一种通过增大细菌体积而增加微生物胞内内含物积累量的方法

摘要

本发明公开了一种通过增大细菌体积而增加微生物胞内内含物积累量的方法。本发明提供了一种提高微生物胞内内含物积累量的方法，为通过改造影响微生物体积大小的基因增大微生物体积，实现提高微生物胞内内含物积累量。实验证明，本发明构建增大细菌体积的工程菌可以提高聚3羟基丁酸酯(PHB)、蛋白质、聚磷酸和碳小体等的产量，有的工程菌PHB最高可达细胞干重的80％，提高了30％。且本发明的生产工艺简单，成本低廉，应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种通过增大细菌体积而增加微生物胞内内 含物积累量的方法，内含物包括聚3羟基丁酸酯(PHB)、蛋白质、聚磷酸和碳小体等。

背景技术

微生物合成的许多内含物有实际应用，比如内含物聚3羟基丁酸酯(PHB)可以作 为生物塑料或者医用植入材料、蛋白质内含物可以是有应用价值的酶或者治疗性的多 肽、聚磷酸内含物可以用于提取磷元素作为化肥的成份，碳小体内含物有固定二氧化 碳的作用等。但是，微生物个体的狭小空间障碍了人们大量地获得这种微生物内含物。

目前已知的微生物细胞分裂基因主要有：ftsZ、ftsA、ftsQ、sulA、minCD。

微生物细胞壁合成相关基因：盘尼西林结合蛋白(PBPs)基因家族mrcA、mrcB、 pbpC、dacB、dacA、dacC、pbpG、dacD、ampC、ampH，异戊二烯isoprene合成必需 基因yluB,yacM,yabH,yacN,和yqfP，肽聚糖合成和修饰基因csbB，自溶素表达 的调控基因lytR。

结合过表达支撑细胞的骨架基因：mreB、mreC、mreD、ftsI、rodZ、mrdA、mrdB、 mbl。

对上述基因的单独或结合敲除和过表达都会引起微生物细胞的形态变化，主要是 引起细胞体积的变大。

比如，MreB是很多原核生物中起骨架作用的蛋白，敲除后细胞会变成圆形，在大 肠杆菌中敲除mreB基因后，大肠杆菌从杆状变成圆形；在此基础上过表达mreB后， 部分细胞形态变得不规则，都比野生形的体积大。

以上原理同样适用于其他细胞分裂基因、骨架合成基因以及障碍细胞体积增大的 细胞壁合成相关基因的操作引起的微生物细胞体积增大，比如ftsZ系列基因、mreB、 mreC、mreD、ftsI、rodZ、mrdA、mrdB、mbl等删除、过表达和各种结合，都能增大 细胞体积。

又如，sulA和minCDE是细胞分裂环形成的抑制基因，诱导表达sulA或/和minCDE， 使细胞只分裂不分离，细胞体积进一步增大，可以观察到菌体生长从颗粒状变成的纤 维状，胞内空间增大不仅提高了内含物的积累量，而且纤维状细胞有利于下游分离细 胞和提取内含物。

细胞体积的变大是否能够导致细胞内部可以容纳更多的内含物，成为目前研究的 热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高微生物胞内内含物积累量的方法。

本发明提供的方法，为通过改造影响微生物体积大小的基因增大微生物体积，实 现提高所述微生物胞内内含物积累量。

上述方法中，所述通过改造影响微生物体积大小的基因增大微生物体积为如下1) -3)中至少一种：

1)改变细胞分裂的基因，所述改变细胞分裂的基因的方式包括分别或结合删除 和过表达细胞分裂基因、细胞骨架合成基因以及障碍细胞体积增大的细胞壁合成相关 基因；

2)改变细胞形状和体积的基因，所述改变细胞形状和体积的基因包括支撑细胞 的骨架基因mreB、mreC、mreD、ftsI、rodZ、mrdA、mrdB或mbl；

3)改变细胞形状和体积的基因，所述细胞形状和体积的基因包括细胞分裂环形 成的抑制基因sulA、FtsZ蛋白抑制因子Min家族蛋白minCDE、细胞分裂环起始形成 基因ftsZ、细胞壁合成相关基因ddlb、mrcA、mrcB、pbpC、dacB、dacA、dacC、pbpG、 dacD、ampC或ampH。

上述提高微生物胞内内含物积累量的方法可以为敲除出发菌基因组中的mreB基 因，且向所述出发菌中共同导入mreB基因和sulA基因，且向所述出发菌中导入含有 PHB合成基因的质粒，得到的重组菌为EscherichiacoliJM109SG△mreB(ptk01， pBHR68)；其出发菌可以为EscherichiacoliJM109SG；

所述含有PHB合成基因的质粒具体为pBHR68。

上述方法中，所述敲除出发菌基因组中的mreB基因通过同源重组实现，mreB基 因的上游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1-57位核苷酸；mreB 基因的下游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1361-1417位核苷酸；

上述方法中，所述向出发菌中共同导入mreB基因和sulA基因为通过重组载体向 出发菌中共同导入mreB基因和sulA基因；所述重组载体包括驱动mreB基因表达的启 动子PmreB、mreB基因、ParaBAD、sulA基因、pSC101复制子和卡那抗性基因。所述 重组载体具体为ptK01，其核苷酸序列为序列表中的序列2。

所述同源重组为将含有mreB上游同源臂、FRT、Km、FRT、mreB下游同源臂的DNA 片段(序列1)导入出发菌中，实现敲除出发菌基因组中的mreB基因。

上述提高微生物胞内内含物积累量的方法可以为向所述出发菌中导入mreB基因， 且导入含有PHB合成基因的质粒；其出发菌可以为EscherichiacoliJM109SG；

所述含有PHB合成基因的质粒具体为pBHR68。

上述方法中，向所述出发菌中导入mreB基因的方法为通过重组载体向所述出发 菌中导入；所述重组载体包括驱动mreB基因表达的启动子PmreB、mreB基因、复制子 和氯霉素抗性基因。所述重组载体具体为pxr01，其核苷酸序列为序列表中的序列3。

所述提高微生物胞内内含物积累量的方法可以为向所述出发菌中导入minCD基 因，且导入含有PHB合成基因的质粒；其出发菌可以为盐单胞菌TD08；

所述含有PHB合成基因的质粒具体为pBHR68。

上述方法中，所述向所述出发菌中导入minCD基因的方法为通过重组载体向所述 出发菌中导入MinCD基因；所述重组载体为将含有LacI^q-Ptrc启动子和minCD基因的 DNA片段插入表达载体中，得到的载体，其中表达载体为pSEVA341，重组载体 pSEVA341-LacI^q-Ptrc-MinCD为将序列表中序列4所示的核苷酸LacI^q-Ptrc-MinCD插 入pSEVA341载体的XbaI和SacI酶切位点间得到的载体；

所述含有LacI^q-Ptrc启动子和minCD基因的DNA片段的核苷酸序列具体为序列表 中序列4。

所述提高微生物胞内内含物积累量的方法可以为敲除出发菌基因组中的sigD、 lytE和lytD基因，且导入含有PHB合成基因的质粒；其出发菌可以为枯草芽孢杆菌 168；

所述含有PHB合成基因的质粒具体为pBHR68。

上述方法中，所述敲除通过同源重组实现；其中，用于敲除出发菌sigD基因的 上游同源臂为序列15自5’末端第20-613位核苷酸，下游同源臂为序列15自5’末 端第614-1201位核苷酸；

用于敲除出发菌lytE基因的上游同源臂为序列16自5’末端第20-1025位核苷 酸，下游同源臂为序列16自5’末端第1851-2765位核苷酸；

用于敲除出发菌lytD基因的上游同源臂为序列17自5’末端第20-1184位核苷 酸，下游同源臂为序列17自5’末端第2265-3436位核苷酸。

所述同源重组具体为将含有SigD上下游同源臂的DNA片段(序列15自5’末端 第20bp-1201bp)通过重组载体pCU-SigD(序列15)、含有lytE上游同源臂、抗性 基因Spe和lytE下游同源臂的DNA片段(序列16自5’末端第20bp-2765bp)通过 重组载体pCU-lytE-spe(序列16)和含有lytD上游同源臂、抗性基因Em和lytD下 游同源臂的DNA片段(序列17自5’末端第20bp-3436bp)通过重组载体pCU-lytD-Em (序列17)共同导入168中，通过同源重组替换其基因组上的SigD、lytE和lytD基 因；

