一种海葵溶细胞素Gigantoxin-4单克隆抗体及其制备与应用

摘要

本发明涉及医学生物工程技术领域，本发明提供了一种海葵溶细胞素Gigantoxin-4单克隆抗体、用于制备该单克隆抗体的多肽、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该单克隆抗体在用于检测Gigantoxin-4和中和Gigantoxin-4溶血作用中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及医学生物工程技术领域，具体涉及一种海葵溶细胞素Gigantoxin-4单克隆抗体、用于制备该单克隆抗体的多肽、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该单克隆抗体在用于检测Gigantoxin-4和中和Gigantoxin-4溶血作用中的应用。

背景技术

我国海域辽阔，海洋生物资源丰富，海上作业频繁。作业人员遭有毒海洋生物伤害的情况时有发生，有毒海葵蛰伤就是一种常见的海洋生物伤。

海葵的触手及身体均含有大量的刺细胞，每个刺细胞里都有一个特殊囊状的细胞器，名为刺丝囊，内储存着毒液，刺丝管盘曲在刺丝囊内，刺丝尖端为刺针，当受到机械或化学刺激时，会释放刺丝刺入猎物身体并通过刺丝管将毒素注入猎物体内。被海葵螫伤后，主要的症状是受伤局部痛、痒，继而出现红斑、丘疹、荨麻疹或疱疹样皮疹。全身症状有焦虑、情绪低落、恶心等，严重的出现肌肉、气管痉挛，心血管功能衰竭和休克等，甚至死亡。对于海葵蛰伤，目前没有较好的治疗方法，只能对对症治疗。

海葵毒素，根据分子量以及生物学功能的不同，可以将其分为神经毒素和溶细胞素两大类。Gigantoxin-4(GT-4)是一种海葵溶细胞素，它的成熟蛋白包含178个氨基酸，分子量为19kDa(GenBank:JQ353486.1)。GT-4可以特异性结合细胞膜上的鞘磷脂，进一步在膜上形成孔洞，从而导致细胞溶胀裂解。GT-4具有很高的溶血活性，半数溶血分数约40ng/ml。给予SD大鼠低剂量(30μg/kg)的GT-4后，心肌收缩力下降导致的全心衰竭是大鼠死亡的主要原因；而给予高剂量(60μg/kg)的GT-4后，15min内大鼠就因为呼吸衰竭而死亡。通过组织病理学检查及血液生化指标分析，GT-4能导致SD大鼠的多脏器损伤，如心、肺、肝、肾均出现不同程度的多灶性出血或坏死，尤以肺最为严重。结合体外实验结果，GT-4导致SD大鼠的一系列病理变化都是其溶血作用的后果，如果能够找到抑制其溶血作用的药物或抗体，将会是治疗海葵蛰伤的一种重要方法。(参见文献：HuB,GuoW,WangLH,WangJG,LiuXY,JiaoBH.Purificationandcharacterizationofgigantoxin-4,anewactinoporinfromtheseaanemoneStichodactylagigantea.IntJBiolSci.2011；7(6):729-39)。

目前尚无海葵溶细胞素Gigantoxin-4抗体的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种海葵溶细胞素Gigantoxin-4单克隆抗体、用于制备该单克隆抗体的多肽、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该单克隆抗体的应用。

本发明的第一方面，是提供了一种用于制备海葵溶细胞素Gigantoxin-4单克隆抗体的多肽，氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的。

AspValIleLeuProGluPheValProAsnAsnLys(SEQIDNO：1)

