一种壳聚糖基载药温敏水凝胶及其在用于制备动物疫苗和缓控释药物中的应用

摘要

本发明提供了一种壳聚糖基载药温敏水凝胶及其在用于制备动物疫苗和缓控释药物中的应用，所述的壳聚糖基载药温敏水凝胶包括有壳聚糖、聚乙烯醇和甘油磷酸钠，此水凝胶体系具有温敏性，可用于药物控释系统；本发明利用壳聚糖温敏凝胶的温敏性及药物控释性能，以及聚乙烯醇的加入可以维持温敏凝胶的原有形状，可以使温敏凝胶具有缓释功能可将其应用于对动物疫苗的缓释方向上，使疫苗可在一定时间内持续释放，达到更好的防疫效果。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药工程技术领域，具体涉及一种壳聚糖基载药温敏水凝胶及其 在用于制备动物疫苗和缓控释药物中的应用。

背景技术

壳聚糖(chitosan,CS)是甲壳素的脱乙酞基产物，是一种天然可生物降解的聚阳离 子多糖。壳聚糖具有无毒、良好的生物相容性、可生物降解性等优点,在生物医学及制 药等方面的应用极其广泛。

CS分子内富含氨基和羟基，可形成氢键，因此CS不溶于水和有机溶剂，但可 溶于(稀)酸溶液中。GP为弱碱性化合物(pKa6.34)，含羟基和磷酸根负离子，是对 人体安全的双官能团阴离子偶联剂，可使壳聚糖溶液凝胶化，形成三维凝胶网络。在 CS/GPS体系中主要存在着静电作用平衡、氢键作用平衡以及CS的疏水作用。这 些相互作用力的平衡会随温度的改变而改变，CS/GPS水凝胶体系从而表现出温度敏 感性。但是壳聚糖和甘油磷酸钠二者形成的温敏水凝胶机械性能较差，难以维持其有 效形状，因此极大的影响了其应用。

发明内容

本发明提供了一种壳聚糖基载药温敏水凝胶及其在用于制备动物疫苗和缓控释 药物中的应用，本发明在壳聚糖/甘油磷酸盐的配方基础上加入了聚乙烯醇，可有效 提高温敏凝胶的机械强度，有助于温敏凝胶注射到皮下后可有效维持原有形状。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种壳聚糖基载药温敏水凝胶，它通过以下制备方法获得：

(1)配制母液：用乙酸溶解壳聚糖制得浓度为2％-6％的壳聚糖溶液，用水溶解 聚乙烯醇制得浓度为1％-4％聚乙烯醇溶液，用水加热溶解β-甘油磷酸钠制得浓度为 50％-85％的β-甘油磷酸钠溶液，所述浓度均为质量体积比；