所述提高微生物胞内内含物积累量的方法可以为敲除出发菌基因组中的dacA、 ddlB、ampC、ampH和mrcB基因，且导入含有PHB合成基因的质粒；其出发菌可以为 EscherichiacoliJM109SG。

所述含有PHB合成基因的质粒具体为pBHR68。

上述方法中，所述敲除出发菌基因组中的dacA、ddlB、ampC、ampH和mrcB基因 通过同源重组实现，其中，

用于敲除出发菌基因组中的dacA基因的上游同源臂核苷酸序列为序列5，下游同 源臂的核苷酸序列为序列6；

用于敲除出发菌基因组中的ddlB基因的上游同源臂核苷酸序列为序列9，下游同 源臂的核苷酸序列为序列10；

用于敲除出发菌基因组中的ampC基因的上游同源臂核苷酸序列为序列11，下游 同源臂的核苷酸序列为序列12；

用于敲除出发菌基因组中的ampH基因的上游同源臂核苷酸序列为序列13，下游 同源臂的核苷酸序列为序列14；

用于敲除出发菌基因组中的mrcB基因的上游同源臂核苷酸序列为序列7，下游同 源臂的核苷酸序列为序列8。

上述同源重组为将含有dacA上游同源臂、FRT、Km、FRT、dacA下游同源臂的DNA 片段(序列见实施例3的一)、含有ddlB上游同源臂、FRT、Km、FRT、ddlB下游同源 臂的DNA片段(序列见实施例3的一)、含有ampC上游同源臂、FRT、Km、FRT、ampC 下游同源臂的DNA片段(序列见实施例3的一)、含有ampH上游同源臂、FRT、Km、FRT、 ampH下游同源臂的DNA片段(序列见实施例3的一)、含有mrcB上游同源臂、FRT、 Km、FRT、mrcB下游同源臂的DNA片段(序列见实施例3的一)均导入Escherichiacoli JM109SG中，通过同源重组替换基因组中的dacA、ddlB、ampC、ampH、mrcB基因。

上述方法中，所述内含物为聚3羟基丁酸酯(PHB)、蛋白质、聚磷酸或碳小体。

上述方法中，所述出发菌或微生物为细菌，所述细菌为大肠杆菌、嗜盐菌、假单 胞菌或芽孢杆菌。

由上述的方法制备的重组菌也是本发明保护的范围。

上的重组菌在提高微生物胞内内含物积累量中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述内含物为聚3羟基丁酸酯(PHB)、蛋白质、聚磷酸或碳小体。

所述微生物为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，所述革兰氏阳性菌具体为芽孢杆 菌，所述革兰氏阴性菌具体为大肠杆菌、嗜盐菌或假单胞菌。

本发明通过基因操作，增大了细菌体积，从而增加了微生物胞内内含物包括聚3 羟基丁酸酯(PHB)、蛋白质、聚磷酸或碳小体(Carboxysome)等的积累量。本发明所 用的微生物可以是革兰氏阴性和阳性菌、包括但不仅限于大肠杆菌、嗜盐菌、假单胞 菌、芽孢杆菌等。

本发明提供的增大细菌体积的方法，主要是通过分别或结合删除和过表达细胞分 裂基因、细胞骨架合成基因以及障碍细胞体积增大的细胞壁合成相关基因来实现的。 比如从出发菌中通过同源重组法敲除细胞分裂基因和/或者障碍细胞体积增大的细胞 壁合成相关基因如mreB、mreC、mreD、ftsI、rodZ、mrdA、mrdB、mbl，还可以在此 基础上在质粒上补偿表达敲除的基因和诱导表达分裂环形成的抑制基因，然后将质粒 转化到敲除株，得到重组菌A；另一方面，也可在出发菌中过表达细胞分裂基因以及 障碍细胞体积增大的细胞壁合成相关基因，比如mreB、mreC、mreD、PBP2、PBP3、RodA、 RodZ、mrdA、mrdB、mbl，得到重组菌B。由此产生的重组菌在大量积累内含物的情况 下体积不断增大，或者从颗粒状细菌成为纤维丝状细菌，两者都能使内含物产量增加。

本发明中的微生物胞内内含物包括聚3羟基丁酸酯(PHB)、蛋白质、聚磷酸或碳小 体(Carboxysome)等，既可由野生微生物合成，也可由外源基因表达获得。

本发明用微生物内含物包括聚3羟基丁酸酯聚3羟基丁酸酯(PHB)、蛋白质、聚 磷酸和碳小体等进行了实验，发现增大微生物细胞体积确实使聚3羟基丁酸酯聚3羟 基丁酸酯(PHB)、蛋白质、聚磷酸和碳小体等胞内内含物的产量得到提高。

所述sulA基因诱导型启动子为阿拉伯糖启动子，序列如序列表中序列2自5’末 端第3785-5017位核苷酸，但不限于阿拉伯糖启动子。

所述出发菌为大肠杆菌，具体为EscherichiacoliJM109SG。但不限于大肠杆菌 (Escherichiacoli)。

所述MreB编码基因通过重组载体ptk01导入所述基因组上mreB敲除的中间菌。

所述敲除方法中的同源重组片段氨基酸序列为序列表中序列1。

所述重组载体ptk01为通过Gibsonassembly方法得到的载体。

所述重组载体ptk01和pxr01中mreB基因的启动子序列为序列表中序列2自5’ 末端第1065-1423位核苷酸。

本发明的实验证明，本发明通过增大细菌体积而增加微生物胞内内含物积累量的 方法，可以通过分子(基因)操作来实现，比如改变细胞分裂的基因操作，包括分别 或结合删除和过表达细胞分裂基因以及障碍细胞体积增大的细胞壁合成相关基因等； 本发明构建增大细菌体积的工程菌可以提高PHB、蛋白质、聚磷酸和碳小体等的产量， 有的工程菌PHB最高可达细胞干重的80％，提高了30％。且本发明的生产工艺简单，成 本低廉，应用前景广阔。

附图说明

图1为大肠杆菌重组菌构建示意图

图2为质粒ptk01(左)和PXR01(右)的结果示意图

图3左图为发酵48h后重组菌与对照菌的细胞数目比较，右图为重组菌积累PHB 后的沉降速率

图4为扫描电镜观察重组菌积累PHB

图5为透射电镜观察重组菌中PHB的积累方式

图6诱导表达minCD的盐单胞菌TD08菌体体积和PHB积累事宜图

图7为芽孢杆菌变形后形态图

图8为敲除细胞壁合成基因的E.coliJM109SG△dacA△ddlb△AmpC△AmpH△mrcB 菌株生产PHB后的形态图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

图1为大肠杆菌重组菌构建示意图。

所用酶试剂均购自MBIFermentas公司，提取质粒所用的试剂盒购自北京博迈德 科技发展公司，回收DNA片段所用的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤按 照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。

培养基配方：

LB培养基含：5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L 蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042)，10g/LNaCl，其余为水。调pH 值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。

MM培养基配置方法：2g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)， 其余为水。溶解后高压灭菌。冷却后每50ml加入1ml组分I(10g(NH₄)₂SO₄和2gMgSO₄加水定容至200ml，高压蒸汽灭菌)和组分II(96.5gNa₂HPO₄.12H₂O和15gKH₂PO₄， 加水定容至200ml，高压蒸汽灭菌)。(NH₄)₂SO₄，MgSO₄，Na₂HPO₄.12H₂O，KH₂PO₄购自国 药集团化学试剂有限公司，目录号分别为10002992，10034998，10020392，1017628。

在实际培养过程中，可向上述培养基中再添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳 定性，如50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL硫酸卡那霉素。