本发明的第二方面，是提供了一种海葵溶细胞素Gigantoxin-4单克隆抗体，是由保藏编号为CCTCCNo：C201473的杂交瘤细胞株分泌产生。

本发明的第三方面，是提供了一株杂交瘤细胞株，命名为14853-1hz-5/C377，它的保藏编号为CCTCCNo：C201473。

本发明的第四方面，是提供了一种海葵溶细胞素Gigantoxin-4单克隆抗体的制备方法，该方法的步骤如下：

a)合成氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的多肽；

b)将上述多肽作为免疫原免疫小鼠；

c)取免疫鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合；

d)经多轮筛选出合成多肽反应阳性的细胞克隆，作为抗GT-4蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株CCTCCNo：C201473；

e)通过在小鼠体内接种杂交瘤细胞生产腹水抗体，将腹水进行纯化，得到抗人GT-4的单克隆抗体。

本发明的第五方面，是提供了上述多肽、单克隆抗体、杂交瘤细胞在制备WesternBlot或免疫组化检测试剂或试剂盒中的应用，该WesternBlot或免疫组化检测试剂或试剂盒是用来检测Gigantoxin-4。

并进一步提供了上述多肽、单克隆抗体、杂交瘤细胞在制备中和Gigantoxin-4溶血作用的药物中的应用。

本发明提供了抗GT-4的单克隆抗体，该单克隆抗体识别位于GT-4氨基酸序列DVILPEFVPNNK的抗原表位。

本发明单克隆抗体的获得可采用本技术领域常规的方法，即通过在小鼠体内接种杂交瘤细胞并产生腹水抗体，取出腹水经纯化而得到。

本发明的杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNo：C201473，所制备的单克隆抗体是一种免疫球蛋白，可特异性结合GT-4蛋白。

本发明还提供单克隆抗体在WesternBlot检测GT-4中的应用。

本发明为海葵蛰伤的临床个性化治疗应用提供了新的思路。

附图说明

图1.是单克隆抗体WesternBlot检测GT-4。

其中，泳道1是GT-4，泳道2蛋白marker。

图2.单克隆抗体中和GT-4的溶血作用。

本发明的杂交瘤细胞株，命名为14853-1hz-5/C377，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏日期2014年6月19日，保藏编号CCTCCNo：C201473，保藏地址：中国武汉武汉大学。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1.抗GT-4的单克隆抗体的多肽序列选择和多肽的制备

依据GT-4活性位点及跨膜结构分析，选择SEQIDNO：1为抗原表位，委托艾比玛特生物医药(上海)有限公司合成多肽，序列如下：

AspValIleLeuProGluPheValProAsnAsnLys(SEQIDNO：1)

委托艾比玛特生物医药(上海)有限公司合成多肽将上述多肽连接到相应的载体上，制备并纯化抗原用于后续免疫反应。

实施例2.抗GT-4的单克隆抗体的制备和纯化

将实施例1中纯化的多肽抗原用于免疫，免疫8—12周龄的雌性BALB/c小鼠3只，采取小鼠快速免疫方式，初次免疫采用双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后双腿进行肌肉注射，每个区域大约用1/8的免疫原，将剩余免疫原的1/2进行腹腔注射。1周后加强免疫50μg，完全弗氏佐剂，腹腔注射。2周后加强免疫50μg，不完全弗氏佐剂(IFA)，腹腔注射。3周及以后，每周直接腹腔注射50μg加强免疫。

取ELISA检测效果最好的小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞(购自ATCC)以5:1比例，在PEG1500的作用下，进行融合。融合后的细胞经过适当稀释，分置于96孔培养板中培养，37℃、5％CO₂条件下培养，培养10—14天进行ELISA检测，挑选OD值高的孔中的细胞进行有限稀释法亚克隆。

具体方法如下：将有限稀释的细胞培养至96孔板中，待克隆生长到全孔的1/6时，标记单克隆及多克隆，对单克隆进行ELISA检测。ELISA检测后将OD值最高的单克隆再有限稀释接入96孔板中如上法所述再次亚克隆，此过程重复数次，直至阳性孔比率为100％，即认为此为单克隆，即建株成功的细胞株。

上述杂交瘤细胞株，命名为14853-1hz-5/C377，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏日期2014年6月19日，保藏编号CCTCCNo：C201473。