(2)在室温搅拌下将所述β-甘油磷酸钠溶液缓慢滴入所述聚乙烯醇溶液中；搅 拌均匀得到聚乙烯醇/β-甘油磷酸钠混合溶液；

(3)将所述聚乙烯醇/β-甘油磷酸钠混合溶液与所述壳聚糖溶液进行混合得到所 述壳聚糖基载药温敏水凝胶。

进一步的：所述温敏水凝胶含有2.0％壳聚糖、1％聚乙烯醇和7.8％β-甘油磷酸钠， 浓度为质量体积比浓度。

进一步的：所述步骤(1)中溶解β-甘油磷酸钠的加热温度为80-120℃。

进一步的：所述步骤(2)中β-甘油磷酸钠与聚乙烯醇的质量比为5-10：1。

进一步的：所述步骤(3)中聚乙烯醇与壳聚糖的质量比为1：2。

进一步的：所述步骤(3)中使用双联管混合，一管为聚乙烯醇/β-甘油磷酸钠混 合溶液，另外一管为壳聚糖溶液，在临用前将二管溶液进行混合。

本发明还提供了所述的壳聚糖基载药温敏水凝胶在用于制备动物疫苗中的应用。

进一步的：所述动物疫苗包括鸡新城疫苗、鸡传染性法氏囊疫苗和猪瘟活细胞疫 苗。

本发明还提供了所述的壳聚糖基载药温敏水凝胶在用于制备缓控释药物中的应 用。

进一步的：所述缓控释药物包括醋酸氯己定和克霉唑。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明所述壳聚糖基载药温敏水 凝胶包括壳聚糖、聚乙烯醇和β-甘油磷酸钠，此水凝胶体系具有温敏性，可用于药物 控释系统；本发明利用壳聚糖温敏凝胶的温敏性及药物控释性能，以及聚乙烯醇的加 入可以有效增强壳聚糖温敏凝胶的机械强度，保证注射到体内后可维持半固体的形 态；而且可以使温敏凝胶具有缓释功能，可将其应用于对动物疫苗的缓释方向上，使 疫苗可在一定时间内持续释放，达到更好的防疫效果。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加 清楚。

附图说明

图1是壳聚糖基温敏水凝胶膜片上人脐静脉血管内皮细胞生长状况显微镜观察 (100×)，A、B分别是在第3，5天对照组人脐静脉血管内皮细胞的显微镜观察 (100×)，C、D分别是在第3，5天对实验组人脐静脉血管内皮细胞的显微镜观察 (100×)。

图2是壳聚糖基温敏水凝胶膜片上人脐静脉血管内皮细胞相容性的MTT分析。

图3是壳聚糖基温敏水凝胶膜片浸提液培养L929细胞显微镜观察(100×)；A、 B分别是在第3，5天对照组L929细胞的显微镜观察(100×)；C、D分别是在第3， 5天对实验组L929细胞的显微镜观察(100×)。

图4是壳聚糖基温敏水凝胶膜片浸提液培养L929细胞MTT结果。

图5是醋酸氯己定溶液的标准曲线。

图6是克霉唑溶液的标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1：壳聚糖基温敏水凝胶及其制备方法

所述壳聚糖基温敏水凝胶的制备方法包括以下步骤(10ml体系)：

(1)取5ml0.2M乙酸溶解0.2g壳聚糖(质量体积比浓度为4％)，4ml超纯水 溶解聚0.1g乙烯醇(质量体积比浓度为2.5％)，1ml超纯水加热溶解0.78gβ-甘油磷 酸钠(质量体积比浓度为78％)；所述质量体积比中的质量单位为g，体积的单位为 ml；

(2)在室温搅拌下将β-甘油磷酸钠(GP)溶液缓慢滴入聚乙烯醇(PGA)溶液 中；搅拌均匀得到聚乙烯醇/β-甘油磷酸钠混合溶液(PGA/GP溶液)；

(3)将所述聚乙烯醇/β-甘油磷酸钠混合溶液与所述壳聚糖溶液进行混合得到所 述壳聚糖基载药温敏水凝胶。可以使用双联管进行混合，一管为聚乙烯醇/β-甘油磷酸 钠混合溶液，另外一管为壳聚糖溶液，可在临用前将二管溶液进行混合；如不使用双 联管，则将聚乙烯醇/β-甘油磷酸钠混合液(PGA/GP混合溶液)在搅拌下缓慢滴入壳 聚糖溶液中，搅拌均匀得到CS/PGA/GP混合凝胶，低温(4-15℃)保存。

最终制得的壳聚糖基温敏水凝胶含有以下成分：以质量体积比计，2.0％的壳聚糖 +1％聚乙烯醇+7.8％β-甘油磷酸钠。

制得的所述壳聚糖基载药温敏水凝胶在室温条件下流动性好并且具有热致成胶 性，在37℃环境下，溶胶很快转变成流动性能较差的凝胶，成胶时间可以控制在 20s-5min不等。

