一种细胞保存液及其在保护巨核祖细胞活力中的应用

摘要

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种细胞保存液及其在保护巨核祖细胞活力中的应用。本发明提供的细胞保存液包括水、叶酸、白蛋白、黄芪提取物和氯化钠。该保存液能够在保存过程中提供给细胞相应的营养，从而维持细胞的活性，使细胞不易聚集或死亡。本发明实施例表明，采用本发明提供更多保存液保存巨核祖细胞，在24h内，细胞活力可维持在90％左右，显著优于采用生理盐水，或生理盐水与白蛋白混合的对照组，证明本发明提供的保存液能够起到良好的保护巨核祖细胞活力的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种细胞保存液及其在保护巨核祖 细胞活力中的应用。

背景技术

巨核细胞祖细胞(megakaryocyteprogenitorcell)是一种使人们产生巨核细 胞的细胞，它是从骨髓祖(CFU-GEMM)而得，简称巨核祖细胞。巨核祖细胞 存在于IL-6R-细胞群中，而CD34+细胞可分为两个细胞亚群，表达IL-6R和不 表达IL-6R，IL-6R+细胞能被刺激形成粒-巨噬细胞、淋巴细胞和粒细胞，而 IL-6R-细胞当被给予IL-6/sIL-6R时可形成红系及巨核系细胞。造血干细胞首先 分化生成巨核系祖细胞，也称巨核系集落形成单位(colonyforming unit-megakaryocyte,CFU-Meg)。巨核系祖细胞分化成为成熟的巨核细胞后， 其边缘部分破裂脱落，形成血小板，每个巨核细胞能生成1000-6000个左右的 血小板；巨核细胞虽然在骨髓的造血细胞中为数最少，仅占骨髓有核细胞总 数的0.05％，但其产生的血小板却对机体的止血功能极为重要。

如今恶性肿瘤严重危害人类健康的主要疾病之一，目前主要是通过手术 治疗并结合放化疗。当患者在接受高剂量放化疗后，骨髓造血功能低下，常 会出现血小板减少，严重时会造成患者出血死亡。临床上常采用输注血小板， 但血小板来源有限，存活期短，体外易失活，且反复输注血小板易导致输注 无效并增加输血传播疾病的危险。

1997年，Bertolini等从外周血中分离CD34+，体外诱导扩增巨核细胞7 天，用于患者血小板恢复。结果显示，体外诱导的巨核细胞可替代血小板输 入，或减少血小板输入次数。2000年，Paquette等将体外动员的外周血细胞 经体外诱导扩增巨核细胞9天后，用于改善大剂量化疗的乳腺癌病人中性粒 细胞减少、血小板减少和贫血症状。VandenOudenrijn等对外周血、骨髓、脐 血来源的CD34+细胞体外扩增进行比较，发现脐血来源的CD34+具有更强的巨 核细胞扩增能力。由于脐血造血干细胞移植后血小板的恢复较外周血、骨髓 慢，因此采用体外诱导、扩增巨核祖细胞和巨核细胞，然后输注患者体内， 进一步发育成血小板，缩短血小板的恢复期。将巨核祖细胞用于恶性肿瘤的 治疗是目前的研究热点，因此，如何保存巨核祖细胞的使其活性得到保证， 细胞不受到损伤称为了目前研究的又一难题。

现有技术只采用生理盐水保存巨核祖细胞，进行普通保温箱保存运输， 其缺点之一在于只用生理盐水保存巨核祖细胞，在保存或运输过程中不能给 细胞提供相应的营养保证，细胞活性维持时间短，并且细胞容易聚集在一起。

因此，进一步开发适用于巨核祖细胞的保存液十分必要。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种细胞保存液及其在保 护巨核祖细胞活力中的应用。本发明提供的细胞保存液能够有效保护巨核祖 细胞的活力。

本发明提供的细胞保存液包括水、叶酸、白蛋白、黄芪提取物和氯化钠。

叶酸(folicacid)也叫维生素B9，是一种水溶性维生素，是集体细胞生 长和繁殖所必须的物质，有促进骨髓中幼细胞成熟的作用。

白蛋白(又称清蛋白，albumin，Alb)是血浆中含量最多、分子最小、溶 解度大、功能较多的一种蛋白质，具有保护血细胞保护和调节凝血的功能。

黄芪提取物中包括黄芪甲苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素，具有良好的抗氧 化作用。

氯化钠用于维持细胞渗透压的平衡。

本发明利用水、叶酸、白蛋白、黄芪提取物和氯化钠配制成为细胞保存 液，能够在保存过程中提供给细胞相应的营养，从而维持细胞的活性，使细 胞不易聚集或死亡。

本发明所采用的黄芪提取物可为自制也可为市场购得，本发明对此不做 限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。

在本发明提供的实施例中，黄芪提取物中包括黄芪甲苷、毛蕊异黄酮和 芒柄花素。

在本发明提供的实施例中，黄芪甲苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素的质量比 为1:1:1。

在本发明的实施例中，黄芪提取物中黄芪甲苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素 的质量之和在黄芪提取物中的质量分数不低于90％。

在本发明的实施例中，白蛋白为人血白蛋白。

虽然白蛋白也能起到一定的保护细胞的作用，但是实验结果表明，仅采 用生理盐水和白蛋白对细胞进行保护的效果远不及本发明提供的保护液。

在本发明提供的实施例中，叶酸、白蛋白、黄芪提取物和氯化钠的质量 比为(0.005～0.01)：(2～4)：(5×10^-5～10^-4)：(0.54～0.63)。