将筛选得到的阳性单克隆扩大培养，细胞数按10⁶/管进行冻存。同时收集细胞安排腹水制备。细胞株采用小鼠腹腔接种法制备腹水，10—14天收集腹水，ELISA检测腹水是否制备成功。纯化采用ProteinG亲和层析法。ProteinG亲和层析柱用PBS平衡柱子后取腹水过柱，然后用PBS洗柱至OD值接近零，以0.1mol/L的甘氨酸盐酸溶液洗脱，收集洗脱液，测定各收集管的OD值，计算抗体浓度。

实施例3.抗GT-4的单克隆抗体的鉴定

1.效价鉴定

将多肽抗原(4μg/ml)包被ELISA板，将纯化的抗GT-4单克隆抗体按1:6.25K，1:12.5K，1:25K，1:50K，1:100K，1:200K进行稀释，加入酶标板孔内，选用HIS抗体(HIS抗体1mg/ml1：8K用牛奶稀释)作为系统操作的阳性对照，5％牛奶作为阴性对照。反应后加入羊抗鼠IgG-HRP，显色。阳性判定标准：样品检测孔OD450与阴性对照孔OD450之比(P/N)≥2.1，结果表明抗体效价为200K(表1)。

表1抗体效价鉴定结果

6.25K 12.5K 25K 50K 100K 200K 阴性 阳性 效价 3.205 2.711 2.364 1.475 0.954 0.607 0.036 2.917 200k

2.亚型鉴定

采用购自Sigma公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒(MouseMonoclonalAntibodyIsotypingReagents)对本发明所得到的抗GT-4单克隆抗体进行亚型鉴定，其亚型鉴定结果表明，单克隆抗体为IgG2b亚型，结果见表2。

表2抗体亚型鉴定结果

样品稀释梯度 IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM IgA 1:10 0.323 0.321 2.167 0.579 0.374 0.363 1:50 0.3 0.296 1.997 0.318 0.304 0.288 1:250 0.229 0.272 1.44 0.228 0.244 0.193 15％HT 0.075 0.088 0.393 0.088 0.1 0.093 1:10/1％BSA 0.432 0.37 0.398 0.397 0.411 0.431

实施例4.GT-4的单克隆抗体的应用

1.抗GT-4单克隆抗体的WesternBlot检测应用

变性的GT-4蛋白样品进行SDS-PAGE电泳；通过电转仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜；含10％脱脂奶粉的TBST封闭1h，TBST洗三次，每次5min；抗体稀释液稀释抗GT-4单克隆抗体一抗(1μg/ml)，孵育过夜，TBST洗三次，每次5min；抗体稀释液稀释HRP标记的抗小鼠二抗，孵育1h，TBST洗三次，每次10min；用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒进行显色，在19kDa左右有特异性条带出现，扫描结果(图1)。

结果表明该单克隆抗体能较为特异地识别GT-4蛋白。

2.单克隆抗体中和GT-4溶血作用的应用

取1ml成熟人血，用PBS漂洗，3000g离心5min，弃上清，再用PBS漂洗2—3次至上清清亮，弃上清，然后将红细胞与PBS按1:50稀释，即制备成2％红细胞悬液。取红细胞悬液0.5mL，然后加入一定浓度的样品，反应总体积1.5mL。每组另设阴性对照(不加毒素)、阳性对照(0.5％TritonX-100)。加样后在37℃振荡孵育30min，然后3000g离心5min，取上清在96孔板中检测405nm吸光度值(重复3次)。以下面公式计算溶血分数：溶血分数＝[(样品管吸光度值-阴性对照管吸光度值)/(阳性对照管吸光度值-阴性对照管吸光度值]×100％。海葵溶细胞素GT-4浓度为40ng/ml时，即可引起100％的红细胞溶血。

将抗体(1mg/ml)按1:100000、1:10000、1:5000、1:1000稀释成不同浓度，取0.1ml与GT-4(40ng/ml)37℃孵育5分钟，然后依上述方法进行溶血活性测定，结果表明抗体可以很好的中和GT-4的溶血作用(图2)，可以为临床上治疗海葵蛰伤引起的溶血及并发症提供新思路。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。