实施例2：壳聚糖基温敏水凝胶的细胞相容性实验

首先壳聚糖基温敏水凝胶胶液铺膜。然后将壳聚糖基温敏水凝胶膜片切成直径为 1.1cm的圆形膜片。对圆形膜片依次进行25％、50％、75％酒精浸泡，每次2-3h。最 后一次用75％无菌酒精浸泡1-2d。然后再将膜片转移到无菌的D-Hanks缓冲液中浸 泡，每次10h左右，至少更换缓冲液4-5次。最后放在D-Hanks缓冲液中浸泡放置待 用。

向48孔细胞培养板中加入含10％胎牛血清(FBS)的100微升DMEM培养基，然 后将对应膜片放在预定培养孔中，每组每时间点5个平行样。膜片放置完成后，取细 胞培养瓶，对L929细胞进行清洗、换液、消化处理，使用血球计数板计算细胞密度， 通过添加培养基，将细胞密度控制在5×10⁵左右。取200微升细胞悬液，加入到预定 培养孔中。阴性对照为同体积纯DMEM培养基。将培养板放在5％CO₂，37℃细胞培 养箱中恒温培养，在第3、5天时分别对细胞状态进行观察、拍照。并在拍照之后， 用0.25％胰蛋白酶对膜片上的血管内皮细胞进行消化处理，将消化的细胞转移到96 孔细胞培养板，静置12h待细胞贴壁后，每孔加入5mg/ml的MTT20μL，常规孵育 4h。吸弃培养液，加入二甲基亚砜150μL，37℃保温10min，振荡器上混匀40s，用 酶标仪(490nm波长处)测各孔的OD值。

实验结果如图1所示，对照组和实验组人脐静脉血管内皮细胞均为鹅卵石形状。 实验组细胞与对照组没有显著差异，在培养第5天时形成致密单层。但是通过MTT结 果(图2)分析可看出，实验组血管内皮细胞数量略高于对照组，但没有显著性差异 (P>0.05)。因此可知壳聚糖基温敏水凝胶膜片和人脐静脉血管内皮细胞有较好的细胞 相容性，可以在一定程度上促进血管内皮细胞的生长。

实施例3：壳聚糖基温敏水凝胶的细胞毒性实验

取对数生长期的小鼠成纤维细胞L929,0.25％胰酶消化后调节细胞浓度成为 1×10⁴/ml，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板，每孔加200μL细胞悬液。在CO₂培 养箱(37℃，5％CO₂)中预培养24h后，吸弃原培养液，换成已经浸提壳聚糖基温 敏水凝胶膜片超过24h的DMEM培养基，对照组加入正常的培养基，各组设立12个 平行样，将培养板置于37℃，5％CO₂培养箱中继续培养。分别于第3天和第5天取 出培养板，显微镜下观察细胞状态，每孔加入5mg/ml的MTT20μL，常规孵育4h。 吸弃培养液，加入二甲基亚砜150μL，37℃保温10min，振荡器上混匀40s，用酶标 仪(490nm波长处)测各孔的OD值。

按下式计算细胞的相对增值率(relativegrowthrate，RGH)：

细胞毒性分级：0级：RGH≧100％；1级：75％～95％；2级：50％～74％；

3级：25％～49％；4级1％～24％；5级：0％

评价标准：

(1)实验结果级为合格；

(2)实验结果为2级，应结合细胞形态分析，综合评价；

(3)实验结果为3-5级为不合格。

从图3可以看到实验组和对照组的L929细胞生长没有显著差异，细胞生长状况 良好，为典型的漩涡状排列，这和图2的MTT结果相吻合。从图4可以看出，实验 组细胞OD值略高于对照组，RGH>＝100％，因此判定温敏水凝胶细胞毒性为0级。

实施例4：壳聚糖基载药温敏水凝胶对猪瘟细胞活疫苗效价的影响评价

通过壳聚糖温敏凝胶的包载，可有效延长猪瘟细胞活疫苗的免疫时间，增强免疫 效果，且避免了繁琐的多次免疫。猪瘟细胞活疫苗中猪瘟病毒的活力及效价对环境条 件十分敏感。本实施例实验了壳聚糖温敏凝胶包载技术对猪瘟细胞活疫苗包载前后的 效价影响，以及检测了壳聚糖温敏凝胶包载前后动物免疫时间的延长效果。

