法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-10-02
授权
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2016-03-02
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20151116
实质审查的生效
2016-02-03
公开
公开
技术领域
本发明属食品安全领域,具体涉及一个猪6号染色体上用于溯源的SNP 分子标记及其应用。
背景技术
随着社会的发展,食品供应链中的环节在不断增加,从农场、牧场到食 品企业的加工、包装、储藏、运输和销售,食品供应的各个环节存在食品的 安全隐患,食品安全问题常有发生。因此需要进行肉制品的可追溯管理,建 立从产地到餐桌的各个环节的追溯体系,从而为消费者提供准确而详细的有 关产品的信息,有利于生产经营者及时发现各环节中存在的不安全隐患。从 20世纪90年代中期的食品安全危机开始,肉产品的追溯已经作为一种安全 控制措施,受到世界多个国家的高度重视。肉产品追溯系统加强了政府部门 对肉产品质量安全的监管能力,因此许多国家纷纷建立肉产品追溯系统用以 降低肉产品质量安全中存在的风险。
肉产品溯源技术有标签溯源技术、同位素溯源技术、矿物元素指纹溯源 技术、有机物溯源技术虹膜特征技术和DNA标记溯源技术(或DNA溯源技 术)等,其中DNA溯源技术因为检测手段简单、快速、难以伪造等特点成 为世界各国广泛应用的快速溯源技术。与其他标记方法相比,DNA标记具有 特有放入优越性:它直接以DNA形式出现,在生物体的各个组织、各发育 时期均可检测到,不受环境因素的影响,并且标记数量多,遍及生物体整个 基因组。
SNP标记是指基因组同一位点上单个核苷酸的变异,一般表现为二等位 基因,适宜高通量自动化分析,所以成为动物身份识别最受关注的分子标记。
但是用于肉产品溯源的SNP标记不同于一般的SNP标记,对于单个的 SNP标记,它必须至少具有以下特征:(1)变异度高,在品种或品系中等 位基因频率接近;(2)品种间等位基因分布频率差异小;(3)杂合度大于 等于0.3。
在长期的育种工作中,研究者积累了大量的SNP标记,由于单个SNP 溯源标记是无法完成溯源的,因此,需要一组相互独立的SNP标记才能实现 溯源。以现有的13个已知SNP分子标记作为溯源标记组合,在经过高度选 择引进的猪群体中,使用该组标记进行溯源时,会出现某些个体不能区分的 情况。
另外,在长期的育种工作中,积累的大量的SNP标记往往集中分布在某 些染色体上,而另外部分染色体,如5号,6号,8号,14号,15号和18 号染色体等则缺乏SNP标记,容易导致分子标记间出现连锁现象,分子标记 之间不能互相独立,缩小溯源实验的检测范围,导致实际可检测范围小于预 期可检测范围。因此,为了满足对猪肉产品进行DNA溯源的要求,需要开 发其他染色体上用于溯源的SNP标记,提高溯源检测范围及准确度。
发明内容
本发明的目的在于提供一个猪6号染色体上用于溯源的SNP分子标记及 其应用,可以广泛用于猪肉产品DNA溯源及其检测,特别是用于猪肉产品 的安全性溯源,完善了现有标记组合,提高溯源检测准确度,扩大了溯源规 模。
为实现上述目的,本发明的技术方案如下:
猪6号染色体上用于溯源的SNP分子标记,该SNP分子标记的DNA序 列如SEQIDNO.1所示,共578bp,第232位碱基处有一个碱基替换,为232C 或232T。
进一步,所述的SNP分子标记由Ecol30I限制性内切酶识别。
所述的SNP分子标记是通过NCBI数据库序列比对获得的,并在包括10 个猪品种或品系的试验群体(共计245个个体)中,分析该SNP分子标记在 试验群体中等位基因的分布情况,发现该分子标记在不同的品种和品系中的 等位基因频率接近,多态性丰富,品种或品系间等位基因频率分布差异小, 初步判定该SNP标记可用作猪肉产品DNA溯源。
所述的用于猪肉DNA溯源的SNP分子标记的获得方法,采用PCR- Ecol30I-RFLP方法进行,包括以下步骤:
(1)在NCBI上搜索猪6号染色体的DNA序列信息,设计正、反向引物
分离猪6号染色体的DNA片段;
(2)利用NCBI数据库在线进行序列比对,寻找存在碱基替代的位点;
(3)PCR-Ecol30I-RFLP检测方法的建立及替换位点的检测;
(4)采集10个品种和品系的耳组织样,共计245个个体;
(5)检测SNP分子标记在试验群体的分布,统计分析,并进一步试验验 证是否适用于猪肉产品溯源中。
其中,上述获得SNP分子标记的方法中,所述的分离猪6号染色体上 DNA片段的正、反向引物序列如下:
正向引物:5’-CTTTACCGTTCTGCCCTTTC-3’(如SEQIDNO.2所示);