实施例1、通过改变mreB、sulA和minCD基因增大细胞体积提高内含物产量

一、工程菌的构建

1、敲除出发菌mreB基因构建EscherichiacoliJM109SG△mreB

以mreB-KmTF和mreB-KmTR为引物，以pKD13质粒(记载在如下文献中：Datsenko K&WannerB(2000)One-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichia coliK-12usingPCRproducts.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences oftheUnitedStatesofAmerica97(12):6640-6645.公众可从清华大学获得)为模 板，用pfu酶进行PCR反应扩增卡那霉素抗性基因和FRT位点，并在两段设计引入mreB 同源臂。

引物为：

mreB-kmTF:

5’ATGTTGAAAAAATTTCGTGGCATGTTTTCCAATGACTTGTCCATTGACCTGGGTACTATT

同源臂

CCGGGGATCCGTCGACC3’

mreB-KmTR:

5’CGCCGCCGTGCATGTCGATCATTTCCAGCGCTTTGCCGCCACCGCGCGCCACACAGG

同源臂

TGTAGGCTGGAGCTGCTTCG3’

PCR反应条件：

先95℃预变性5分钟；再95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分30秒， 30次循环；然后72℃后延伸10分钟。

PCR扩增目的片断(50μL体系)

PCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。

得到1417bp的PCR产物，为含有mreB上游同源臂、Km、FRT、mreB下游同源臂 的DNA片段，其核苷酸序列为序列表中序列1，其中，mreB上游同源臂为序列1自5’ 末端第1-57位核苷酸，Km为序列1自5’末端第487-1281位核苷酸，FRT为序列1 自5’末端第86-119和1308-1341位核苷酸，mreB下游同源臂为序列1自5’末端第 1361-1417位核苷酸。

将带有重组酶的质粒pKD46recA(Datsenko,K.&Wanner,B.One-step inactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts. ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica 97,6640-6645(2000).公众可从清华大学获得)转化到出发菌Escherichiacoli JM109SG(Li,Z.-J.etal.Productionof poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)fromunrelatedcarbonsources bymetabolicallyengineeredEscherichiacoli.Metabolicengineering12, 352-359(2010).公众可从清华大学获得)中，得到转化子。

取500μl转化子菌液接种到20ml新鲜LB培养基中，30℃培养至OD₆₀₀0.6-0.8时 加入终浓度为0.2％的阿拉伯糖诱导，诱导后2h，放冰上预冷30分钟，收集3ml菌体， 5000rpm离心2分钟，预冷的去离子水洗两次，预冷的10％甘油洗一次，保留100ul 甘油，加入10ul含有mreB上游同源臂、Km、mreB下游同源臂FRT的DNA片段，混匀 后转移到预冷的电击杯中，电击1.8KV，5ms。加入1ml无抗MMG培养基，37℃培养90 分钟，涂MMG卡纳抗性平板，得到转化子。

将转化子进行菌落PCR鉴定，以mreBTF和KmTR为引物，用Taqmix进行PCR反 应，得到700bp左右的条带的为阳性克隆。

引物为：

mreBTF:5’CATTAAGCCTTTCTGGACTC3’

KmTR:5’TGACGGCGGTATCCATAT3’

将PCP20质粒(Datsenko,K.&Wanner,B.One-stepinactivationof chromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.Proceedingsof theNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica97,6640-6645 (2000).公众可从清华大学获得.)转入阳性克隆中，通过FRT重组去除基因组上的抗 性基因，得到重组菌。

对重组菌基因组上mreB位置进行测序，结果为基因组上删除930bpmreB基因的 为阳性重组菌，即为mreB基因敲除的菌株，命名为EscherichiacoliJM109SG△mreB， 为将序列表中序列1通过同源重组的方式替换JM109SG基因组上mreB基因，实现敲除 mreB基因得到的重组菌。

将EscherichiacoliJM109SG△mreB扫描电镜观察，结果为mreB基因敲除的大 肠杆菌从杆状变成球状，结果如图1所示。

研究发现，在野生型大肠杆菌中过表达mreB，由于原本的细胞骨架的存在，只能 在一定程度内使细胞体积变大；基因组上敲除mreB，大肠杆菌从杆状变成圆形，但生 长状态不好。在质粒上补偿表达mreB基因，可以改善生长状态，而且由于原本的细胞 骨架被破坏，在质粒上补偿表达的MreB蛋白形成的细胞骨架相比野生的要弱，PHB等 微生物内容物的积累容易使细胞骨架发生形变，从而降低PHB颗粒之间的空间位阻， PHB颗粒增大增多。在发酵过程中，本发明确实观察到了mreB补偿表达的重组菌可由 于PHB积累而撑起变成圆球形，具体实验如下。

2、表达载体ptk01、ptr01和pSEVA341-LacI^q-Ptrc-MinCD的构建

1)、表达载体ptk01的制备

(1)目的基因mreB的获得

提取大肠杆菌K-12系JM109SG(EscherichiacoliJM109SG)的基因组为模板， 以G-mreB-1TF和G-mreB-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。

引物为：

G-mreB-1TF：5’tcctattccgaagttcctatcttcccctgcctgcatccg3’

G-mreB-2TR：5’gtcaattcagggtggtgaatCTCACAGCCACTTGATACTAACGTG3’

得到1443bp的PCR产物，为目的基因mreB和驱动其表达的启动子PmreB，目的 基因mreB的核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第21-1064位，启动子PmreB的 核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第1065-1423位核苷酸。

(2)目的基因sulA的扩增

以EscherichiacoliJM109SG基因组为模板，以G-sulA-1TF和G-sulA-1TR 为引物，用pfu酶进行PCR扩增目的基因sulA。

G-sulA-1TF：5’ctctaaggaggttataaaaaatgTACACTTCAGGCTATGCACATC3’

G-sulA-1TR：5’ttcaaaagcgctctgaagttGCGGAAACCGCTTCAGACAAG3’

得到610bp的PCR产物，为目的基因sulA基因，其核苷酸序列为序列表中序列2 自5’末端第5018-5527位。

(3)pSC101复制子和ParaBAD的扩增

以G-ptkori-2TF和G-ptkori-1TR为引物，用ptkRED为模板，用Q5超薄真 2XMasterMix扩增质粒复制子。

G-ptkori-2TF：5’TAGTATCAAGTGGCTGTGAGattcaccaccctgaattgactctc3’

G-ptkori-1TR：5’GCATAGCCTGAAGTGTAcattttttataacctccttagagctcgaattcc3’

得到3594bp的PCR产物，其核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第1424-5017 位，pSC101复制子核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第1609-3303位和ParaBAD 核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第3785-5017位。

(4)抗性基因Km的扩增

以G-Km-1TF和G-Km-1TR为引物，以pKD13质粒为模板，用pfu酶进行PCR扩 增抗性基因Km。

G-Km-1TF：5’ttgtctgaagcggtttccgcaacttcagagcgcttttgaa3’

G-Km-1TR：5’tcggatgcaggcaggggaagATAGGAACTTCGGAATAGGA3’

得到1205bp的PCR产物，抗性基因Km为序列表中序列2自5’末端第6001-6795 位。

将上述(1)、(2)、(3)、(4)的DNA片段通过Gibsonassembly同源重组方法连 接，得到连接产物，转化到大肠杆菌Trans1-T1中，得到转化子。

提取转化子的质粒，送去测序，结果为获得含有上述4个片段，该质粒记作ptk01 (又称为ptk-mreB-ara-sulA)，其核苷酸序列为序列表中的序列2，质粒的结构示意 图见图2的左图。

2)、表达载体pxr01的制备

(1)mreB和启动子PmreB

提取大肠杆菌K-12系JM109SG(EscherichiacoliJM109SG)(本实验室保存) 的基因组，以EscherichiacoliJM109SG基因组为模板，以p15a-mreBF和p15a-mreB R为引物，用pfu酶进行PCR扩增。

p15a-mreBF：5’ttagaactgcgattcttcagctcacagccacttgatactaacgtg3’

p15a-mreBR：5’tattggtgcccttaaacgcccttcccctgcctgcatcc3’

得到1443bp的PCR产物，为目的基因mreB和驱动其表达的启动子PmreB，具有 序列表中序列3自5’末端第2126-3548位核苷酸，目的基因mreB的核苷酸序列为序 列表中序列3自5’末端第2485-3528位，启动子PmreB的核苷酸序列为序列表中序 列3自5’末端第2126-2484位核苷酸。