1.试验材料

1.1疫苗

猪瘟活细胞疫苗,规格均为每瓶60头份,有效期18个月。

1.2疫苗稀释液

生理盐水,规格为每瓶100mL。

1.3双抗青霉素钠,规格每瓶80万IU；硫酸链霉素,规格每瓶1g。

1.4兔子选择体重为2-2.5kg健康白兔,连续观察和测温3d,无异常者用于试验。

2.试验方法及判定标准

按云南省生物制药厂监察室提供的猪瘟细胞活疫苗效力检验方法和判定标准进 行。

2.1.试验方法

按标签注明每瓶60头份用生理盐水以无菌方法将各批疫苗每头份各稀释为750、 375和180倍三个梯度,各个梯度药液中,1mL均含青霉素和链霉素各1000IU,置冰 箱内感作40min,试验各批号的每一梯度药液接种家兔2只,每只兔耳静脉注射1mL； 另取本实验室的同一批号疫苗和生理盐水作对照组,每个对照组注射家兔2只,每只 1mL,接种家兔48h内,每天上、下午各测体温1次,48h后,每6h测体温1次,连续120h。

2.2家兔接种疫苗后,体温反应标准。

2.2.1定型热反应(﹢﹢)潜伏期48-96h,体温上升呈明显曲线,至少有3个温差超过 常温1℃以上,并稽留18-36h。

2.2.2轻热反应(﹢)潜伏期48-96h,体温上升呈明显曲线,至少有2个温差超过常温 0.5℃,并稽留12-36h。

2.2.3可疑反应(±)潜伏期48-96h,体温曲线起伏不定,稽留不到12h或潜伏期在 24h以上,不足48h或96h至120h出现热反应。

2.2.4.无反应(-)体温正常。

2.3.疫苗合格

注射后,当2只家兔均呈定型热反应(﹢﹢)或1只家兔呈(﹢﹢)、另1只呈(﹢)时。 3疫苗效价测定结果详见表1。

表1猪瘟疫苗效价测定结果

本发明所述壳聚糖基载药温敏水凝胶包载疫苗后将包载体注射至动物体内后，由 于感受体温作用，可由液态转变为半固体的凝胶态，从而实现对疫苗的缓释。由上述 实验可知，猪瘟活细胞疫苗经过包载和未包载条件下注射至动物体内，经过体温变化 观察可知，在96h内六组疫苗都可达到750分之一头份的效价标准，因此判断疫苗包 载前后都是合格的。而当观察期延长至192h时，疫苗未包载组注射的动物已观察不 到温度变化，而疫苗包载组注射的动物仍维持疫苗合格对应的温度变化。由此可得结 论，壳聚糖温敏凝胶包载疫苗后，不会影响疫苗的效价表达，并可以在一定时间内延 长疫苗的持续免疫功能。

实施例5、紫外分光光度法测定CS/CMCS/GPS温敏凝胶对醋酸氯己定的体外释 放测定实验

1、醋酸氯己定溶液标准曲线的制备

精密称取醋酸氯己定对照品0.25g，置250m1容量瓶中，加pH7.4磷酸缓冲液振 摇使其溶解^[11]，滴加至刻度，摇匀，精密量取稀释液20m1用缓冲溶液稀释到1000m1， 精密量取稀释液10m1，分别移到7个50m1试管中，分别向7个试管里面依次5、8、 10、12、15、18、20m1加缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，在缓冲溶液作为空白对照的 情况下，在紫外分光光度计下、259nm波长处测定溶液的吸光度，醋酸氯己定浓度 C(ug/m1)与吸收度A得标准曲线，得醋酸氯己定吸光度与浓度的线性回归方程 y＝0.042x(如图5)。