反向引物:5’-TCCTCTGCCTGCCTTTGA-3’(如SEQIDNO.3所示)。
在DNA溯源过程中,每增加一个溯源位点,就能进一步扩大检测样本 的数目,准确性也就更高,理想的SNP位点应该是均匀分布在猪不同的染色 体上,而现有的SNP位点中缺乏6号染色体上的溯源标记。
本发明通过NCBI数据库序列比对检测到猪6号染色体上的存在的SNP 分子标记,在包括10个猪品种或品系的试验群体中,分析该SNP分子标记 在试验群体中等位基因的分布情况,发现该分子标记在不同的品种或品系中 的等位基因频率接近,多态性丰富,品种或品系间等位基因频率分布差异小, 并且杂合度都大于0.3,初步判定该SNP标记可用作猪肉产品DNA溯源以及 猪肉产品的安全性溯源中。
为了完善已有SNP分子标记组合,提高溯源实验的检测准确度,扩大溯 源规模,将本发明获得的猪6号染色体上的新SNP分子标记位点与其它现有 已公开的SNP分子标记位点结合在一起(共计14个SNP位点)进行溯源实 验。
本发明在溯源实验中,增加商品猪来源,在屠宰场共挑选了来自不同猪 场的300个个体,从300个个体中随机挑选100个个体,检测该100个个体 中14个SNP位点的基因型,统计每个个体的基因型结果,发现100个个体 均拥有各自不同的基因型,能实现个体区分;同时,随机在这100个个体中 挑取20份肌肉样,同样检测统计14个SNP分子标记位点的基因型,然后跟 100个个体的基因型进行比对分析,发现均能找到与20份肌肉样品基因型完 全一致的个体,即通过溯源在100个个体中找到20份猪肌肉的来源个体,因 此判定本发明的该SNP分子标记可以用于猪肉产品溯源。
与现有技术相比,本发明的有益效果:
本发明的SNP分子标记位于猪的6号染色体上,能进一步完善标记的检 测覆盖面,提高溯源的准确性,并扩大猪的DNA溯源SNP分子标记的检测 范围。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。
实施例1分子标记的查找
(1)引物设计
以猪6号染色体的DNA序列(Genbank:FN673773)为模板,设计引物分 离猪的DNA片段(以一头申农猪的DNA为PCR扩增的模板),引物如下:
正向引物:5’-CTTTACCGTTCTGCCCTTTC-3’(如SEQIDNO.2所示);
反向引物:5’-TCCTCTGCCTGCCTTTGA-3’(如SEQIDNO.3所示)。
PCR反应总体积为20μl,其中猪基因组DNA约100ng,含1×buffer(Promega 公司),1.5mmol/LMgCl2,dNTP(上海生工生物公司)终浓度为150μmol/L, 引物终浓度为0.2μmol/L,2UTaqDNA聚合酶(Promega公司)。
PCR扩增:94℃4min,(94℃30s,60℃退火30s,72℃30s)循环30次, 最后72℃延伸10min。
PCR反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR反应产物用1%琼脂糖凝胶 电泳检测。
(2)克隆测序分析
将得到的猪6号染色体的DNA片段按照如下方法进行克隆。
PCR产物的纯化:在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶, 放入1.5mlEpendorff管中,用PCR产物纯化试剂盒(天根生化科技有限公司) 纯化。
连接反应:将纯化的PCR产物与pMD18-T载体(大连宝生物公司)连接, 连接反应总体积是10μl,其中包括5μlsolutionI(大连宝生物公司),0.5μl 的T载体(大连宝生物公司),2.5μl的纯化PCR产物,最后加入2μl灭菌水置4℃ 水浴过夜。
转化:无菌状态下取100-120μl感受态细胞(天根生化科技有限公司)于 1.5mlEpendorff管中,将5μl的连接产物加入混匀,在冰上放置30min,42℃热 激90s,其间不要摇动Ependorff管,取出后冰浴3-4min,加入400μl无抗生素 的LB液体培养基,37℃平放1h后倒置培养。
菌落PCR鉴定:经菌落PCR鉴定后的菌株在LB培养基37℃培养过夜, 随即挑取多个克隆子送到上海生工生物有限公司测序。
经测试,该经拼接后的猪DNA序列共578bp,位于猪的6号染色体上, 序列如SEQIDNO.1所示。经分析发现其第232碱基处存在一个碱基替换, 为232C或232T。通过分子生物学软件分析和NCBI数据库分析,发现该第 232碱基处的碱基替换导致Ecol30I-RFLP(RestrictionFragmentLength Polymorphism,即Ecol30I-RFLP位点)多态性。
(3)PCR-Ecol30I-RFLP检测方法的建立及替换位点的检测