(2)含有复制子和氯霉素抗性基因的目的片段的获得

以mreB-p15aF和mreB-p15aR为引物，以p15AMBA-aceA质粒为模板，用pfu 酶进行PCR扩增，得到2125bp的含有复制子和氯霉素抗性基因的目的片段，其中，复 制子的核苷酸序列为序列表中序列3自5’末端第1324-1868位，氯霉素抗性基因的 核苷酸序列为序列表中序列3自5’末端第36-695位核苷酸。

引物为：

mreB-p15aF:5’tcggatgcaggcaggggaagggcgtttaagggcaccaataac3’

mreB-p15aR:5’tagtatcaagtggctgtgagctgaagaatcgcagttctaaaagc3’

将上述(1)和(2)的两个片段通过Gibsonassembly同源重组方法连接，得到 连接产物，转化到大肠杆菌Trans1-T1中，得到转化子。

提取转化子的质粒，送去测序，结果为获得含有上述2个片段的质粒，记作pxr01， 其核苷酸序列为序列表中序列3，该质粒的结果示意图见图2的右图。

3)、表达载体pSEVA341-LacI^q-Ptrc-MinCD

(1)minCD基因的扩增

采用在盐单胞菌HalomonasTD8中建立的IPTG诱导的LacI^q-Ptrc启动子，构建过 表达细胞分裂抑制因子minCD的表达载体，具体如下：

以TD8野生型基因组为模板，MinCD-F和MinCD-R为引物进行PCR扩增，得到1752bp 的PCR产物，即为minCD基因，其核苷酸序列为序列表中序列4自5’末端第3189-4914 位核苷酸；

以pSEVA434为模板，trcF和trcR为引物进行PCR扩增，得到1458bp的PCR产 物，即为LacI^q-Ptrc片段，其核苷酸序列为序列表中序列4自5’末端第60-1517 位核苷酸。

以minCD基因和LacI^q-Ptrc片段为模板，用F24和R24为引物进行SOEPCR，得 到PCR产物，经过测序为序列表中序列4，命名为LacI^q-Ptrc-minCD。

用XbaI和SacI酶切LacI^q-Ptrc-minCD，得到的酶切产物与经过同样酶切的 pSEVA341载体(TheStandardEuropeanVectorArchitecture(SEVA):acoherent platformfortheanalysisanddeploymentofcomplexprokaryoticphenotypes. Nucleicacidsresearch41,75(2013).)连接，得到连接产物，然后电转化至E. coliS17-1中，在LBCm^R平板上筛选阳性转化子。

将阳性转化子进行菌落PCR鉴定，引物R24，F24进行菌落PCR验证，得到3301bp 的为阳性克隆。将阳性克隆提取质粒送去测序，该质粒为将序列表中序列4所示的核 苷酸LacI^q-Ptrc-MinCD插入pSEVA341载体的XbaI和SacI酶切位点间得到的载体， 命名为pSEVA341-LacI^q-Ptrc-MinCD。

表1为克隆minCD的扩增引物序列

下划线表示SOEPCR的互补重叠区，也是26bp的SD序列。加粗表示酶切位点。

3、工程菌EscherichiacoliJM109SG△mreB(ptk01，pBHR68)、E.coli JM109SG(pxr01，pBHR68)和TD08(pSEVA341-LacI^q-Ptrc-MinCD)的构建

pBHR68载体记载在如下文献中：SpiekermannP，RehmBHA，KalscheuerR， BaumeisterD，SteinbüchelA(1999)Asensitive，viable-colonystainingmethod usingNileredfordirectscreeningofbacteriathataccumulate polyhydroxyalkanoicacidsandotherstoragecom-pounds.ArchMicrobiol171： 73-80，公众可从清华大学获得，该质粒中含有来源于罗氏真养杆菌 Ralstoniaeutropha的PHB合成基因phaC2基因、β-酮基硫解酶PhaA和NADPH依赖 的乙酰乙酰辅酶A还原酶phaB。

将上述2制备的表达载体ptk01和pBHR68用电击转化法同时转入到上述1获得的 mreB敲除的重组菌EscherichiacoliJM109SG△mreB中，获得重组菌A，为敲除mreB 且质粒过表达mreB和sulA基因；

将上述2获得的表达载体ptk01和pBHR68用电击转化法同时转入到Escherichia coliJM109SG中，得到对照菌E.coliJM109SG(ptk01，pBHR68)，质粒过表达mreB和 sulA基因；

将上述2获得的表达载体pxr01和pBHR68用电击转化法同时转入到E. coliJM109SG中，获得重组菌B，质粒过表达mreB基因。

将步骤二获得的pSEVA341-LacI^q-Ptrc-MinCD接合转化入盐单胞菌TD08(Fu,X.-Z. etal.DevelopmentofHalomonasTD01asahostforopenproductionofchemicals. Metabolicengineering23,78-91(2014).公众可从清华大学获得)，得到重组菌株 TD08(pSEVA341-LacI^q-Ptrc-MinCD)。

将pSEVA341接合转化入盐单胞菌TD08，得到对照菌株TD08(pSEVA341)。

分别将重组菌A、B涂布于LB-Amp，Km的固体培养平板上，重组菌A在30℃培养 12小时，重组菌B在37℃培养12小时；分别挑取在LB-Amp，Km固体培养平板上长 出的单克隆，将其接种到LB-Amp，Km液体培养基中，重组菌A在30℃、200rpm下摇 床培养12小时，重组菌B在37℃、200rpm下摇床培养12小时。

重组菌A提取质粒用BglII单酶切，得到6.8kb和8.1kb的片段，证明ptk01和 pBHR68已经被成功转入到mreB敲除的重组菌EscherichiacoliJM109SG△mreB中， 命名为：EscherichiacoliJM109SG△mreB(ptk01，pBHR68)(图1)，其为敲除 EscherichiacoliJM109SG基因组的mreB基因，且通过质粒ptk01将mreB基因和sulA 基因与质粒pBHR68共同导入E.coliJM109SG中得到的重组菌；

重组菌B提取质粒用NdeI单酶切，得到3.5kb、8.1kb的片段，证明pxr01和pBHR68 已经被成功转入到E.coliJM109SG中，命名为EscherichiacoliJM109SG(pxr01， pBHR68)，其为将mreB基因通过质粒pxr01与质粒pBHR68共同导入E.coliJM109SG 中得到的重组菌。

将pBHR68转入E.coliJM109SG得到EscherichiacoliJM109SG(pBHR68)，提取 质粒并用BglII酶切验证，得到8.1kb的片段，证明为阳性。

二、工程菌EscherichiacoliJM109SG△mreB(ptk01，pBHR68)、E.coli JM109SG(pxr01，pBHR68)和TD08(pSEVA341-LacI^q-Ptrc-MinCD)提高内含物产量

A、工程菌EscherichiacoliJM109SG△mreB(ptk01，pBHR68)、E.coli JM109SG(pxr01，pBHR68)提高内含物产量

1、LB培养基条件下摇瓶培养PHB产量检测

1)PHB产量检测

表达工程菌E.coliJM109SG(pBHR68)、E.coliJM109SG(ptk01，pBHR68)、E. coliJM109SG△mreB(ptk01，pBHR68)分别用LB培养基，在30℃，200rpm过夜培养； 然后按5％接种量(v/v)，分别接种至50mL的含葡萄糖的LB培养基(含：5g/L酵母 提取物，10g/L蛋白胨，10g/LNaCl，20g/L葡萄糖，其余为水，pH7.0-7.2)，30℃， 200rpm，摇瓶培养48小时，得到菌液，经离心、水洗、冰干后得到干细胞待测样品， 每个菌种设置三组平行。运用气相色谱仪(GC，Hewlett-Packardmodel6890)验证细 胞中均聚物的积累。运用液相色谱仪(HPLC，SpectroSYSTEM，ThermoSeparation Products，USA)检测葡萄糖的消耗。

液相检测色谱柱为Bio-rad公司有机酸柱，AninexHPX-87XIonExclusion Column(300×7.8mm)。流动相为5mMH₂SO₄，流速为0.5ml/min。进样量为10μl。检 测器使用美国SPECTRASYSTEM公司的RI-150示差检测器。