2、温敏凝胶对醋酸氯己定的体外缓释实验

准确量取空白溶胶3ml置透析袋中，封口，于250mlPBS(pH7.4)锥形瓶中,160rpm、 37±0.5℃震荡。准确量取1.0g醋酸氯己定溶解于温敏凝胶中，把成胶后的温敏性凝 胶转移到已经处理好的透析袋中，封口，于250mlPBS(pH7.4)锥形瓶中,160rpm、 37±0.5℃震荡。分别在1、4、16、32、48、72、96、144、192h吸取10.0ml缓冲液 于50ml容量瓶中,根据醋酸氯己定工作曲线计算其含量，并向容器中加入同样体积的 缓冲液保证溶液体积不改变(并在每次加完后用pH7.4PBS定容到250ml的最初体 积)。以PBS作对照,于259nm测其吸光度，计算回收率。

表2所示为醋酸氯己定的吸光度对应的浓度测量值，在259nm波长处测定吸收 度,根据标准曲线的回归方程y＝0.042x得到吸光度对应的浓度做出工作曲线。由表2 结果可看出，在最初的1到192小时内，温敏凝胶对醋酸氯己定有明显的药物释控效 果，且释放速度比较平稳，没有明显的药物突释现象。

表2温敏凝胶对醋酸氯己定的药物缓控实验结果

时间(h) 1 4 16 32 48 72 96 144 192 吸光度 0.086 0.125 0.188 0.271 0.402 0.734 1.241 1.810 2.154 浓度(ug/m1) 2.05 2.98 4.48 6.45 9.57 17.5 29.5 42.9 51.3

实施例6、紫外分光光度法测定CS/CMCS/GPS温敏凝胶对克霉唑的体外释放实 验

1、克霉唑溶液标准曲线的制备

精密称取克霉唑0.4g，置100m1容量瓶中，加pH7.4磷酸缓冲液振摇使溶解， 滴加至刻度，摇匀，精密量取稀释液10m1用缓冲溶液稀释到100m1，精密量取稀释 液10m1，分别移到7个50m1试管中，分别向7个试管里面依次0、2、5、10、15、 18、25m1加缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，在缓冲溶液作为空白对照的前提下，在 273.6nm波长处测定吸收度克霉唑浓度C(ug/m1)与吸收度A，得吸光度与浓度的线 性回归方程y＝0.816x(如图6)。

4、温敏凝胶对克霉唑体外缓释实验

准确量取空白溶胶3ml置透析袋中,封口，于250mlPBS(pH7.4)锥形瓶中,160rpm、 37±0.5℃震荡。准确量取1.0g克霉唑溶解于壳聚糖/羧甲基壳聚糖/甘油磷酸钠 (CS/CMCS/GPS)体系凝胶，把成胶后的温敏性凝胶转移到已经处理好的透析袋中，封 口，于250mlPBS(pH7.4)锥形瓶中,160rpm、37±0.5℃震荡。分别在1、4、16、32、 48、72、96、144、192，吸取10.0ml缓冲液于50ml容量瓶中,根据克霉唑工作曲线 计算其含量，并向容器中加入同样体积的缓冲液保证溶液体积不改变(并在每次加完 后用pH7.4PBS定容到250ml的最初体积。以PBS作对照,于273.6nm测其吸光度, 计算回收率分别为在同一天内在不同时间的情况下测定的药物的浓度，画出工作曲 线。

表3所示为克霉唑的吸光度对应的浓度测量值，表3实验结果表明，在最初的1 到192小时内，温敏凝胶对克霉唑也有叫明显的药物释控效果，释放速度比较平稳， 没有明显的药物突释现象。

表3温敏凝胶对克霉唑的药物缓控实验结果

时间(h) 1 4 16 32 48 72 96 144 192 吸光度 0.050 0.068 0.090 0.127 0.164 0.183 0.215 0.331 0.414 浓度(ug/m1) 0.06 0.08 0.11 0.16 0.20 0.23 0.26 0.41 0.51

以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述 实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对 前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换； 而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案 范围。