在一些实施例中，保存液中各组分的浓度为：叶酸0.0625mg/mL～0.125 mg/mL；白蛋白5mg/mL～50mg/mL、黄芪提取物0.625μg/mL～1.25μg/mL； 氯化钠7.3125mg/mL。

在一些实施例中，保存液中各组分的浓度为：叶酸0.09375mg/mL；白蛋 白27.5mg/mL、黄芪提取物0.9375μg/mL；氯化钠7.3125mg/mL。

在一些实施例中，保存液中各组分的浓度为：叶酸0.0625mg/mL；白蛋 白5mg/mL、黄芪提取物0.625μg/mL；氯化钠7.3125mg/mL。

在一些实施例中，保存液中各组分的浓度为：叶酸0.125mg/mL；白蛋白 50mg/mL、黄芪提取物1.25μg/mL；氯化钠7.3125mg/mL。

本发明实施例表明，采用本发明提供更多保存液保存巨核祖细胞，在24h 内，细胞活力可维持在80％左右，显著优于采用生理盐水，或生理盐水与白 蛋白混合的对照组，证明本发明提供的保存液能够起到良好的保护巨核祖细 胞活力的作用。

本发明提供的细胞保存液在保护巨核祖细胞活力中的应用。

本发明提供的细胞保存液的制备方法为：将叶酸、白蛋白、黄芪提取物 依次加入生理盐水。

具体的，本发明提供的细胞保存液的制备方法包括：将叶酸溶解于生理 盐水中，使终浓度为0.09375mg/mL后，加入白蛋白至终浓度为5mg/mL ～50mg/mL；然后加入黄芪提取物至终浓度为0.625μg/mL～1.25μg/mL。

本发明提供的细胞保存液包括水、叶酸、白蛋白、黄芪提取物和氯化钠。 该保存液能够在保存过程中提供给细胞相应的营养，从而维持细胞的活性， 使细胞不易聚集或死亡。本发明实施例表明，采用本发明提供更多保存液保 存巨核祖细胞，在24h内，细胞活力可维持在80％左右，显著优于采用生理 盐水，或生理盐水与白蛋白混合的对照组，证明本发明提供的保存液能够起 到良好的保护巨核祖细胞活力的作用。

具体实施方式

本发明提供了一种细胞保存液及其在保护巨核祖细胞活力中的应用，本 领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的 是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被 视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述， 相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进 行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试剂和仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中：

黄芪提取物购自暨南大学；人血白蛋白购自上海莱士血液制品股份有限 公司；注射用生理盐水、注射用叶酸购自北京双鹤药业股份有限公司、山东 罗欣药业集团股份有限公司。

巨核祖细胞分离自脐血，分离方法为：从人脐血中分离单个核细胞，分 选CD34+细胞。分离人骨髓间充质干细胞，并将分离得到的间充质干细胞接 种到完全培养基中培养。待骨髓间充质干细胞生长到大量汇合时，辐照细胞， 将分选的CD34+细胞用含TPO的无血清培养基重悬并接种到被照射过的骨髓 间充质干细胞上进行诱导分化扩增培养巨核祖细胞，培养7天进行收集。将收 集到的巨核祖细胞用本发明方法配制的保存液进行保存运输。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

向浓度为0.9％的注射用生理盐水中加入注射用叶酸，终浓度为 0.0625mg/ml；

向其中人血白蛋白使白蛋白的终浓度为5mg/ml；

加入黄芪提取物混合物(黄芪甲苷：毛蕊异黄酮：芒柄花素＝1：1：1) 于上述混合液中，是黄芪提取物的终浓度为0.625μg/ml。

实施例2

向浓度为0.9％的注射用生理盐水中加入注射用叶酸，终浓度为 0.125mg/ml；

向其中人血白蛋白使白蛋白的终浓度为50mg/ml；

加入黄芪提取物混合物(黄芪甲苷：毛蕊异黄酮：芒柄花素＝1：1：1) 于上述混合液中，是黄芪提取物的终浓度为1.25μg/ml。

实施例3

向浓度为0.9％的注射用生理盐水中加入注射用叶酸，终浓度为0.09375 mg/ml；

向其中人血白蛋白使白蛋白的终浓度为27.5mg/ml；

加入黄芪提取物混合物(黄芪甲苷：毛蕊异黄酮：芒柄花素＝1：1：1) 于上述混合液中，是黄芪提取物的终浓度为0.9375μg/ml。

对比例1

向浓度为0.9％的注射用生理盐水中加入人血白蛋白使白蛋白的终浓度为 27.5mg/ml。

实施例4

分别以实施例1～3制得保存液为实验组1～3，以对比例1制得的保存液为 阳性对照2，以生理盐水为保存液作为阳性对照1。

将上述溶液作为巨核祖细胞的保存液，细胞保存的密度为3～6×10⁶。

4℃条件下保存24h，分别于0h、3h、8h、12h、24h考察细胞存活率。结 果如表1：

表1：巨核祖细胞的存活率

注：*示与对照组1相比有显著性差异(p<0.05)；**示与对照组1相比有极显著差异(p<0.01)；

#示与对照组2相比有显著性差异(p<0.05)；##示与对照组2相比有极显著差异(p<0.01)；

结果显示，本发明提供的细胞保存液能够在24小时内将巨核祖细胞的活 力维持在90％左右，显著优于采用生理盐水或对比例1制得的保存液的保存 效果。说明本发明提供的保存液能够应用于巨核细胞的保存或运输。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技 术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。