样品检测：取1.5ml菌液，10000rpm离心后取上清液，用0.45mm滤膜过滤后作 为色谱的样品。

标准曲线测定：葡萄糖水溶液。将葡萄糖的标准样品稀释不同倍数，以0.5ml/min 的流速，通过HPLC检测，并绘制标准曲线。

葡萄糖标样的出峰时间为第11.051min。

结果为各组葡萄糖几乎全部用完，根据标样定量检测出各组培养基中葡萄糖的浓 度，用于监测培养基中碳源的变化从而适当的补加碳源。

气相检测3-羟基丁酸均聚物的方法：

设定炉温为80℃，进样器温度为200℃，检测器温度为220℃，柱头压力为0.25Mpa， 程序升温条件为：80℃停留1.5分钟，以30℃/min的速度升温至140℃，接着以40℃ /min的速度升温至220℃并在此温度保持0.5分钟。样品的进样量为1μl，使用安 捷伦公司生产的微量进样器。

气相样品准备：取40-60mg待测样品的干细胞(菌液10000rpm，10分钟条件下离 心，所得细胞沉淀水洗一次之后，冰干，得到干细胞，均聚物产于细胞中)，加2ml氯 仿，2ml酯化液(纯甲醇中含3％(v/v)的浓硫酸及2g/L苯甲酸作内标)于酯化管中， 加盖密封后于100下加热4小时。冷却后加入1ml蒸馏水，充分振荡后静置，待氯 仿相与水相完全分层后，取下层氯仿相1μl注入气相色谱仪(HP公司HewlettPackard 6890)中进行色谱分析。依照HP公司HewlettPackard6890气相色谱仪的说明书操 作气相色谱仪。

标准样品准备：取10-20mg的3－羟基丁酸3HB(sigma-aldrich，产品货号： 363502-10G)水溶液于酯化管中，加2ml氯仿，2ml酯化液，加盖密封后在100℃进 行酯化。在本实施例中的气相检测条件下，标准样品在第2.2分钟有明显出峰，表征 酯化样品中的3-羟基丁酸。

以标准样品为对照，如果待测细胞的酯化样品(待测样品)在2.2分钟也有明显 的出峰，且无其它特异峰出现，说明待测细胞的酯化样品有且仅有3HB单体。因为在 干细胞中3HB只能以聚合物的形式存在，这样的结果即证明了均聚物的产生。

结果为E.coliJM109SG△mreB(ptk01，pBHR68)、E.coliJM109SG(ptk01， pBHR68)、E.coliJM109SG(pBHR68)的干细胞在2.2分钟也有明显的出峰，并且没有 其它特异出峰，说明能够生产均聚物。

通过分析气相检测到的出峰面积和样品量，可得到干细胞中含有均聚物的比重 (wt％)，及每L培养体系中能够生产的均聚物或共聚物的浓度(g/L)，具体结果见表1 所示。

在LB培养基中培养E.coliJM109SG(pBHR68)、E.coliJM109SG(ptk01，pBHR68)、 E.coliJM109SG△mreB(ptk01，pBHR68)菌株，4h后E.coliJM109SG(ptk01，pBHR68) 和E.coliJM109SG△mreB(ptk01，pBHR68)中加入0.2％的阿拉伯糖诱导表达sulA基因， 细胞开始变长，10h后加入终浓度为20g/L的Glucose，48h后将菌液离心、水洗、冰 干后得到干细胞待测样品，按照上述“气相样品准备”得到待测样品，以标准样品的 气相检测结果为参照，分析这些菌株中均聚物的积累量。

结果发现敲除基因组上mreB后又在质粒上补偿表达mreB的菌株E.coliJM109SG △mreB(ptk01，pBHR68)的细胞干重CDW和3HB产量都比对照菌E.coli JM109SG(pBHR68)和E.coliJM109SG(ptk01，pBHR68)有明显提高，得到8g/L3- 羟基丁酸(3HB)，结果见表2。

在含有20g/L葡萄糖的LB培养基中培养E.coliJM109SG(pBHR68)、E.coli JM109SG(pxr01，pBHR68)菌株，48h后将菌液离心、水洗、冰干后得到干细胞待测样 品，按照上述“气相样品准备”得到待测样品，以标准样品的气相检测结果为参照， 分析这些菌株中均聚物的积累量。

结果发现E.coliJM109SG(pxr01，pBHR68)的3HB百分含量比对照菌E.coli JM109SG(pBHR68)有明显提高，得到7g/L3-羟基丁酸(3HB)，结果也如表2所示。

表2为LB培养基条件下摇瓶培养的检测结果

由表2的测定结果可以看出，大肠杆菌E.coliJM109SG(pxr01，pBHR68)单纯过 表达mreB基因，细胞3HB百分含量比对照菌E.coliJM109SG(pBHR68)有明显提高； 而在基因组上敲除mreB又在质粒上补偿表达mreB基因的E.coliJM109SG△mreB (ptk01，pBHR68)的细胞干重和PHB百分含量都有更显著的提高。

2、重组菌积累PHB后的形态检测

电镜样品准备：E.coliJM109SG(pBHR68)、E.coliJM109SG(ptk01，pBHR68)、 E.coliJM109SG△mreB(ptk01，pBHR68)发酵48小时后收集100ul菌体，5000rpm， 离心2分钟，用戊二醛固定2小时；PBS洗两次，每次10分钟；梯度乙醇脱水：50％、 70％、80％、90％每个梯度3-5分钟，100％乙醇脱水3次，每次3-5分钟；叔丁醇：乙醇 ＝1：1处理10分钟；纯叔丁醇处理10分钟；最后用叔丁醇覆盖菌体，放-20℃冷冻20 分钟以上，然后冷冻干燥成粉末状。得到冰干的菌体。

将上述菌体用牙签沾取合适的量粘在导电胶上，表面喷金60秒，进行扫描电镜观 察。

同一放大倍数的结果如图4所示，WT：E.coliJM109SG(pBHR68)； JM109SG+mreB+sulA：E.coliJM109SG(ptk01，pBHR68)；JM109SG△mreB+mreB+sulA： E.coliJM109SG△mreB(ptk01，pBHR68)，可以看出，与WT比，重组菌E.coliJM109SG △mreB(ptk01，pBHR68)积累聚3-羟基丁酸PHB后体积明显变大，有些细菌由于积 累PHB，形态从杆状被撑成圆形。

3、透射电镜观察重组菌中PHB的积累方式

E.coliJM109SG(pBHR68)、E.coliJM109SG(ptk01，pBHR68)、E.coliJM109SG △mreB(ptk01，pBHR68)发酵48小时后收集500微升菌体，5000rpm，离心2min， 用戊二醛固定，然后用树脂包埋，做超薄切片，进行透射电镜观察。

结果如图5所示，WT：E.coliJM109SG(pBHR68)；JM109SG△mreB+mreB+sulA： E.coliJM109SG△mreB(ptk01，pBHR68)，可以看出，与WT比，重组菌E.coliJM109SG △mreB(ptk01，pBHR68)中被3-羟基丁酸PHB撑成圆形的大肠杆菌中充满3-羟基丁 酸PHB颗粒，并且平均体积比对照菌大。

4、MM培养基条件下摇瓶培养PHB产量检测

1)PHB产量

表达工程菌E.coliJM109SG(pBHR68)、E.coliJM109SG(ptk01，pBHR68)、E.coli JM109SG△mreB(ptk01，pBHR68)分别用LB培养基，在30℃，200rpm过夜培养；然后 按5％接种量(v/v)，分别接种至50mL的含葡萄糖的MM培养基(含：2g/L酵母提取 物，1ml组分I，1ml组分II，20g/L葡萄糖，其余为水)，30℃，200rpm，5小时后 E.coliJM109SG(ptk01，pBHR68)和E.coliJM109SG△mreB(ptk01，pBHR68)中加入0.2％ 的阿拉伯糖诱导表达sulA基因，细胞开始变长，10小时后加入终浓度为20g/L的 Glucose，48小时后将菌液离心、水洗、冰干后得到干细胞待测样品，并通过气相色 谱检测(条件和方法同1)，结果如表3所示。每个菌种设置三组平行。