酶切反应总体积10μl,其中1×buffer10μl,PCR产物3-5μl,限制性内切 酶Ecol30I为0.5μl(5U),用H2O补足10μl,37℃水浴4h,称取0.6g琼脂 糖溶于15.75mlDEPC(上海生工生物公司)处理水中,稍冷却后加入5ml 的5×甲醛凝胶电泳缓冲液和4.25ml的37%甲醛溶液,混匀制胶,电泳后检 测酶切结果。结果发现:SEQIDNO.1序列中C等位基因有363bp和215两 个片段,T等位基因有133bp,230bp和215bp三个片段,这两个等位基因可 组成三种基因型,CC,CT,TT,并且,在该SEQIDNO.1序列的第232位 碱基发生替换,碱基为C或T。
实施例2等位基因的分布情况
(1)试验群体的设计
试验组:采集皮特兰(21头)、申农(17头)、大白(43头)、大申 (52头)、长申(16头)、杜申(23头)、皮大申(11头)、长大申(25 头)、杜大申(17头)和杜皮大申(20头)个体的耳组织,提取DNA,共 计245个DNA样本。
试验群体的目的在于检测SNP标记在不同品种中的分布情况。
(2)基因检测
正向引物:5’-CTTTACCGTTCTGCCCTTTC-3’(如SEQIDNO.2所示);
反向引物:5’-TCCTCTGCCTGCCTTTGA-3’(如SEQIDNO.3所示)。
进行扩增(条件如实施例1),用相同的PCR-Ecol30I-RFLP方法检测试 验群体所有的个体基因型。
(3)统计分析
记录试验群体所有的个体基因型,并计算等位基因频率和杂合度,结果 如下表1。
表1
从表1可知:本发明的SNP分子标记在各品种中的等位基因频率接近, 多态性丰富;品种或品系间,等位基因频率C和T的分布差异小;所有品种 或者品系的杂合度H均大于0.3,因此初步认为该SNP标记可以用于猪肉产 品的DNA溯源和安全性溯源中。
实施例3SNP分子标记可用性溯源试验验证
本发明的SNP分子标记已被初步证实可用于溯源性标记中,为了确保在 溯源标记中的可用性,本发明又在不同地点重新取样,与现有的13个SNP 分子标记(如下述表2所示)结合使用(共14个SNP分子标记),进行可 用性溯源试验验证,同时,以仅用现有的13个SNP分子标记进行溯源试验 验证作对比例。
在复兴屠宰场随机采集猪个体的耳组织和肌肉样各100份(每个猪个体 均同时采集耳组织样和肌肉样),耳组织样编号E1-E100,肌肉样编号 M1-M100,分别提取肌肉样和耳组织样品的DNA备用。
在100个个体耳组织样中及随机挑选的20个肌肉样品中检测本发明的猪 的Ecol30ISNP位点与现有已公开的13个SNP位点的基因型(共计14个SNP 分子标记位点),统计每个个体的基因型结果。按照酶切带型,一条带记为 1,出现两条带记为2,三条带记为3。记录顺序按照表2位点顺序排列,如 ADAMTS-1基因的PvuⅡ酶识别的SNP分子标记位点为1,其基因型记录结 果就排在第一位,ADD1基因的Eam1104Ⅰ酶识别的SNP分子标记位点为2, 其基因型记录结果就排在第二位,依次类推,本申请的猪6号染色体上的 Ecol30ISNP分子标记位点排在最后,其基因型结果就表示为从左往右的第 14个数字,个体的基因型可以表示为:21232223331221。
表2
统计每个个体和肉样的14个SNP分子标记位点的基因型,100个个体 和20份肌肉样品的基因型统计对比结果分别如下表3和表4。
在表3中,82号个体和91号个体的基因型非常相似,两个个体的前13 位标记数值均一致,唯一的区别在于第14位标记不同。由此可见,仅利用现 有的13个SNP分子标记进行溯源时,会出现基因型重复的情况,第14位标 记为本发明提供的新SNP标记,说明加入本发明的SNP分子标记后,就可 以顺利将该两中基因型进行区分,本发明的新SNP分子标记的加入进一步完 善了溯源组合的溯源规模,提升了用SNP分子标记对猪肉DNA进行溯源的 准确性。
把20份肌肉样的14个SNP分子标记位点的基因型结果跟该100个个体 的基因型进行比对分析(比对结果参看表4),发现均能找到与该20份肌肉 样品基因型完全一致的个体,即通过溯源在100个个体中找到20份猪肌肉的 来源个体,实现肉样到个体的准确溯源。
结合表3和表4说明,利用14个SNP分子标记进行溯源试验,100个 个体、20份肌肉样用14个SNP分子标记检测均拥有不同的基因型,能实现 个体区分。
表3
表4
机译: 用于鉴别WooriHeukDon猪的SNP SNP制造商和使用该SNP SNP制造商的WooriHeukDon猪的鉴别方法
机译: 用于预测低出生体重猪大小的SNP SNP标记以及使用该SNP预测低出生体重猪大小的方法
机译: 用于预测低出生体重猪大小的SNP SNP标记以及使用该SNP预测低出生体重猪大小的方法