向型九聚精氨酸，结构如下：

R-R-R-R-R-R-R-R-R-X——Y

其中R代表L-构型的精氨酸，X为连接基团，Y为靶向分子，X-Y连接在九聚精氨酸的 N端或C端，其中X为含一至十个碳的烷基、低聚或多聚乙二醇、二硫键、酰胺键、酯键或 醚键，Y为叶酸、透明质酸、链状RGD肽、环状RGD肽、RVG肽、TAT肽、MPG肽、EB1 肽、EGFR抗体或HER2抗体。

所述的靶向型九聚精氨酸为环状RGD修饰的九聚精氨酸，结构式为

所述靶向型九聚精氨酸在siRNA和miRNA包裹、靶向运输的应用。

所述靶向型九聚精氨酸在包裹siRNA和miRNA后作为制备治疗疾病药物中的应用。

所述靶向型九聚精氨酸作为siRNA和miRNA类核糖核酸干扰药物的靶基因分析中的应 用。

本发明采用现代分子生物学和化学生物学的方法研究靶向型九聚精氨酸在siRNA和 miRNA细胞内靶向运输中的应用。

(一)siRNA和miRNA的包裹

将靶向型九聚精氨酸与siRNA或miRNA稀释于高糖培养基或磷酸盐缓冲液中，混匀后 置于室温放置30分钟。

(二)siRNA和miRNA的靶向运输

选取细胞膜表面富含上述靶向基团受体的细胞系，将上述得到的靶向型九聚精氨酸和 siRNA或miRNA的混合液加入到细胞中，2小时后将细胞培养液换成正常细胞生长液。24 小时后，提取细胞内RNA并用定量RT-PCR对细胞内siRNA或miRNA的表达量进行测定。

(三)荧光素酶实验

通过靶向型九聚精氨酸运输的siRNA和miRNA刺激细胞内的荧光素酶信号变化判断其 生物活性，具体流程如下：

(1)构建含有siRNA或miRNA结合位点的荧光素酶质粒；

(2)将质粒到细胞内后，用靶向型九聚精氨酸运输相应的siRNA或miRNA；

(3)48小时后测定细胞内荧光素酶信号。

有益效果：本发明提供一种靶向型九聚精氨酸可实现对小干扰核糖核酸和微小核糖核酸 的静电包裹，进而实现这两类核糖核酸的细胞内靶向运输。利用靶向型九聚精氨酸运输上述 两类核糖核酸实现的治疗。

附图说明

图1为凝胶电泳分析图；

图2为纳米颗粒尺寸分布图；

图3为纳米颗粒ZETA电位趋势图；

图4为透射电镜分析图；

图5为U87MG细胞内miR-34a运输定量分析图；

图6为293T细胞内miR-34a运输定量分析图；

图7为U87MG细胞荧光素酶实验结果。

具体实施方式

实施例1、环状RGD修饰的九聚精氨酸(9R-RGD)对miR-34a的包裹

将100pmolemiR-34a溶解于100μLDMEM中，后将0.2，0.6，1，1.4，1.6μL5mM9R-RGD 分别加入到DMEM中，得到五组不同摩尔比的混合液，将混合液置于室温中放置30分钟。

凝胶电泳分析

配制2％琼脂糖凝胶，分别取上述混合液进行电泳分析，并用溴化乙锭对miR-34a进行显 色。从图1中可见，当9R-RGD的摩尔比逐渐升高时，miR-34a与其的结合也在增加。利用 动态光散射和ZETA电势分析仪对其进行分析，也证明了随着9R-RGD的摩尔比逐渐升高时 纳米尺寸的颗粒也在逐渐形成(图2)，电位也在逐渐变为正电性(图3)。透射电镜图表明当 摩尔比为50:1时，两者形成了均一分散的纳米颗粒，直径大约为80nm(图4)。

靶向细胞内运输

将U87MG细胞种入12孔板中，24小时后，将含40pmolemiR-34a的混合液加入到细胞 培养基中，2小时后将细胞培养液换成含2vt.％FBS，1vt.％PS的高糖DMEM培养液继续培 养24小时后，用TRIZOL提取细胞内RNA。实时荧光定量PCR结果显示9R-RGD的摩尔比 逐渐升高时进入细胞的miR-34a的量也在逐渐增加，当摩尔比达到50:1时基本可以达到饱和 (图5)。

取不含RGD受体的293T细胞作为对照，进行上述相同实验。在293T细胞中没有观察 到类似的结果(图6)，表明该方法可以实现miR-34a的靶向运输。

miRNA表达量的测定

取出1μg的RNA进行逆转录反应制备相应的cDNA样品。具体逆转录反应10μL体系为：

5xAMVbuffer(Takara)2μL

AMV(Takara)0.5μL

RTprimer(ABI)0.5μL

dNTPmixture(Takara)1μL

DEPCH₂O5μL

RNA1μL

反应程序为：16℃30min，42℃30min，85℃5min，4℃保存。制备好的cDNA再用 探针法(Taqman)PCR对miR-122进行实时定量。20μL

TaqmanPCR反应体系为：

10xbuffer(Takara)2μL

MgCl₂(25mM)(Takara)1.2μL

Taq(Takara)0.3μL

dNTPmixture(10mM)0.4μL

Probe(ABI)0.33μL

cDNA1μL

DistilledH₂O14.77μL

PCR反应程序为95℃5min，95℃15s后60℃1min40个循环扩增，实时荧光信号均在每个 循环的60℃采集。

荧光素酶实验

(1)报告质粒的构建

使用HindIII和Spel(ITakara)内切酶剪切Luciferase报告质粒(Promega)的3’UTR端， 将得到的片断进行电泳分离纯化。miR-34a的互补序列分别通过DNA连接酶，T4ligase (Takara)，插入到纯化得到的luciferase报告质粒中，并转化到感受态大肠杆菌内，再通过 含有氨苄的筛选平板筛选得到可能的阳性质粒。最终将该报告质粒进行测序确认其正确性 (Invitrogen)。

(2)荧光素酶分析

鉴定后的报告质粒通过转染进入U87MG细胞中。首先将细胞种到24孔板中，当细胞密 度达到70％-80％时，将0.25μgmiR-34a报告质粒和0.15μgβ-galactosidase内参质粒用 Lipo-2000fectamine试剂转染进细胞，转染操作遵循Invitrogen产品说明。在转染4小时后， 将20pmolemiR-34a用环状RGD修饰九聚精氨酸运输到细胞中。2小时后，将细胞培液换成 含2vt.％FBS，1vt.％PS的高糖DMEM培养液继续培养48小时后，测定luciferase和 β-galactosidase内参信号。结果表明以靶向型九聚精氨酸运输的miR-34a在进入细胞后仍然 具有基因沉默的生物学功能(图7)。

上述具体实施方式不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换 的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。