可以看出，通过增大细菌体积来提高内含物PHB产量。

表3为MM培养基条件下摇瓶培养的检测结果

2)、细胞数目和沉降速度检测

将发酵48h后的E.coliJM109SG△mreB(ptk01，pBHR68)涂LB平板过夜培养 检测细胞数目和静置30分钟观察沉降速率。以E.coliJM109SG(pBHR68)为对照。

检测细胞数目结果如图3左图所示，E.coliJM109SG△mreB(ptk01，pBHR68) 仅是E.coliJM109SG(pBHR68)的1/3，为7X10⁷个/ml。

观察沉降速率结果如图3右图所示，E.coliJM109SG△mreB(ptk01，pBHR68) 沉降速率比对照菌E.coliJM109SG(pBHR68)大。

从上述结果可以看出，E.coliJM109SG△mreB(ptk01，pBHR68)细胞个数较少， 但细胞干重和PHB含量均有明显提高，说明每个细胞的PHB的积累增加；且其可以维 持诱导后的长度，沉降速率比对照菌E.coliJM109SG(pBHR68)大，这就为下游的分离 提取提供便利。

由表3的结果可以看出，MM培养条件下，基因组上敲除mreB又在质粒上补偿表 达mreB基因的E.coliJM109SG△mreB(ptk01，pBHR68)的细胞干重和PHB百分含 量都有显著的提高，而且细胞数目仅是对照菌的1/3；而且在基因组上敲除mreB又在 质粒上补偿表达mreB基因同时诱导表达sulA基因的E.coliJM109SG△mreB(ptk01， pBHR68)可以维持长度，所以沉降速率比对照菌E.coliJM109SG(pBHR68)大，这就 为下游的分离提取提供便利。理论上，180g葡萄糖能转化成86g3-羟基丁酸，理论 上的碳源转化率为86/180X100％＝48％。由表3可知E.coliJM109SG△mreB(ptk01， pBHR68)的碳源转化率为8.11/20X100％＝40.5％。

5、E.coliJM109SG△mreB(ptk01，pBHR68)生产聚磷酸、碳小体(Carboxysome) 等内含物

聚磷酸(Polyphosphate，Polyp)是一种线性的聚合分子，由多个磷酸基团通过高 能磷酸键连接而成，普遍存在于生物体内，聚磷酸能够达到细胞干重的15％。聚磷酸 的合成酶有聚磷酸激酶(PolyphosphateKinase，PPK)；外切聚磷酸酶 (Exopolyphosphase，PPX)、内切聚磷酸酶(Endopolyphosphase，PPN)。

在生物污泥中利用过表达聚磷酸激酶工程菌富集大量聚磷酸，有利于污水处理和 磷酸环境修复，从而避免了利用金属离子处理带来的负面污染，在重组菌A中过表达 聚磷酸激酶基因，聚磷酸的积累量占细胞干重的百分比可由原来的15％提高到40％。

根据文献报道，carboxysome是存在于一些自养细菌细胞内的多角形或六角形内 含体,该结构是自养细菌所特有的内膜结构,大小约100nm。carboxysome由以蛋白质为 主的单层膜包围，内含固定二氧化碳所需的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶和5-磷酸核酮糖 激酶，是自养型细菌固定二氧化碳的部位。因而，carboxysome可以固定二氧化碳， 提高碳源的利用率。

在PHB的生产中，大量的碳源在大肠杆菌中转化为其他代谢产物，并没有转化为 PHB，碳源的利用率很低是导致PHB生产成本较高的原因之一。为了扩大PHB的生产， 提高碳源的转化率具有重大的意义。

在生产PHB的大肠杆菌中构建carboxysome，从而将二氧化碳在细菌体内进行固 定，再次利用。大肠杆菌本身是不能合成carboxysome的，其并不能固定二氧化碳， 通过调研，合成carboxysome相关的基因共有10个(cbbL、cbbS、csoS2、csoS3、csoS4A、 csoS4B、csoS1C、csoS1A、csoS1B、csoS1D)，而将这10个基因构建在质粒上，转入 大肠杆菌内形成碳小体。

将含有这10个基因的质粒转化到E.coliJM109SG△mreB(ptk01，pBHR68)和 对照菌E.coliJM109SG(pBHR68)，分别得到含有合成carboxysome相关的基因的E. coliJM109SG△mreB(ptk01，pBHR68)和含有合成carboxysome相关的基因的E.coli JM109SG(pBHR68)，在含有20g/L的LB培养基中发酵48h后，检测PHB的积累量， 方法同上。

结果如下：

含有合成carboxysome相关的基因的E.coliJM109SG△mreB(ptk01，pBHR68) 的碳源转化率为45％；

含有合成carboxysome相关的基因的E.coliJM109SG(pBHR68)的碳源转化率 为25％。

因此，E.coliJM109SG△mreB(ptk01，pBHR68)的碳小体的积累量有较明显提 高，因为碳小体增多可以提高碳源转化率。

B、工程菌盐单胞菌TD08(pSEVA341-LacI^q-Ptrc-MinCD)在生成内含物中的应用

1、TD08(pSEVA341-LacI^q-Ptrc-MinCD)在生成内含物PHB中的应用

表达工程菌盐单胞菌TD08(pSEVA341-LacI^q-Ptrc-MinCD)和TD08(pSEVA341)分别 用60MMG(60g/LNaCl)在37℃培养48h，发酵过程中加入诱导剂，48小时后将菌液离 心、水洗、冰干后得到干细胞待测样品，并通过气相色谱检测(条件和方法同上)，结 果如表4所示。每个菌种设置三组平行。

表4过表达minCD的重组菌生产PHB的摇瓶实验结果

由上表可知，加入IPTG诱导，过表达minCD的重组TD08菌株的细胞干重和只含 有空载体的TD08菌株没有明显差别，表明相比于生长早期加入诱导剂，稳定期后加入 并不会影响细胞的正常生长；同时，过表达MinCD的重组菌株的PHB含量明显高于只 含有空载体的普通TD08菌株，基本维持在80wt％左右，而只含有空载体的普通TD08 只有69wt％。加入诱导剂组PHB含量为82wt％，与空载体有显著性差异(Pvalue<0.05)。 没加入诱导剂组的TD08(pSEVA341-MinCD)由于存在本地表达，即使不诱导产量也得到 提高。

诱导表达minCD的实验组的菌体体积明显增大，PHB积累量增加，结果如图6所 示。

2、TD08(pSEVA341-LacI^q-Ptrc-MinCD)在生成内含物PhaR蛋白中的应用

表面按活性剂被誉为工业味精，具有固定的亲水端和疏水端，在溶液的表面能定 向排列并显著减低溶液的表面张力。表面活性剂具有增粘性增泡性抗硬水性消毒杀菌 助悬润湿曾柔以及去垢洗涤等作用，是一类被广泛使用的化工用品。表面按活性剂被 誉为工业味精，具有固定的亲水端和疏水端，在溶液的表面能定向排列并显著减低溶 液的表面张力。表面活性剂具有增粘性增泡性抗硬水性消毒杀菌助悬润湿曾柔以及去 垢洗涤等作用，是一类被广泛使用的化工用品。

phaR可溶性蛋白具有较强的乳化作用，phaR包涵体、含有phaR的细胞裂解液也 具有较强的乳化作用。phaR能够在95℃下保持较好的乳化功能，且结构稳定性良好。

将TD08(pSEVA341-LacI^q-Ptrc-MinCD)和对照菌TD08(pSEVA341)在矿物培养基 MM中发酵48小时，收集发酵产物。

将发酵产物菌体离心收集，并超声破碎，phaR是一种可溶性蛋白，离心后分别 取上清进行乳化实验，TD08(pSEVA341-LacI^q-Ptrc-MinCD)实验组的乳化性能比 TD08(pSEVA341)有明显提高。另一方面，同时用His-Tag标记并纯化phaR蛋白后，用 蛋白定量试剂盒测所得phaR蛋白的量。

可以看出，TD08(pSEVA341-LacI^q-Ptrc-MinCD)生产PhaR蛋白占细胞干重，其比 例从50％提高到80％。

实施例2、增大枯草芽孢杆菌的体积提高PHB内含物的含量

一、重组菌枯草芽孢杆菌168△SigD△lytE△lytD(pBHR68)的构建

1、168△SigD的构建

以枯草芽孢杆菌168(AnagnostopoulosandJ.Spizizen.1961.Requirementfor transformationinBacillussubtilis.J.Bacteriol.81:741-746，公众可从清华 大学获得)为模板，分别用如下引物对进行PCR扩增：

SigD-up-F:gcatgcctgcaggtcgactagctgaaagcgcatatgttta

SigD-up-R:AGCAGATTCTTTAATTTTCCCCCTAATACCTTAATTA

SigD-down-F:ggtattagggggaaaattaaagaatctgctggaaaaag

SigD-down-R:CGAATTCGAGCTCGGTACCCAACACAGCTTTATCCGACA

分别得到594bp的SigD上游同源臂(序列15自5’末端第20bp-613bp位核苷 酸)、588bp的SigD下游同源臂(序列15自5’末端第614bp-1201bp位核苷酸)、另 外使用限制性内切酶xbaI和smaI对质粒载体pCU进行双酶切，将环形质粒pCU变为 4.2kb的线性片段pCU(xbaIsmaI)。

将这三个PCR片段通过试剂盒Gibsonmastermix(NEB)重组连接，得到质粒 pCU-SigD，经过测序，该质粒的核苷酸序列为序列表中序列序列15，其为将含有SigD 上下游同源臂的DNA片段(序列15自5’末端第20bp-1201bp)插入pCU载体的xbaI 和smaI位点得到的质粒。

将质粒pCU-SigD转入枯草芽孢杆菌168中，该质粒与168基因组进行同源重组， 得到重组菌，经过测序，该重组菌缺失SigD基因，命名为168△SigD。

2、168△SigD△lytE△的构建

以枯草芽孢杆菌168为模板，分别用如下引物对进行PCR扩增：

lytE-up-F:gcatgcctgcaggtcgactgtggttaatttcagacgtggc

lytE-up-R:AATTTTATTGCAATAATTTTCCTCCCCAAATGTTAACTC

Spe-F:tattgcaataaaattagcctaattg

Spe-R:GAACATAATCAACGAGGTGAAA

lytE-down-F:tcacctcgttgattatgttctttttagagaaaacccgttc

lytE-down-R:CGAATTCGAGCTCGGTACCCATGGCTTCACACCTTTGTGAC

分别得到1006bp的lytE上游同源臂(为序列16自5’末端第20bp-1025bp 位核苷酸)、915bp的lytE下游同源臂(为序列16自5’末端第1851bp-2765bp 位核苷酸)、825bp的抗性基因Spe(为序列16自5’末端第1026bp-1850bp位核 苷酸)。

将这三个PCR片段和酶切后的载体片段pCU(xbaIsmaI)通过试剂盒Gibson mastermix(NEB提供)重组连接，得到质粒pCU-lytE-spe，经过测序，该质粒的核 苷酸序列为序列表中序列序列16，其为将含有lytE上游同源臂、抗性基因Spe和lytE 下游同源臂的DNA片段(序列16自5’末端第20bp-2765bp)插入pCU载体的xbaI 和smaI位点得到的质粒。将质粒pCU-lytE-spe转入168△SigD中，该质粒与168△ SigD基因组进行同源重组，得到重组菌，经过测序，该重组菌缺失SigD和lytE基因， 命名为168△SigD△lytE。

3、168△SigD△lytE△lytD的构建

以枯草芽孢杆菌168为模板，分别用如下引物对进行PCR扩增：

lytD-up-F:gcatgcctgcaggtcgactaacatggaggtcatggtacaaat

lytD-up-R:AGGTTTTATAGTTTTGGTCGAAAACTTAGAAAGTTGCAAAT

Em-F:cgaccaaaactataaaaccttt

Em-R:AAATAGGCACACGAAAAACAAG

lytD-down-F:tgtttttcgtgtgcctattttccttctcctctttcttattc

lytD-down-R:ACGAATTCGAGCTCGGTACCCTGTCATAGGAAAAAGGCAGCTT

分别得到1165bp的lytD上游同源臂(为序列17自5’末端第20bp-1184bp位 核苷酸)、1172bp的lytD下游同源臂(为序列17自5’末端第2265bp-3436bp位核 苷酸)、1080bp的抗性基因Em(为序列17自5’末端第1185bp-2264bp位核苷酸)。

将这三个PCR片段和酶切后的载体片段pCU(xbaIsmaI)通过试剂盒Gibson mastermix(NEB)重组连接，得到质粒pCU-lytD-Em，经过测序，该质粒的核苷酸序 列为序列表中序列序列17，其为将含有lytD上游同源臂、抗性基因Em和lytD下游 同源臂的DNA片段(序列17自5’末端第20bp-3436bp)插入pCU载体的xbaI和 smaI位点得到的质粒。将质粒pCU-lytD-Em转入168△SigD△lytE中，该质粒与168 △SigD△lytE基因组进行同源重组，得到重组菌，经过测序，该重组菌缺失SigD、lytD 和lytE基因，命名为168△SigD△lytE△lytD，为将含有SigD上下游同源臂的DNA 片段、含有lytE上游同源臂、抗性基因Spe和lytE下游同源臂的DNA片段和含有lytD 上游同源臂、抗性基因Em和lytD下游同源臂的DNA片段导入168中，通过同源重组 替换其基因组上的SigD、lytE和lytD基因得到的重组菌。

4、重组菌168△SigD△lytE△lytD(pBHR68)的制备

将质粒pBHR68导入重组菌168△SigD△lytE△lytD中，得到重组菌168△SigD△ lytE△lytD(pBHR68)。

将质粒pBHR68导入168中，得到对照菌168(pBHR68)。

二、重组菌168△SigD△lytE△lytD(pBHR68)提高内含物PHB中的应用

将上述一制备得到的重组菌168△SigD△lytE△lytD(pBHR68)按照实施例1的A 中的1的1)的方法检测PHB产量检测。以对照菌168(pBHR68)为对照。

重组菌168△SigD△lytE△lytD(pBHR68)的PHB(wt％)为40％、PHBg/L为3g/L；

对照菌168(pBHR68)的PHB(wt％)为50％、PHBg/L为4g/L。

电镜观察重组菌积累PHB后的形态，方法与实施例1的2基本一致，结果如图7， 可以看出，与168(pBHR68)(野生形)相比，重组菌168△SigD△lytE△lytD(pBHR68) (敲除株)的平均体积增大，结果如图7所示。

实施例3、敲除细胞壁合成相关基因的变形大肠杆菌PHB的生产

菌的一些高分子量的青霉素结合蛋白(PBPs)的生物学功能已经有所阐述，但是 低分子量的PBPs的生理功能还不清楚。一些PBPs存在突变的大肠杆菌的形态观察发 现，PBP5敲除的大肠杆菌的直径，轮廓，拓扑学结构发生改变。当抑制PBP3或者FtsZ 的活性时，菌体就会变长。PBP5是一种可以去除肽聚糖五肽侧链的末端D-丙氨酸残基 的酶，PBP5的突变并不是致死的，这可能是由于还有其他的一个或更多低分子量的 PBPs可以填补PBP5的空缺。

青霉素结合蛋白(PBPs)是在肽聚糖合成过程中的一系列关键蛋白，目前发现的有 12种，包括：PBPs1a,1b,1c,2,3,4,5,6,7,8,DacD,AmpC和AmpH。其中有 7种小分子的PBPs(PBPs4,5,6,7,8,DacD,AmpC和AmpH)是研究较多且非必需。

通过调研发现一些在细胞壁合成过程中的相关基因，主要是肽聚糖合成过程中的 基因，其中多数基因都是必需基因，选定了其中一个非必需基因ddlB，其表达的是D- 丙氨酸-D-丙氨酸连接酶，在肽聚糖的合成过程中合成肽聚糖的D-丙氨酸侧链，可以 将两分子的D-丙氨酸合成D-丙氨酸-D-丙氨酸，加在正在合成的细胞壁前体中。敲除 该基因可能会影响细胞形态。

一、敲除出发菌dacA、mrcB、ddlB、ampC、ampH基因构建重组菌

1、敲除出发菌dacA、mrcB、ddlB、ampC、ampH基因

1)、敲除出发菌dacA基因构建EscherichiacoliJM109SG△dacA

方法与实施例1的一的1基本相同，不同如下：

用于同源重组的DNA片段为1381bp含有dacA上游同源臂、Km、FRT、dacA下游同 源臂的DNA片段，扩增其的引物如下：

Pkd13-dacAF:ATGAATACCATTTTTTCCGCTCGTATCATGAAGCGCCTGGATTCCGGGGATCCGTCGACC

上游同源臂(序列5)

Pkd13-dacAR:TTAACCAAACCAGTGATGGAACATTAATTTAATGTAATCATGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

下游同源臂(序列6)

含有dacA上游同源臂、Km、FRT、dacA下游同源臂的DNA片段的核苷酸序列为将 序列表中序列1自5’末端第1-57位核苷酸替换为序列5，且将序列1自5’末端第 1361-1417位核苷酸替换为序列6得到的序列。

出发菌为EscherichiacoliJM109SG。

得到EscherichiacoliJM109SG△dacA，经过测序证明，其为Escherichiacoli JM109SG中dacA基因敲除的菌株。

2)、敲除出发菌EscherichiacoliJM109SG△dacA中的ddlB基因构建Escherichia coliJM109SG△dacA△ddlB

方法与实施例1的一的1基本相同，不同如下：

用于同源重组的DNA片段为1381bp含有ddlB上游同源臂、Km、FRT、ddlB下游同 源臂的DNA片段，扩增其的引物如下：

Pkd13-ddlBF:ATGACTGATAAAATCGCGGTCCTGTTGGGTGGGACCTCCATTCCGGGGATCCGTCGACC

上游同源臂(序列9)

Pkd13-ddlBR:TTAGTCCGCCAGTTCCAGAATTCGTACTACCAACTGCGATGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

下游同源臂(序列10)

含有ddlB上游同源臂、Km、FRT、ddlB下游同源臂的DNA片段的核苷酸序列为将 序列表中序列1自5’末端第1-57位核苷酸替换为序列9，且将序列1自5’末端第 1361-1417位核苷酸替换为序列10。

出发菌为EscherichiacoliJM109SG△dacA。

得到EscherichiacoliJM109SG△dacA△ddlBB，经过测序证明，其为ddlB基因敲 除的菌株。

3)、敲除出发菌EscherichiacoliJM109SG△dacA△ddlBB中的ampC基因构建 EscherichiacoliJM109SG△dacA△ddlBB△ampC

方法与实施例1的一的1基本相同，不同如下：

用于同源重组的DNA片段为1381bp含有ampC上游同源臂、Km、FRT、ampC下游同 源臂的DNA片段，扩增其的引物如下：

Pkd13-ampCF:ATGTTCAAAACGACGCTCTGCGCCTTATTAATTACCGCCATTCCGGGGATCCGTCGACC

上游同源臂(序列11)

Pkd13-ampCR:GAGCGTTAAGAATCTGCCAGGCGGCGTCGACTCTCGCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

下游同源臂(序列12)

含有ampC上游同源臂、Km、FRT、ampC下游同源臂的DNA片段的核苷酸序列为将 序列表中序列1自5’末端第1-57位核苷酸替换为序列11，且将序列1自5’末端第 1361-1417位核苷酸替换为序列12。

出发菌为EscherichiacoliJM109SG△dacA△ddlB。

得到EscherichiacoliJM109SG△dacA△ddlB△ampC，经过测序证明，其为ampC 基因敲除的菌株。

4)、敲除出发菌EscherichiacoliJM109SG△dacA△ddlB△ampC中的ampH基因构 建EscherichiacoliJM109SG△dacA△ddlB△ampC△ampH

方法与实施例1的一的1基本相同，不同如下：

用于同源重组的DNA片段为1381bp含有ampH上游同源臂、Km、FRT、ampH下游同 源臂的DNA片段，扩增其的引物如下：

Pkd13-ampHF:TTGAAACGTAGTCTGCTTTTTTCTGCCGTGCTGTGTGCGATTCCGGGGATCCGTCGACC

上游同源臂(序列13)

Pkd13-ampHR:GGGATAACCAACGGTTTATTCCCGCTTAGCTCGGTCACCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

下游同源臂(序列14)

含有ampH上游同源臂、Km、FRT、ampH下游同源臂的DNA片段的核苷酸序列为将 序列表中序列1自5’末端第1-57位核苷酸替换为序列13，且将序列1自5’末端第 1361-1417位核苷酸替换为序列14。

出发菌为EscherichiacoliJM109SG△dacA△ddlB△ampC。

得到EscherichiacoliJM109SG△dacA△ddlB△ampC△ampH，经过测序证明，其为 ampH基因敲除的菌株。

5)、敲除EscherichiacoliJM109SG△dacA△ddlB△ampC△ampH中mrcB基因构建 EscherichiacoliJM109SG△dacA△ddlB△ampC△ampH△mrcB

方法与实施例1的一的1基本相同，不同如下：

用于同源重组的DNA片段为1381bp含有mrcB上游同源臂、Km、FRT、mrcB下游同 源臂的DNA片段，扩增其的引物如下：

Pkd13-mrcBF:ATGGCCGGGAATGACCGCGAGCCAATTGGACGCAAAGGGATTCCGGGGATCCGTCGACC

上游同源臂(序列7)

Pkd13-mrcBR：GCTGTCTTTCTGCTCTTGCTGAGCAGGTTGCTGTTGCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

下游同源臂(序列8)

含有mrcB上游同源臂、Km、FRT、mrcB下游同源臂的DNA片段的核苷酸序列为将 序列表中序列1自5’末端第1-57位核苷酸替换为序列7，且将序列1自5’末端第 1361-1417位核苷酸替换为序列8。

出发菌为EscherichiacoliJM109SG△dacA△ddlB△ampC△ampH。

得到EscherichiacoliJM109SG△dacA△ddlB△ampC△ampH△mrcB，经过测序证明， 其为dacA、ddlB、ampC、ampH、mrcB基因敲除的菌株，为将含有dacA上游同源臂、Km、 FRT、dacA下游同源臂的DNA片段、含有ddlB上游同源臂、Km、FRT、ddlB下游同源臂 的DNA片段、含有ampC上游同源臂、Km、FRT、ampC下游同源臂的DNA片段、含有ampH 上游同源臂、Km、FRT、ampH下游同源臂的DNA片段、含有mrcB上游同源臂、Km、FRT、 mrcB下游同源臂的DNA片段均导入EscherichiacoliJM109SG中，通过同源重组替 换基因组中的dacA、ddlB、ampC、ampH、mrcB基因，得到的重组菌。

2、重组菌的构建

将质粒pBHR68导入重组菌EscherichiacoliJM109SG△dacA△ddlB△ampC△ampH △mrcB中，得到重组菌EscherichiacoliJM109SG△dacA△ddlB△ampC△ampH△mrcB (pBHR68)。

二、重组菌EscherichiacoliJM109SG△dacA△ddlB△ampC△ampH△mrcB(pBHR68) 在提高内含物产量中的应用

将上述一制备得到的重组菌EscherichiacoliJM109SG△dacA△ddlB△ampC△ampH △mrcB(pBHR68)按照实施例1的A中的1的1)的方法检测PHB产量检测。以重组菌 EscherichiacoliJM109SG(pBHR68)为对照。

重组菌EscherichiacoliJM109SG△dacA△ddlB△ampC△ampH△mrcB(pBHR68) 的PHB(wt％)为70％、PHBg/L为8g/L；

EscherichiacoliJM109SG(pBHR68)的PHB(wt％)为50％、PHBg/L为6g/L。

重组菌与对照相比，PHB含量可由原来的50％提高到70％。

电镜观察重组菌积累PHB后的形态，方法与实施例1的2基本一致，结果如图8 所示，可以看出，与EscherichiacoliJM109SG(pBHR68)相比，重组菌Escherichia coliJM109SG△dacA△ddlB△ampC△ampH△mrcB(pBHR68)的平均体积增大，有些细 菌由于积累PHB，形态从杆状被撑成圆形。